新牛蛙活性肽Catesbeianin-1a的抗菌抗肿瘤作用

通过筛选牛蛙皮肤cDNA文库得到具有较强抗菌抗肿瘤活性肽Catesbeianin-1a,合成其成熟肽氨基酸序列,MIC法测定抑菌活性结果表明,Catesbeianin-1a对临床常见的致病菌具有较强的抑菌活性,其中对猪链球菌2型的MIC为2.5mg/L,且对兔红细胞几乎无溶血性。MTT法测定多肽抗肿瘤细胞活性,结果 Catesbeianin-1a对胃癌细胞和肝癌细胞的抑杀活性很强,对肝癌细胞SGC7901的IC50为0.845mg/L。制作透射电镜超薄切片,利用透射电镜观察活性肽对细菌和肿瘤细胞超微结构的影响,旨在初步探讨牛蛙皮肤活性肽Catesbeianin-1a抗菌、抗肿瘤的作用机制,并以Catesbeianin-1a为基础进行分子改造来提高其抗肿瘤的靶向性并降低其毒性。

抗菌肽F1高产菌株筛选鉴定及其对多重耐药菌生物膜形成的抑制作用

该研究以L.paracasei subsp.Tolerans FX-6为出发菌株,经过^(60)Coγ射线辐照诱变,筛选出一株高产抗菌肽F1的突变菌株(菌26)。对菌26进行16S rDNA序列比较分析发现其与FX-6具有高度相似性。进一步对菌26的牛奶发酵粗提物进行分离纯化,成功富集抗菌肽F1。通过抑菌实验发现,菌26的牛奶发酵粗提物对E.coli的最低抑菌质量浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)为3.16 mg/mL,较FX-6牛奶发酵粗提物的MIC降低了75%,同时抗菌肽F1的产量也提高了3.03倍,初步推断抗菌肽F1质量浓度与菌株的抑菌活性之间可能存在正相关关系。前期研究已经发现抗菌肽F1对黏菌素耐药大肠杆菌SHP45的MIC为320.0μg/mL,该实验进一步研究表明当抗菌肽F1的质量浓度达到2×MIC时,可抑制50%以上的黏菌素耐药大肠杆菌SHP45生物膜的形成。基于以上研究结果表明,菌26比出发菌株具有更高的产抗菌肽F1能力,且抗菌肽F1对黏菌素耐药大肠杆菌SHP45的生物膜形成具有显著的抑制作用。该研究为高产抗菌肽菌株的获得提供研究思路,并有望为多重耐药细菌感染的防控提供物质基础。

甜味植物调节胰高血糖素样肽-1防治糖尿病的研究进展

由肠道L细胞生成的多肽类化合物胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)能够通过多重机制降低血糖水平,被认为是治疗糖尿病的有效靶点。现阶段,司美格鲁肽等GLP-1相关药物已经被广泛运用于临床实践中,效果显著却仍有一定局限性。近年来,甜味植物被广泛研究应用于防治各类疾病,尤其在糖尿病防治过程中展现出巨大潜力,其中丰富的糖类、皂苷类、黄酮类及生物碱类等化合物是其呈“甜味”的主要物质基础。已有多项研究提示甜味植物及其活性成分可能通过多种途径影响GLP-1,包括直接与L细胞发生作用,激活味觉受体、胰高血糖素原多肽/前激素转化酶1/3、Wnt/β-catenin和磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B等信号通路,或者间接的通过肠道菌群/短链脂肪酸、肠道菌群/胆汁盐水解酶/法尼醇X受体、二肽基肽酶-4等途径影响GLP-1的合成或维持。该研究将对甜味植物的甜味物质基础及其作用于GLP-1的可能机制进行综述,为进一步阐明甜味植物的“滋味”与“功效”提供新的视角,并为甜味植物资源的开发利用提供新的思路。

牛骨肽钙螯合物制备、表征及其促MC3T3-E1细胞成骨活性

目的:为制备人体高效吸收利用的补钙剂并探究其对MC3T3-E1细胞成骨活性的影响。方法:对牛骨多肽进行钙螯合处理,以钙螯合能力为考察指标,通过响应面方法确定最佳制备条件;利用红外光谱、X射线衍射和原子吸收等方法探究肽钙螯合物的结构特性及其稳定性;通过细胞实验探究牛骨肽钙螯合物对MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化活性的影响。结果:制备牛骨肽钙螯合物的最佳条件为肽钙质量比2.97∶1、温度62.54℃、pH 9.06。在该条件下,钙螯合能力达到55.65μg/mg。光谱结构分析结果表明氨基氮、羟基氧和羧基氧是钙主要螯合位点,二者之间主要通过配位键结合,且肽螯合钙后分子质量增加;此外,牛骨肽钙螯合物稳定性受温度影响较小,但对pH值较敏感。MC3T3-E1细胞实验结果表明肽钙螯合物具有明显促MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化活性的作用。结论:制备的牛骨肽钙螯合物具有潜在的促MC3T3-E1细胞成骨活性功效。

抗菌肽MAF-1A洐生肽的设计及其抗白色念珠菌活性

目的探讨家蝇抗真菌肽-1A(MAF-1A)衍生肽的设计及其抗白色念珠菌(C.albicans)活性。方法采用序列截短及氨基酸残基替换法设计4条MAF-1A衍生肽,生物信息学分析其理化特性;取对数生长期C.albicans ATCC10231制备成浓度为(0.5~2.5)×10^(6)cfu/L的菌液,采用微量稀释法检测4条衍生肽对C.albicans的抗菌活性,另设MAF-1A组(25~1600 mg/L MAF-1A处理)、氟康唑(FLC)对照组(0.25~64.00 mg/L FLC处理);采集健康人全血,离心取血细胞制作重悬红细胞,与不同终浓度(25~400 mg/L)活性衍生肽混匀,分为MAF-1A组、MAF-1A22S3组、MAF-1A20S3组、MAF-1A18S5组、MAF-1A16S5组、阳性对照(0.1%Triton X-l00处理)及阴性对照组[磷酸盐缓冲溶液(PBS)处理],采用体外溶血实验检测各组红细胞的溶血率;制备(1.0~5.0)×10^(9)cfu/L菌液,与不同终浓度[1、2、4×最小抑菌浓度(MIC)]活性衍生肽稀释液混合,设MAF-1A组(1、2、4×MIC MAF-1A处理)和FLC(1、2、4×MIC FLC处理)对照组,分别于0、4、8、12、16、20及24 h取混合菌液100μL于沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)平板上37℃培养,记录菌落数,绘制时间-杀菌曲线检测MAF-1A、MAF-1A22S3及FLC对C.albicans的杀菌动力学;制备1.0×10^(9)cfu/L C.albicans菌液,加不同终浓度(1、2、4×MIC)的活性衍生肽稀释液,设MAF-1A(1×MIC MAF-1A处理)、FLC(1×MIC FLC处理)对照组和阴性对照组(PBS处理),采用扫描电镜观察各组C.albicans的形态学改变。结果4条衍生肽对C.albicans均具有抗菌活性,MIC和MFC值均较模板肽MAF-1A降低,其中MAF-1A22S3的抗菌活性增加最为明显;衍生肽MAF-1A22S3、MAF-1A20S3溶血活性低于模板MAF-1A,其中MAF-1A22S3的溶血性最低(6×MIC范围内溶血率<5%);MAF-1A22S3对C.albicans具有较强的杀菌作用、且呈浓度依赖性,同浓度时杀菌效率强于模板肽MAF-1A和FLC对照组;衍生肽MAF-1A22S3作用后C.albicans细胞表面出现明显的凹陷、裂痕、胞质外溢、细胞皱缩及裂解死亡等病理改变,且细胞损伤程度与衍生肽浓度呈正相关。结论衍生肽MAF-1A22S3体外抗真菌效果明显,且体外溶血性低,其机制可能与破坏菌细胞的完整性有关。

Bacillus natto TK-1产脂肽的纯化、抑菌活性及其表面活性剂特性

利用酸沉、醇提和薄层层析等方法从Bacillus natto TK-1发酵液中分离得到脂肽。TLC结果表明,在迁移值Rf0.58～0.65处出现单一紫红色条带其为脂肽粗提物。脂肽的临界胶束浓度约115mg/L。在浓度为512mg/L时,脂肽能将水的表面张力显著地降低到30.1mN/m。同时,通过体外抗粘连实验表明,脂肽能显著抑制沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对96孔板固体表面的粘附,其中,对沙门氏菌的抗粘连效果较为明显。通过平板扩散法考察脂肽抑菌活性,结果表明脂肽具有较广泛的抑菌谱,对灰霉和镰胞霉的抑菌能力较强。

僧帽牡蛎天然活性多肽BPO-1抗人胃腺癌BGC-823细胞活性研究

运用细胞生物学、生物化学等手段 ,观察鉴定分离提取的牡蛎天然活性肽BPO 1对人胃腺癌细胞的生物学效应 .实验结果表明 ,BPO 1能有效抑制人胃腺癌BGC 82 3细胞增殖活动 ,细胞生长受到抑制 ,分裂指数下降 .细胞周期检测出现凋亡峰 .光镜观察显示经BPO 1处理后的BGC 82 3细胞失去原有的恶性表型 ,表现出明显不同于对照组细胞 .

痛泻要方对腹泻型肠易激综合征模型大鼠结肠组织血管活性肠肽及受体1表达影响

目的:探讨痛泻要方治疗腹泻型肠易激综合征(D-IBS)模型大鼠的作用机制。方法:采用应激与束缚相结合的方法复制D-IBS模型后,应用免疫组化、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测结肠组织血管活性肠肽(VIP)与其受体1(VPAC1)蛋白和mRNA的表达。结果:与正常组比较,模型组结肠组织VIP与VPAC1蛋白、mRNA表达均上调(P<0.01);与模型组比较,痛泻要方组结肠组织VIP与VPAC1蛋白、mRNA的表达则下调(P<0.01)。结论:痛泻要方治疗D-IBS的作用机制与结肠组织VIP与VPAC1表达下调有关。

重组人胰高血糖素样肽-1的表达及生物学活性

将人工合成的人胰高血糖素样肽-1（human glucagon—like peptide-1，hGLP-1）基因插入质粒栽体pET-32a（＋）中，构建成rhGLP-1与硫氧还蛋白（thioredox）及六聚组氨酸（hexahistidine）的融合表达栽体pET32-GLP-1，转化大肠杆菌BL21（DE3）获得表达菌株，经LPTG诱导发酵的菌体超声破碎后，裂解液用Ni离子亲和层析纯化得到融合蛋白，经肠激酶裂解，再次Ni离子亲和层析，得到rhGLP-1样品。经SDS—PAGE和等电聚焦检测，样品纯度大于90％，等电点介于pH5．2-pH5．85之间。质谱测定rhGLP-1分子量为3355．0kDa，肽图分析得到2097．7kDa和1005．5kDa两个胰蛋白酶酶解片断，均与理论分析结果一致。动物实验表明重组蛋白具有明显的降血糖活性和促胰岛素分泌作用。

5-氟尿嘧啶-1-基磷三肽化合物的合成及抗癌活性研究

以 DCC(二环己基碳二酰亚胺 ) /Bt OH(1 -羟基苯并三氮唑 )为偶联剂 ,通过液相偶联法合成了 1 4个新型 5 -氟尿嘧啶 -1 -基磷三肽化合物 ,收率为 5 2 %～ 83 % .所有化合物经 1 H NMR,31 P NMR,IR光谱和元素分析证实 .提出了合成中间体 5 -氟尿嘧啶 -1 -基乙酸的方法 ,其优点是操作简便且产率高 .对部分化合物进行了抗癌活性测试 ,结果表明该类化合物对 HL-60和

血管活性肠肽调控肺泡巨噬细胞M1/M2极化治疗急性肺损伤的研究进展

急性肺损伤(ALI)是由于病原体入侵,激活免疫细胞启动异常免疫反应,免疫细胞在清除病原体过程中释放过量促炎因子,最终损伤肺实质细胞导致呼吸功能迅速衰减。巨噬细胞在炎症反应启动、放大、损伤和终结中发挥关键作用,通过M1/M2极化平衡控制炎症发生、发展和转归,其极化失衡是导致炎症失控的重要原因。本文分析肺泡巨噬细胞M1/M2极化在ALI发病中的作用以及血管活性肠肽可能的调控机制,以期为进一步深入研究提供参考。

重组人胰高血糖素样肽-1的表达、纯化及其生物学活性

为获得重组人胰高血糖素样肽 1[recombinanthumanglucagon likepeptide 1(7～ 37) ,rhGLP 1]并研究其生物学活性 ,采用亚磷酸二酯法合成hGLP 1cDNA的 6个寡核苷酸片段 ,拼接成完整的hGLP 1cDNA ,构建重组质粒pGEX hGLP 1,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)获得表达菌株 .高密度发酵培养的菌体超声破碎后 ,裂解液用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化得到GST融合蛋白 .经CNBr裂解、QAE SepharoseFF柱层析和脱盐 ,得到纯度大于 90 %的rhGLP 1,质谱测定分子量结果与理论值一致 .生物学活性分析表明 ,rhGLP 1具有明显的降血糖活性 .

白僵菌诱导家蚕抗菌肽enbocin1基因的表达特征及产物的抗真菌活性

家蚕的抗菌肽家族基因enbocin1是蚕体免疫系统相关基因。为解析家蚕对病原真菌感染免疫应答反应的分子机制,采用实时荧光定量PCR检测抗菌肽基因enbocin1在家蚕5龄幼虫感染球孢白僵菌(Beauveria bassiana)后的时空表达模式,结果显示:enbocin1主要在幼虫脂肪体中显著上调表达,而且持续至感染诱导后30 h,感染后8、30 h的表达水平分别上调了约44倍和6倍;在马氏管、体壁中该基因的诱导表达差异不显著,在血淋巴中几乎检测不到该基因的表达。进一步用原核表达系统成功表达并纯化获得了高纯度的重组家蚕抗菌肽enbocin1,体外抑菌试验表明其对白僵菌具有较强的抑菌活性,且重组enbocin1蛋白浓度与抑菌活性之间具有量效关系。用重组enbocin1蛋白制备了效价达1∶30 000的多克隆抗体,可用于进一步深入研究enbocin1的功能及其作用机制。研究结果提示抗菌肽enbocin1在家蚕抵御真菌感染的过程中可能具有重要作用。

5-氟尿嘧啶-1-基磷二肽化合物的合成及抗癌活性

以二环己基碳二酰亚胺 (DCC) / 1-羟基苯并三氮唑 (Bt OH)为偶联剂 ,通过液相偶联法合成了一系列新型 5 -氟尿嘧啶 - 1-基磷二肽化合物 ,收率达 5 8.2 %～ 77.8% ,所有化合物经 1 H NMR,3 1 P NMR,IR光谱和元素分析证实 .提出了合成中间体 5 -氟尿嘧啶 - 1-基乙酸的方法 ,其优点是操作简便且产率高 .对部分化合物进行了抗癌活性测试 ,结果表明该类化合物对 HL- 6 0和 BEL- 740

抗HIV-1 gp41合成多肽C34单抗的制备及生物学活性

目的制备针对C34和C46单抗, 并以此为工具研究gp41表位,进一步 了解HIV-1包膜蛋白的作用机理和病毒的感染机制,为寻找新的治疗靶点提供抗体工具。 方法常规动物免疫、细胞融合、克隆化制备抗C34与C46的单克隆抗体,并鉴定其 特异性位点，还用ELISA法、MTT法及荧光分子探针技术对单抗的生物学活性进行研究。结果获得了3株抗C34单克隆抗体、2株抗C46单抗。此5个单抗均与C34结合 , 并抑制N36肽与C34肽复合物的形成；其中效价最高的1G1对H9/HIVⅢB细胞的生长有刺 激作用 ,对H9/HIVⅢB细胞和MT-2细胞的融合无明显影响。结论得到5株 可与C34反应,并可抑制C34与N36多肽结合的单抗, 其中1G1所识别的表位可能为增强性或刺激性表位。

小肽转运载体(PepT1)及其活性的调控

近来发现蛋白质的消化产物在动物肠道内有相当一部分是以小肽的形式吸收和利用。克隆和分析两个结构相似的小肽转运载体 (Pep T1和 Pep T2 )揭示了哺乳动物和禽类的小肽转运机制。这些小肽转运载体识别二肽和三肽 ,其活性受日粮蛋白质水平和各种激素的调控。目前对人、猪、鸡、大鼠、小鼠、兔子、绵羊等的 Pep T1的基因结构和蛋白质结构已有了系统的认识。就其生理特性、分布。

血管活性肠肽对哮喘气道重塑小鼠肺组织转化生长因子β_1表达的影响

目的探讨血管活性肠肽对哮喘气道重塑小鼠肺组织转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响。方法 SPF级雌性Balb/c小鼠30只,随机分为正常对照组(A组)、哮喘模型组(B组)、血管活性肠肽组(C组),每组10只。B组、C组动物建立哮喘气道重塑模型。HE染色观察各组小鼠支气管及肺组织病理改变,以病理图像分析测量小鼠肺组织中支气管基底膜周长(Pbm)、支气管壁面积(WAi)和平滑肌层面积(WAm);实时定量PCR方法检测各组小鼠肺组织TGF-β1 mRNA表达,Western blot方法检测各组小鼠肺组织TGF-β1蛋白表达。结果 B组小鼠肺组织病理改变:胶原沉积和炎性细胞浸润,平滑肌层增厚,其WAi/Pbm及WAm/Pbm较A组明显增加(P<0.05);C组上述指标较A组增加,但较B组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。B组TGF-β1mRNA和蛋白表达水平均高于A组,差异有统计学意义(P<0.05);C组TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平均低于B组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论血管活性肠肽有抑制气道重塑作用,其机制可能与减少TGF-β1表达有关。

噬菌体展示ICAM-1模拟肽的制备及活性鉴定

目的:获得具有生物学活性的细胞间黏附分子-1(ICAM-1)模拟肽。方法:以噬菌体扩增及PEG沉淀法,大量制备展示十二肽P1、P2的噬菌体。采用ELISA、竞争抑制试验及免疫组化染色法,分别鉴定P1、P2模拟ICAM-1分子的结合特性及生物学活性。结果:噬菌体展示肽P1、P2能与抗ICAM-1单克隆抗体(mAb)15.2特异性结合。该结合作用可被ICAM-1分子竞争性抑制,P1、P2能模拟ICAM-1分子与LFA-1结合的功能。结论:噬菌体展示的短肽P1、P2具有天然ICAM-1的生物学活性。

高表达受体活性修饰蛋白1对血管紧张素Ⅱ和降钙素基因相关肽诱导的A10细胞降钙素受体样受体膜分布的影响

目的探索受体活性修饰蛋白1(RAMP1)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和(或)降钙素基因相关肽(CGRP)诱导的降钙素受体样受体(CRLR)在血管平滑肌细胞(VSMC)的表达和分布的影响,进一步揭示CGRP抑制VSMC增殖的机制。方法 通过酶切、连接、转化等方法构建pCDNA3.1(+)-RAMP1真核表达载体并稳定转染至鼠源性血管平滑肌细胞株A10中,获得稳定高表达RAMP1的细胞系。无转染细胞、转染空载体〔pCDNA3.1(+)〕细胞和RAMP1高表达组细胞〔pCDNA3.1(+)-RAMP1〕分别用AngⅡ100 nmo.l L-1、CGRP 100 nmo.l L-1和CGRP+AngⅡ处理24 h,用MTT法检测细胞存活;逆转录PCR、Western印迹和免疫荧光法分别检测CRLR mRNA含量、蛋白表达及细胞膜分布。结果 单纯转染空质粒或RAMP1对细胞增殖无明显影响。AngⅡ处理对3种细胞存活的影响无显著差异。pCDNA3.1(+)-RAMP1细胞经CGRP处理24 h后,细胞存活明显高于其他两组细胞(P<0.05);经CGRP+AngⅡ处理,细胞存活明显低于其他两组(P<0.05)。AngⅡ,CGRP和CGRP+AngⅡ处理对3种细胞CRLR mRNA表达无明显影响,但CGRP处理使pCDNA3.1(+)-RAMP1细胞中CRLR蛋白明显高于其他两种细胞(P<0.05),而CGRP+AngⅡ处理使pCDNA3.1(+)-RAMP1细胞中CRLR蛋白明显低于其他两种细胞(P<0.05)。免疫荧光结果显示,经无血清或CGRP处理后,无转染细胞和pCDNA3.1(+)细胞中的RAMP1和CRLR主要分布在胞浆区域;经AngⅡ或CGPR+AngⅡ处理后,pCDNA3.1(+)-RAMP1细胞中RAMP1和CRLR在细胞膜上的分布多于无转染细胞和pCDNA3.1(+)细胞。结论 高表达RAMP1能增强CGRP抑制AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞增殖,其机制可能是通过RAMP1增加CRLR的膜分布,从而增强CGRP受体对CGRP的敏感性有关。

胰高血糖素样肽1或其类似物体外生物活性检测方法的建立

目的:通过对不同活性检测方法的综合比较,筛选最适的胰高血糖素样肽1(GLP-1)或其类似物的体外活性检测方法,为GLP-1类似物的体外生物活性检测奠定基础。方法:以GLP-1作为阳性药物,用MTT方法检测其对RIN-m-5F、MIN6细胞增殖的影响;用ELISA方法检测其对INS-1、MIN6细胞胰岛素分泌量的影响;用ELISA方法检测其对BHK-GLP-1R细胞cAMP分泌水平的影响。通过对上述方法的综合比较,筛选出最适的活性检测方法。结果:GLP-1对细胞增殖的影响实验结果并不显著,对胰岛素分泌量影响的实验效果明显,对cAMP分泌水平的实验无明显效果。结论:ELISA检测GLP-1或其类似物对MIN6细胞胰岛素分泌量实验可用于GLP-1或其类似物的体外活性检测。