PMA与PCR结合的细菌活细胞检测方法

基于PCR的分子生物技术在检测过程中不能有效区分样品中细菌的死活状态,这会导致对细菌数量的错误估计.文中用叠氮溴化丙锭(PMA)对样品基因组提取进行前处理,使PMA与样品中死细胞的DNA分子共价交联,并抑制该DNA分子的PCR扩增.结果表明:当样品中PMA质量浓度大于3μg/mL、曝光时间大于3 min时,PMA可抑制细胞膜破裂的E.coli死细胞DNA的PCR扩增;PMA质量浓度高于50μg/mL时对活细胞DNA的PCR扩增有一定影响;当浊度小于10NTU时,PMA能有效地抑制死细胞DNA的PCR扩增,而当浊度大于100NTU时,PMA失去效果.

氮溴化丙锭与聚合酶链反应结合的细菌活细胞检测方法

目的:区分细菌PCR过程中的死活菌。方法:使用叠氮溴化丙锭(PMA)处理提取样品的基因,使样品中死细胞的DNA分子与PMA发生共价交联,使其DNA分子的PCR扩增被抑制。结果:当浊度<10 NTU时,对死细胞DNA的PCR扩增,PMA具备的抑制效用仍然有效;当浊度>100 NTU时,PMA的抑制效果就会失去。而当样品中的PMA质量浓度>3μg/ml时,曝光时间就会超过3 min,PMA可对死细胞DNA的PCR扩增进行抑制;PMA质量浓度>50μg/ml时,活细胞DNA的PCR扩增就会受到影响。结论:对异丙醇处理、热处理引起的细菌细胞膜破裂而产生的死细胞,可通过PMA与PCR结合的方法进行选择性地检测,能较好的区分死活菌。

应用活细胞RNA检测纳米技术检测乳腺上皮细胞MCF-10A及乳腺癌MCF-7细胞的miR-142-3p表达

传统的核酸检测技术如放射性核素、荧光、化学修饰的探针以及核酸扩增等技术无法检测活细胞中核酸的表达量。而活细胞RNA纳米检测技术和传统的检测技术相比,利用纳米金颗粒为探针能对活细胞进行检测,实验步骤更为简单,可以在自然的、无扩增的条件下观察RNA,这可真实地反应基因表达与表型之间的关系。miRNA是一类非编码RNA,其长度为20~24个碱基,在生命活动中起重要的作用。本文应用活细胞RNA检测纳米技术结合荧光定量PCR分别检测正常的乳腺上皮细胞系及乳腺上皮癌细胞系中内源性miR-142-3p的表达,发现乳腺癌细胞系内源性miR-142-3p的表达显著高于正常乳腺上皮细胞系中miR-142-3p的表达,结果提示miR-142-3p可能在乳腺癌细胞发生发展中起到调控作用。

活细胞在线检测器在长双歧杆菌BBMN68培养中的应用研究

活菌数检测是益生菌培养过程分析的重要环节。传统以平板稀释法检测益生菌活菌数费时费力,且无法实现实时监测。本文探索了电容型活细胞在线检测器在双歧杆菌BBMN68培养过程中的应用效果,评价其检测活细胞量的可行性。研究表明,在菌体发酵生长的对数期,活细胞在线检测器的电容值与长双歧杆菌BBMN68活细胞量之间存在良好的线性关系,其线性相关系数为0.992,比吸光值法更准确地反映发酵体系中活细胞量的情况,在稳定期与衰亡期也表现出了良好的相关性。比平板计数法更快速,可以实现实时监控。电导型活细胞检测器为益生菌培养过程在线检测提供了一种简便、精确的方法。

基于胞质分裂的增殖心肌细胞探针检测方法的建立

[目的]基于双荧光探针方法,探究全新的在活细胞水平检测心肌细胞增殖的实验方法,该方法能排除多核心肌细胞核复制带来的假阳性细胞,为精准探测心肌细胞增殖提供实验参考。[方法]以细胞内细胞分裂周期蛋白20(CDC20)和痉挛性截瘫蛋白20(SPG20)作为探针靶点,构建分子探针,采用脂质体转染试剂2000(Lipo-2000)作为探针载体,将探针转染到细胞中,在活细胞水平检测CDC20和SPG20双阳性的细胞,即为发生胞质分裂的增殖细胞。[结果]细胞不发生增殖时,荧光探针无法检测到目的序列,细胞不发荧光;细胞核复制分裂但不发生胞质分裂时,两个荧光探针不能同时检测到序列,细胞不同时发两种荧光;细胞发生胞质分裂的增殖时,细胞同时发两种荧光。[结论]使用CDC20/SPG20双荧光探针方法,能够准确检测发生胞质分裂的增殖的心肌细胞,从而排除因核增殖产生的细胞增殖假阳性问题,使细胞增殖的检测精准度更高。

基于SPR干涉成像传感法检测大蒜素刺激胃癌细胞的响应

针对细胞响应传感的要求,提出了SPR干涉成像传感细胞响应的方法,设计制作新颖的微流体池,构建用于活细胞水平分子传感和检测的系统。在此基础上,先检测和分析细胞在微流体池中的培养状态,再检测大蒜素对人胃癌细胞系BGC823刺激响应。实验结果表明,胃癌细胞贴附生长良好,微流体池可提供细胞生存的微环境;6 h后大蒜素刺激和对照的SPR信号响应值分别为0.15 RIRF和0.35 RIRF,大蒜素对胃癌细胞系BGC823细胞具有明显抑制作用。在持续提高精度、可靠性以及丰富有关工艺技术后,有可能建立完整的药物刺激细胞响应检测技术平台,为药物发现和临床化疗方案优化做出贡献。

活细胞在线监控L-羟脯氨酸补料发酵工艺的研究

为了研究活细胞在线监控补料技术对L-羟脯氨酸发酵的影响,在30 L发酵罐上安装活细胞在线检测仪,实时监测发酵液中活细胞数量,根据活细胞数量调整补料策略,分析活细胞在线监控补料对L-羟脯氨酸发酵补糖速率、产量、糖酸转化率和代谢流量分布的影响。结果表明,采用活细胞在线监控补料发酵工艺生产L-羟脯氨酸的最佳补糖策略是在发酵中后期及时降低补糖速率,最终降到9 g/(L·h),L-羟脯氨酸产量提高了11.39%,乙酸积累量减少了48.69%,糖酸转化率提高了14.92%,糖酵解途径和乙醛酸循环的代谢流分别减少了8.50%和16.89%,磷酸戊糖途径的代谢流增加了14.73%,乙酸合成的代谢流减少了4.97%,L-羟脯氨酸合成的代谢流提高了16.21%。上述结果说明采用活细胞在线监控补料技术生产L-羟脯氨酸,可以有效降低副产物的积累,提高L-羟脯氨酸产量及糖酸转化率。

L-色氨酸活细胞在线监控补料发酵工艺研究

研究活细胞在线监控补料发酵对大肠杆菌发酵L-色氨酸的影响。在30L发酵罐上加装活细胞在线监测仪实时检测发酵罐内的活细胞数量,根据活细胞数量进而确定适宜的补糖量。结果表明:采用活细胞在线监控补料发酵策略,可以根据活细胞总量进行适量流加葡萄糖,通过对葡萄糖流加量的有效控制,降低发酵过程乙酸的积累量,发酵32h菌体生物量与L-色氨酸产量分别提高了6.5%、9.62%。乙酸积累量下降了22.45%,糖酸转化率提高了5.7%。发酵过程中流向色氨酸的代谢流增加了3.76%,流向乙酸的代谢流降低了5.9%。采用活细胞在线监控补料发酵工艺可以显著地提高L-色氨酸的产量,降低乙酸的积累量,提高物料利用率,提高糖酸转化率。

西瓜细菌性果斑病病菌活细胞PMA-PCR检测方法的建立

利用叠氮溴化丙锭与聚合酶链式反应结合(PMA-PCR),建立了西瓜细菌性果斑病病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)活细胞检测方法。实验结果表明,当PMA浓度为0.5 mg/m L时,对活细胞DNA的PCR扩增无影响,最低检测浓度为1×104cfu/m L。当样品中死亡细胞浓度低于107 cfu/m L时,PMA可抑制死亡细胞DNA的PCR扩增;当死亡细胞浓度为1×107cfu/m L时,PMA失去效果。该方法适用于低浓度西瓜细菌性果斑病病菌活细胞的检测。

激光扫描共聚焦显微技术及其在神经、肿瘤相关研究中的应用

介绍了近年来新出现的共聚焦显微镜新的种类,如传统激光共聚焦和活细胞激光共聚焦,对其功能及在神经、肿瘤研究中的应用进行了综述,使现代显微镜能够更加深入研究和分析细胞的变化过程和结构。活细胞激光扫描共聚焦显微镜与双光子激光扫描共聚焦显微镜实现了对肿瘤、神经活细胞长时间地动态观测,可更加真实地揭示细胞凋亡的机制与规律。

单纯男性因素不育患者行形态选择性卵胞浆内单精子注射对胚胎发育及临床结局的影响

目的使用放大系统对不育男性患者的精子进行形态选择性卵母细胞浆内单精子注射术（IMSI）,观察IMSI技术能否改善因男性精液问题而不孕不育夫妇的助孕结局。方法回顾分析本中心2013年1月-2014年11月共82例梗阻性无精子症患者,将行TESA（经皮睾丸穿刺抽吸精子术）获得的睾丸精子通过放大系统（×6600）挑选后行卵母细胞注射（IMSI组）,2013年1月-2014年11月共91例梗阻性无精子症患者经TESA取精术后行常规卵母细胞浆内单精子注射（ICSI组）;2014年1月-11月共44例畸精子症患者行形态选择性包浆内单精子注射治疗（IMSI组）,2014年1月-11月共71例畸精子症患者行常规ICSI治疗（ICSI组）。统计分析ICSI组和IMSI组患者的实验室结局和临床结局。结果梗阻性无精子症患者中正常受精率IMSI组显著高于ICSI组（84.3%vs 77.0%）（P〈0.05）;ICSI组的卵裂率95.5%,优胚率28.2%,囊胚形成率54.8%,种植率26.4%,临床妊娠率47.3%,流产率14%,梗阻性无精子症IMSI组患者的卵裂率96.7%,优胚率29.2%,囊胚形成率54.3%,种植率32.3%,临床妊娠率50.0%,流产率7.3%,两组无显著性差异（P〉0.05）。畸精子症患者的正常受精率IMSI组显著高于ICSI组（68%vs 75.5%）（P〈0.05）,囊胚形成率IMSI组显著高于ICSI组（54.6%vs 67.9%）（P〈0.05）,ICSI组的卵裂率96.2%,优胚率27.6%,种植率28.2%,临床妊娠率43.7%,流产率9.7%;IMSI组患者的卵裂率95.2%,优胚率27.1%,种植率30.7%,临床妊娠率43.2%,流产率10.5%,两组无显著性差异（P〉0.05）。结论梗阻性无精子症患者的睾丸精子经放大系统选择后行ICSI,正常受精率较传统ICSI有显著性提高;畸精子症患者射出的精液标本经放大系统挑选后行ICSI,正常受精率、囊胚形成率较传统ICSI有显著性提高。

MSOME及IMSI技术在辅助生殖领域中的应用进展

精子形态与功能密切相关,精子形态异常是导致男性不育的重要原因之一。自1992年卵母细胞胞浆内单精子注射(ICSI)技术首次获得妊娠以来,许多男性因素不育夫妇通过该技术获得较为满意的妊娠结局。但在×400放大倍数下常规ICSI挑选的看似正常的精子仍可能存在超微结构的异常,这可能是导致ICSI周期失败的原因之一。活精子细胞器形态学检测(MSOME)技术是Bartoov在2001年创立的一项新技术,能在高放大倍数下更深入地观察精子细微结构,有助于挑选出形态正常的精子。精子形态选择性胞浆内单精子注射(IMSI)技术是在MSOME基础上结合传统ICSI技术发展而来,为卵母细胞ICSI提供了一个新方法。通过对MSOME和IMSI的文献进行综述,探讨其临床应用价值。