阿霉素诱导Egr-1启动子调控GM-CSF基因表达的实验研究

本研究探讨阿霉素(ADM)诱导Egr-1启动子调控造血生长因子基因表达对化疗后造血损伤的修复作用。构建携带Egr-1调控序列启动的GM-CSF和eGFP双顺反子基因pCIneo真核表达载体(Egr-EG);通过脂质体转染骨髓基质细胞系HFCL,挑出G418抗性的阳性克隆(HFCL/EG);采用流式细胞仪和倒置荧光显微镜观察eGFP绿色荧光表达的阳性细胞;在加入ADM的HFCL/EG细胞培养体系中,用ELISA方法检测GM-CSF的含量;将从脐血中分离的单个核细胞接种于含有ADM后的HFCL/EG上清培养液中,观察其对CFU-GM的增殖作用;采用活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸鉴定化疗通过活性氧诱导Egr-1启动子CArG序列调控下游基因表达的特异性。结果表明:成功地构建了Egr-1调控序列启动的双顺反子基因表达载体(Egr-EG);在HFCL/EG细胞中有外源性基因eGFP和GM-CSF的表达,在加入ADM后HFCL/EG细胞培养上清液中GM-CSF含量和CFU-GM形成数量较未加ADM组明显增高(p<0.01);在ADM处理的HFCL/EG细胞中,N-乙酰半胱氨酸明显降低GM-CSF水平。结论:ADM诱导Egr-1启动子调控的造血生长因子基因表达对化疗后的造血损伤具有一定的修复作用。

氟脲嘧啶促进Egr-1启动子上调人骨髓基质细胞GM-CSF的表达

目的:探索氟脲嘧啶(5-FU)对Egr-1启动子上调人骨髓基质细胞造血因子GM-CSF表达的促进作用,以寻找促进化疗所致造血损伤恢复的方法。方法:构建携带Egr-1调控序列启动的GM-CSF和EGFP双顺反子基因的重组真核表达载体(pCIneo-Egr-1-EGFP-IRES-GM-CSF,Egr-EG),通过脂质体转染骨髓基质细胞系HFCL,挑出G418抗性的阳性克隆(HFCL/EG)。采用RT-PCR检测5-FU处理的HFCL/EG细胞GM-CSFmRNA表达,用FACS和倒置荧光显微镜观察5-FU诱导HFCL/EG细胞EGFP表达的阳性细胞。在加入5-FU的HFCL/EG细胞培养体系中,用ELISA方法检测GM-CSF的含量;将从脐血中分离的单个核细胞接种于5-FU处理后的HFCL/EG培养上清液培养基中,观察其对GM-CFU的增殖作用;采用活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸检测5-FU通过活性氧诱导Egr-1启动子CArG序列调控下游基因表达的特异性。结果:构建了Egr-1调控序列启动的双顺反子基因表达载体Egr-EG,获得其转染细胞HFCL/EG。在5-FU处理的HFCL/EG细胞中,RT-PCR显示其GM-CSFmRNA表达增强,流式细胞术证实有EGFP的显著表达。在5-FU处理后,HFCL/EG细胞培养上清液GM-CSF含量和GM-CFU形成数量分别较未处理细胞能明显增高(P<0.01);在5-FU处理的HFCL/EG细胞中,N-乙酰半胱氨酸能明显减少GM-CSF含量(P<0.01)。结论:5-FU能促进Egr-1启动子上调人骨髓基质细胞GM-CSF基因的表达,从而对化疗后的造血损伤产生一定的恢复作用。

氟脲嘧啶诱导Egr-1启动子转录调控Flt3配基的基因表达

目的:探讨5-氟脲嘧啶(5-Fu)诱导Egr-1启动子调控造血生长因子基因表达对化疗后造血损伤的恢复作用。方法:构建携带Egr-1调控序列启动的Flt3配基(FL)和EGFP双顺反子基因pCIneo真核表达载体(Egr-EF);通过脂质体转染骨髓基质细胞系HFCL并称为HFCL/EF;采用流式细胞术和倒置荧光显微镜观察EGFP绿色荧光表达的阳性细胞;采用RT-PCR、Western blot和ELISA检测5-Fu对HFCL/EF细胞FL表达的影响;流式细胞术检测经5-Fu处理的HFCL/EF细胞上清对CD34+细胞和CFU-GM的增殖作用;采用活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸鉴定化疗通过活性氧诱导Egr-1启动子CArG序列调控下游基因表达的特异性。结果:构建了Egr-1调控序列启动的双顺反子基因表达载体(Egr-EF);经5-Fu处理后HFCL/EF细胞培养上清液较未加5-Fu组的FL含量明显增高并且对CD34+细胞和CFU-GM具有较强的扩增作用(P<0.01);在5-Fu处理的HFCL/EF细胞中,EGFP活性、FLmR-NA和FL蛋白表达增强,而且,N-乙酰半胱氨酸明显减少FL含量。结论:5-Fu诱导Egr-1启动子调控的造血生长因子基因表达对化疗药物处理后的造血损伤具有一定的恢复作用。