表面活性剂对活跃链霉菌产那西肽发酵的影响

目的研究Triton X-100、Ca Cl2、DMSO、山梨醇、SDS、Tween-80、CTAB等表面活性剂对活跃链霉菌发酵产那西肽的影响。方法采用单因素实验研究活跃链霉菌的基础代谢以及表面活性剂加入时间对那西肽效价的影响;采用响应面法对表面活性剂添加浓度进行优化。结果基础代谢研究表明,活跃链霉菌产那西肽合成相对滞后于菌体生长。多种表面活性剂均显著影响那西肽的生物合成,整体表现为低浓度促进、高浓度抑制。表面活性剂依其类型及加入时机的不同,对那西肽产量的影响表现出组间类型差异性及组内时间依赖性。结论 DMSO、Ca Cl2、Triton X-100在低浓度范围内对那西肽产量的促进效果最为显著;分别在24、24和48h以DMSO 0.808mg/m L、Ca Cl2 0.799mg/m L和Triton X-100 0.574mg/m L的浓度为最佳添加浓度,该条件下那西肽效价达到931.493μg/m L,比优化前提高了7.73%。

活跃链霉菌合成那西肽的固体斜面培养条件优化

目的探索活跃链霉菌36#摇瓶发酵合成那西肽的固体斜面培养条件的最佳工艺。方法利用单因素与正交试验对固体斜面培养条件进行优化。结果得到合成那西肽的活跃链霉菌36#的固体斜面最优培养条件为：初始phi7．8，培养温度为37℃，培养时间为3d，冷藏时间为O一3周，那西肽产量可达936mg／L。与原工艺相比较，那西肽的产量增加了13．8％。结论通过活跃链霉菌固体斜面培养条件的优化，可以提高活跃链霉菌摇瓶发酵合成那西肽的产量。

24孔板培养活跃链霉菌合成那西肽条件的优化

目的优化24孔板培养活跃链霉菌XW产那西肽的发酵条件。方法采用单因素实验和响应面法对24孔板的发酵条件进行优化。结果得到活跃链霉菌XW 24孔板发酵产那西肽的最优发酵条件为:种子培养基装液量2.55 m L,发酵培养基装液量0.93m L,发酵时间121h。结论通过对发酵条件的优化,可以明显提高24孔板发酵产那西肽的效价达到882.25μg/m L,实验值与模型预测值较接近,吻合度较高,较初始效价675.63μg/m L提高了30.58%。研究结果表明24孔板发酵与摇瓶发酵之间有良好的相关性,相关系数R为0.883。

活跃链霉菌合成那西肽的pH分段控制策略

目的以pH分段控制策略提升活跃链霉菌产那西肽的发酵效价。方法基于对活跃链霉菌合成那西肽基础代谢过程中的生物量、那西肽效价、糖、氨基氮以及pH值进行动态分析，以不同的单-pH值对发酵过程进行恒定控制，考察活跃链霉菌的生物量、比生长速率和那西肽合成的动态变化规律，来确定pH分段控制策略。结果活跃链霉菌合成那西肽代谢过程中pH呈S形波动变化，菌体生长与那西肽合成的相对pH值有所不同。发酵过程恒定控制pH6．5模式下，活跃链霉菌具有最大的比生长速率，恒定控制pH7．5模式下那西肽合成效价最高。以C6H12O6／NH3·H2O补料方式进行pH分段控制，那西肽的合成能力比采用酸碱补料及生理酸碱性物质补料的控制模式强，发酵单位高。结论以C6H12O6／NH3·H2O模式进行补料，在0～72h时恒定控制pH6．5，此后恒定控制pH7．5，那西肽效价较未控制模式下提高了25．58％。

培养条件对活跃链霉菌合成那西肽的影响

研究活跃链霉菌36#摇瓶发酵合成那西肽的条件.研究结果表明:在实验范围内,种龄、接种量、初始pH、溶氧和温度对那西肽产量、菌体干重、糖利用率、基于菌体干重得率与基于菌体糖耗得率总体表现先增大后减少的趋势.最后,在种龄40h、接种量5%、初始pH6.5、溶氧8%、28℃的优化条件下,那西肽产量达到1 194mg/L.与原工艺相比较,那西肽的产量增加了29.3%.

诺西肽产生菌活跃链霉菌的原生质体制备与再生

目的研究诺西肽产生菌活跃链霉菌的原生质体制备与再生的最适条件。方法使用溶菌酶脱去细胞壁制备原生质体,并考察原生质体制备和再生的各种影响因素。结果确定了原生质体制备的条件:一级培养采用种子培养基,培养30 h,转种量的体积分数为5%;二级培养采用R2YE培养基,培养时间为32 h,最适甘氨酸质量浓度为6.0 g.L-1,最佳溶菌酶质量浓度为1.5 g.L-1,酶解时间为60 min,原生质体再生率达到5.3%。结论上述条件为活跃链霉菌原生质体制备与再生的最适条件,该条件的建立为活跃链霉菌原生质体的诱变育种奠定了基础。

透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在那西肽产生菌—活跃链霉菌中的表达

目的将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)整合到那西肽产生菌—活跃链霉菌(Streptomyces actuo-sus)的染色体上进行表达,从而提高菌体对溶解氧的利用,提高那西肽的发酵产量。方法采用分子生物学方法构建了携带vgb的重组质粒pZV02,采用接合转移的方法将其导入那西肽产生菌—活跃链霉菌中,采用抗生素抗性标记筛选法获得了基因重组菌株。结果在低溶氧的发酵条件下,重组菌株的那西肽产量显著高于对照菌株。结论 vgb在活跃链霉菌中的表达,可以改善菌体对溶解氧的利用,在低溶氧的条件下可以提高发酵产物那西肽的产量。

活跃链霉菌nshA基因失活对那西肽发酵的影响

目的通过对活跃链霉菌那西肽生物合成基因簇中的nshA基因进行内部片段缺失,考察其对那西肽生物合成的影响。方法利用重叠延伸PCR(Gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)的方法失活nshA基因,并构建具有接合转移功能的大肠杆菌-链霉菌重组质粒pSH03,通过接合转移将重组质粒pSH03导入到活跃链霉菌细胞内,并通过同源交换形成活跃链霉菌基因组上的nshA基因失活。采用摇瓶进行发酵,采用HPLC的方法检测发酵液中诺西肽的含量。结果重组菌株的那西肽发酵产量较对照菌株有明显提高。结论 nshA基因对那西肽的生物合成有负调节作用,该基因的失活,有利于那西肽生物合成酶结构基因的表达,使诺西肽的产量有明显提高。

过表达根瘤血红蛋白基因对活跃链霉菌那西肽产量的影响

[目的]采用过表达根瘤血红蛋白基因改善活跃链霉菌的溶氧表达,以提高那西肽的产量。[方法]通过全基因组合成的方法得到根瘤菌血红蛋白基因(sm),连接到整合型质粒p IB139上,构建表达载体p IB139-sm。通过大肠杆菌-链霉菌结合转移的方法将sm基因整合到活跃链霉菌基因组上,通过PCR验证各转化子目的片段已整合到活跃链霉菌基因组上,并进行大量筛选得到重组菌株。[结果]经SDS-PAGE和CO结合差示光谱分析,结果显示,目的蛋白均已成功表达且具有相应的蛋白活性。摇瓶培养结果显示,Smf Hb表达对菌体生长和那西肽产量有明显的促进作用,过表达Smf Hb的重组菌株那西肽产量达1 245.7μg/m L,比原始菌株提高39.6%。[结论]过表达sm基因提高那西肽产量的作用优于vhb。

高产那西肽活跃链霉菌的高通量选育

为提高活跃链霉菌(Streptomyces actuosus)发酵生产那西肽的强度,对1株已应用于工业化生产那西肽的菌株11-27进行了恒温常压等离子体诱变(atmospheric and room temperature plasma,ARTP),并对最终获得的高产突变菌株进行了工业化生产应用。首先,根据那西肽的分子特征,建立了以FeCl_(3)为络合显色剂的多孔板高通量筛选方法。应用ARTP诱变方法对菌株11-27进行诱变处理,最终获得了1株高产突变菌株22-3B6,其那西肽的效价相对出发菌株11-27提高了13.7%。对高产菌株进行遗传稳定性分析后,在50 m^(3)工业生产罐上对最优菌株进行了16个批次的发酵验证,结果表明诱变菌株22-3B6生产那西肽的平均效价较对照菌株提高了10.1%。该文所建立的高通量筛选方法能简单、快速地获得高产突变菌株,从而有效地降低了那西肽的工业化生产成本。

糖多孢红霉菌bldD基因提高活跃链霉菌诺西肽产量的研究

目的将糖多孢红霉菌bldD基因转入活跃链霉菌(Streptomyces actuosus)N-H,探讨其对诺西肽产量的影响。方法将bldD基因连接到链霉菌整合型表达载体pZMW上构建pZMW-bldD质粒,利用PEG介导的原生质体转化方法将重组质粒pZMW-bldD及对照质粒pZMW-vgb分别导入活跃链霉菌,通过对枯草芽孢杆菌抑菌试验和分光光度计法测定发酵液中诺西肽产量。结果成功构建了活跃链霉菌N-H/pZMW-bldD工程菌株及对照菌株N-H/pZMW-vgb。与出发菌株N-H相比,N-H/pZMW-bldD菌株诺西肽产量提高了68%;与对照菌株N-H/pZMW-vgb相比,N-H/pZMW-bldD菌株诺西肽产量提高了19%。结论在活跃链霉菌中导入糖多孢红霉菌bldD基因可以提高诺西肽产量,其作用效果较vgb基因更为明显,说明bldD基因对抗生素产量的提高具有广谱性。

常压室温等离子体(ARTP)诱变及高通量筛选那西肽高产菌株

采用新型常压室温等离子体(ARTP)诱变活跃链霉菌(Streptomyces actuosu),并应用抑菌圈和48孔板培养方法高通量筛选高产那西肽菌株。研究表明抑菌圈径的大小与48孔板效价之间以及48孔板效价与摇瓶效价之间均有较好的相关性,系数R分别达到0.534和0.896。通过多轮ARTP诱变及高通量筛选最终获得了3株相对效价提高50%以上的遗传性能稳定的突变株。ARTP诱变技术作为获得那西肽高产菌株的有效途径,与传统摇瓶发酵筛选相比,48孔板及抑菌圈法能显著提高那西肽高产菌株的筛选效率。

紫外诱变和氨基酸抗性筛选选育那西肽高产菌株

目的筛选出那西肽高产菌株。方法以活跃链霉菌CB040517作为出发菌株,通过紫外-氯化锂诱变处理,并结合前体复合氨基酸抗性筛选,选育那西肽高产菌。结果通过致死率和正突变率的考察,确定紫外最佳诱变剂量为100s。在分离培养基上层加入氯化锂和底层加入复合氨基酸进行正突变株的定向筛选,选育得到那西肽高产菌株UV-19-A12,其摇瓶效价达904.00μg/mL,比出发菌株提高72.5%,经过五代斜面传代试验考察,该菌株遗传性状稳定。结论紫外诱变和氨基酸抗性筛选可以获得那西肽高产菌株。

响应面法优化那西肽发酵条件

目的优化活跃链霉菌NXT-NA10摇瓶发酵生产那西肽的发酵条件。方法首先用Plackett-Burman设计法筛选出影响发酵的显著因素,再用响应面法分析优化显著影响因素参数。结果 Plackett-Burman设计法筛选出4个显著影响因素为酵母粉、黄豆粉、NaCl和接种量,响应面法优化出它们的最佳数值分别为酵母粉0.31%、黄豆粉6.42%、NaCl 0.41%、接种量5.5%。结论在此优化条件下,摇瓶效价达到(1121.28±26)μg/mL,比优化前提高了10.95%。

紫外-微波复合诱变原生质体选育那西肽高产菌株

以UV-19为出发菌种,研究了紫外、微波以及紫外-微波复合对活跃链霉菌原生质体的诱变效应。结果表明复合诱变对该菌原生质体有明显的致死作用。通过紫外-微波复合诱变,筛选到一株优良菌株PUM-13,其摇瓶含量达到883.450μg/mL,较出发菌株提高了17.14%,5代后生产性能稳定。

含硫多肽类抗生素那西肽的研究进展

那西肽(nosiheptide)是一类由活跃链霉菌(Streptomyces actuosus)产生的新型环保含硫多肽类抗生素。本文就其结构与理化特性,生物学功能及作用机制,生产,提取工艺,测定方法,安全性及应用等方面进行了综述,对产那西肽的结构基因,菌种改良方面的研究进行了总结,对那西肽后续的研究进行了展望。

基于添加物调控提高那西肽发酵效价

研究不同添加物对活跃链霉菌产那西肽发酵过程的影响,以提升那西肽发酵效价.以单因素实验考察7种添加物对那西肽发酵效价的影响,研究其各自的较优添加水平及添加时间;综合单因素实验结果,以那西肽效价为指标,采用响应面法对硫酸锰、硝酸镧、硝酸铈的添加浓度进行优化.供试添加物均不同程度提升了那西肽发酵水平,提升效果依次为EDTA>硫酸锰>硝酸铈>橄榄油>硝酸镧>壳聚糖>制霉素.分别在发酵24h添加9.27μg/L硫酸锰,96h添加5.15μmol/L硝酸镧和0.9mmol/L硝酸铈,那西肽发酵效价达到948.08μg/mL,比优化前提高了30.97%.基于添加物调控策略可有效提升那西肽发酵效价.

紫外诱变和抗性筛选选育那西肽高产菌株

那西肽是活跃链霉菌(streptomyces actuosus)产生的次级代谢产物,与硫链丝菌素(thiostrepton)、盐屋霉素(siomycin)及硫肽霉素(thiopeptin)等抗生素结构相似,均属于含硫多肽类抗生素[1]。那西肽最先于20世纪60年代发现,现在作为一种畜禽专用的抗生素在多个国家允许使用。尽管我国于2019年颁布文件,禁止该抗生素长期添加于饲料中用于畜禽促生长,但是由于该类抗生素结构的特异性,对这类抗生素的工艺研究工作仍是方兴未艾[2]。