活骨灌注液对激素诱导的骨髓间充质干细胞成骨分化及Sirt1/LC3基因表达的影响

目的探讨活骨灌注液对激素诱导的骨髓间充质干细胞成骨分化及Sirt1/LC3基因表达的影响。方法将SD大鼠骨髓腔提取的骨髓间充质干细胞(BMSCs)随机分为对照组、激素组和中药组。对照组给予基础培养基或成骨诱导培养基,激素组在对照组基础上给予10-5 mol/mL地塞米松,中药组在激素组基础上给予10^(-4) v/v活骨灌注液。MTT法检测细胞活力,qRT-PCR检测成骨分化关键基因RunX2、ALP和Ocn表达,茜素红染色检测钙化,Western blot和免疫荧光检测Sirt1和LC3蛋白表达情况。结果与对照组相比,激素组细胞活力,RunX2、ALP和Ocn mRNA表达,钙化结节数量和Sirt1、LC3-Ⅱ蛋白表达均降低,Sirt1核转移减少,自噬被抑制(P<0.05);与激素组比较,中药组细胞活力,RunX2、ALP和Ocn mRNA表达,钙化结节数量和Sirt1、LC3-Ⅱ蛋白表达均增加,Sirt1核转移增强,自噬被激活(P<0.05)。结论活骨灌注液可促进Sirt1核转移和LC3蛋白介导自噬泡形成使细胞自噬水平增加,拮抗地塞米松对BMSCs活力及成骨分化和钙化的抑制作用。

活骨灌注液不同给药途径对激素性股骨头坏死相关炎性因子表达的影响

目的:观察活骨灌注液不同给药途径对兔激素性股骨头坏死(SONFH)的治疗作用,为临床治疗股骨坏死提供新的治疗方案。方法:雄性新西兰大白兔随机分为空白组(15只)和造模组(60只)。造模组行兔股骨头坏死动物造模后(采用Matsui造模方法,末次腹腔注射用甲泼尼龙琥珀酸钠4周后开始治疗)再随机分为4组:耳缘静脉组(E)、灌胃组(W)、外敷组(F)、模型组(M)各15只。空白组(K)正常饲养,不给予任何药物治疗。耳缘静脉组给予活骨灌注液10 mg/kg,1周2次;灌胃组给予活骨灌注液7.8 mg/kg,每日1次;外敷组给予双后肢上部内侧外敷透皮贴剂,每次7.5 g/贴,每3日1次。治疗12周后,采用苏木精-伊红染色观察股骨头病理学变化及MRI检查证明造模成功,采用ELISA法检测血清IL-1β,IL-6及IL-8水平。结果:ELISA法检测结果:模型组中的IL-1β,IL-6及IL-8含量测定相对正常组有明显增高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,不同给药途径中,IL-1β,IL-6及IL-8蛋白含量均有不同程度的降低,差异有统计学意义(P<0.01)。苏木精-伊红染色观察显示:模型组股骨头软骨膜脱失,骨髓腔内脂肪细胞明显增多,关节腔内水肿,骨内压增高。活骨灌注液组方的不同给药途径均可以不同程度改变股骨头的病理变化,包括软骨层增生、骨小梁结构规整、软骨陷窝数量减少、骨髓腔内脂肪细胞明显减少、水肿及骨内压明显减轻。结论:活骨灌注液不同给药途径均能够对SONFH的病理变化起到治疗作用,活骨灌注液耳缘静脉给药方法对兔SONFH的治疗作用效果显著。

活骨灌注液对激素体外诱导骨髓间充质干细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨活骨灌注液对激素刺激骨髓间充质干细胞(BMSCs)后增殖和凋亡的影响。方法:全骨髓贴壁细胞培养法分离获得大鼠BMSCs并用流式细胞仪鉴定,设置梯度浓度活骨灌注液后通过CCK8法筛选作用终浓度。后将BMSCs分为三组:正常组(常规培养BMSCs)、激素组(BMSCs+1μmol/L地塞米松)和药物组(激素组基础上+活骨灌注液)。采用MTT法检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞凋亡及Western Blot法检测相关凋亡蛋白的表达。结果:流式细胞仪检测CD29、CD90、CD45抗体后明确提取细胞为BMSCs,CCK8筛选出2^(-6)的活骨灌注液为作用终浓度。地塞米松刺激后可抑制BMSCs的增殖并促进其凋亡,但活骨灌注液作用后,可缓解地塞米松的作用(相关检测结果显示P<0.05,差异有统计学意义)。另外Western Blot结果显示,激素组中Bax和Cytochrome C蛋白表达明显升高,Bcl-2表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);而经活骨灌注液处理后,Bax和Cytochrome C蛋白表达明显降低,Bcl-2表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:活骨灌注液可促进地塞米松作用后BMSCs的增殖并抑制其凋亡。

活骨灌注液干预骨坏死的病理形态学、血管新生和成骨分化的实验研究

目的探讨活骨灌注液干预骨坏死的病理形态学、血管新生和成骨分化的实验研究。方法雄性新西兰大白兔随机分为空白组、模型组和活骨组。模型组给予甲基强的松龙和马血清联合诱导骨坏死模型,活骨组在模型组基础上给予活骨灌注液髋关节注射。为了控制变量,其余两组动物均给予等量生理盐水髋关节注射。9周时取股骨头行HE染色观察骨细胞情况,股骨头行蛋白免疫印迹检测血管新生标志物VEGF、IGF-1和骨新生标志物BMP2蛋白表达水平。分离提取骨髓间充质干细胞,随机设立空白组、模型组和活骨组,空白组给予成骨诱导条件培养,模型组在空白组基础上给予10;mol/L的地塞米松;活骨组在模型组基础上给予10;(V/V,原液稀释)活骨灌注液。成骨诱导6天时检测培养液上清ALP活性,qPCR检测成骨标志物RUNX2、ALP和OPG mRNA表达水平;成骨诱导14天时,茜素红染色观察并统计矿化结节数量。结果与空白组比较,模型组骨细胞相对比例、VEGF、IGF-1和BMP2蛋白表达量明显降低(P<0.05),而活骨组较模型组骨细胞相对比例、VEGF、IGF-1和BMP2蛋白表达量明显增加(P<0.05);模型组ALP活性、钙化结节数、RUNX2、ALP和OPG mRNA表达水平均较空白组显著降低(P<0.05),活骨组ALP活性、钙化结节数、RUNX2、ALP和OPG mRNA表达水平均较模型组显著增高(P<0.05)。结论活骨灌注液可能通过促进VEGF和IGF-1蛋白表达来促进血管新生,同时通过促进BMP2蛋白表达和RUNX2、ALP和OPG mRNA表达、增加ALP活性和钙化结节数目来促进骨形成,进而对骨坏死起积极治疗作用。