几种物理因素对北海派琴虫体外培养方法优化的影响

为缩短传统体外培养派琴虫的生长周期(20 d),以北海派琴虫(Perkinsus beihaiensis)为培养对象,探讨了温度、盐度、震荡条件这3种物理因素单独或协同变化下对北海派琴虫的生活史和培养速率的影响。结果显示,在北海派琴虫经过休眠孢子阶段之后,出现一个前游动孢子囊阶段,该阶段以出芽增殖的方式繁殖,繁殖速度十分迅速,但细胞体积较小。体外培养过程中,单一的温度、盐度条件变化对北海派琴虫的培养速率无显著影响,当只添加震荡条件时,北海派琴虫12 d即完成增殖,扩增时间明显缩短、培养速率明显提高。当多个培养条件协同变化下,即温度由35℃降至28℃、盐度35降至25时,北海派琴虫8 d即能完成一个增殖循环,与传统培养方法所需的20 d培养周期相比,大大缩减了培养时间,提高了培养速率。

奥尔森派琴虫和北海派琴虫ITS基因测序及同源性分析

通过设计能扩增奥尔森派琴虫和北海派琴虫ITS序列的特异性引物,对我国东南沿海8个地区养殖牡蛎中常见的两种派琴虫相应基因进行扩增、克隆和测序,并进行同源性分析。国内不同地区奥尔森派琴虫ITS序列的同源性超过99.3%,与国外分离株的同源性也在98.8%以上;种间同源性分析发现,奥尔森派琴虫与海水派琴虫和P.honshuensis的同源性较高,分别为94.2%和95.0%,与P.qugwadi的同源性最低,仅62.9%。深圳和三亚分离的北海派琴虫ITS序列有18个碱基存在差异,其中ITS-1有3个碱基差异,ITS-2有15个碱基差异,而5.8S高度保守,没有碱基差异;北海派琴虫与其他种类之间的差异主要表现在ITS-1和ITS-2区域;同源性比较发现,北海派琴虫的同源性在100%-97.9%之间,其中深圳北海派琴虫的同源性较低,为97.9%。种间同源性分析表明,北海派琴虫与奥尔森派琴虫的同源性较高,为89.4%,其次为海水派琴虫和P.honshuensis,与P.qugwadi同源性最低,仅71.9%。

贝类派琴虫实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

选择派琴虫保守的核糖体DNAITS-2区域设计引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化,建立了实时荧光定量PCR检测派琴虫的方法。所构建方法检测质粒模板DNA的动态范围为2.6×101～2.6×107拷贝,敏感度可检测到26拷贝质粒DNA,而且与包拉米原虫、隐孢子虫等其他寄生性原虫无交叉反应,也不受贝类组织DNA的干扰。利用本研究所建立的方法对来自我国山东、福建等不同沿海海域的30份贝类样品进行检测,检出阳性样品3份。研究表明,本研究所构建的派琴虫实时荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏和特异等优点,可满足国内养殖场及进出口水生动物携带派琴虫的检测需要。

广东近岸海域贝类寄生派琴虫流行病学调查研究

贝类一般在开放式海域养殖,这使得贝类病害防控工作很难开展,因此调查病原流行感染规律对贝类病原的发生、发展和防治尤为重要。文章采用常规PCR技术,调查了广东近岸6个养殖海域5种重要养殖贝类寄生派琴虫的感染情况,分析了贝类寄生派琴虫感染的时空变化情况。结果显示,共检测到2种派琴虫,其中北海派琴虫(Perkinus beihaiensis)总感染率显著高于奥尔森派琴虫(P.olseni)。5种检测的贝类中,除福建牡蛎(Crassostrea angulata)以外,均检测到派琴虫感染,其中香港牡蛎(C.hongkongensis)、杂色鲍(Haliotis diversicolor)感染2种派琴虫,马氏珠母贝(Pinctada martensii)、华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)仅感染奥尔森派琴虫。湛江、阳江、江门等粤西地区派琴虫感染率为17.17%,显著高于汕尾、揭阳、汕头等粤东地区。夏秋季派琴虫的感染率为15.67%,显著高于冬春季。不同海域中,贝类派琴虫的感染受寄主的养殖环境、养殖方式、摄食方式、栖居方式等综合因素影响而使其季节动态呈现不同变化趋势。

同时检测贝类派琴虫和包纳米虫的双重LAMP方法的建立

为满足贝类寄生虫快速检测需求,本研究根据GenBank中发布的派琴虫ITS序列和包纳米虫18SrRNA序列的保守区域分别设计LAMP扩增引物,分别建立了两种寄生虫的单重LAMP检测方法,进一步对反应体系进行优化,组装成两种寄生虫的双重LAMP方法,同时还进行了特异性检测和敏感性检测,并通过对扩增产物进行限制性内切酶酶切检验双重LAMP方法的准确性。结果表明本研究建立的贝类寄生虫双重LAMP方法具有较好的特异性,检测派琴虫时的最低检测限为10拷贝/μL质粒DNA,检测包纳米虫时的最低检测限为100拷贝/μL质粒DNA,同时酶切试验也验证了双重LAMP检测结果的准确性。对随机采自东海和黄海的20份菲律宾蛤仔和10份美国进口牡蛎的检测结果显示,该双重LAMP方法在口岸检疫工作中可以作为派琴虫和包纳米虫的快速检测方法。

贝类派琴虫和折光马尔太虫二重荧光定量PCR方法的建立

根据基因库中派琴虫和折光马尔太虫基因序列,设计了两对特异性引物和两条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测派琴虫和折光马尔太虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对派琴虫和折光马尔太虫的检测敏感性达到40个模板拷贝数;对派琴虫和折光马尔太虫不同浓度模板进行组合,该方法仍可有效地同时检测出这二种原虫。研究建立的派琴虫和折光马尔太虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床上派琴虫和折光马尔太虫感染的检测。

贝类派琴虫PCR检测方法的建立及初步应用

根据派琴虫的基因保守序列设计了特异性引物,对派琴虫的DNA进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序。结果表明,扩增大小为596bp,与预期扩增序列同源性为99.8%。该PCR方法检测灵敏度高,最低可检测1pg的派琴虫DNA;特异性强,对荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌、葡萄球菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、诺瓦克样病毒等贝类病原体的扩增均为阴性。用该PCR技术对广西沿海的104份牡蛎、49份贻贝和20份文蛤病料进行检测,阳性率分别为14.6%、10.6%和15.0%。结果显示,派琴虫广泛存在于中国南方沿海的养殖贝类中,建立的PCR方法可用于贝类派琴虫的临床快速检测。

贝类派琴虫和单孢子虫双重PCR检测方法的建立

根据基因库中派琴虫和单孢子虫的基因序列,分别设计了2对特异性引物,通过对双重PCR扩增条件的优化,建立了可同时检测鉴别这2种原虫的双重PCR。对同一样品中的派琴虫和单孢子虫模板进行扩增,结果均同时得到2条大小与试验设计相符的596bp(派琴虫)和244bp(单孢子虫)的特异性扩增带,对其他贝类病原核酸的扩增结果为阴性。敏感性试验结果表明,最低能检测到10pg的派琴虫和单孢子虫DNA。用该双重PCR对广西沿海的104份牡蛎、49份贻贝和20份文蛤病料进行检测,派琴虫的阳性率分别为14.6%,10.6%和15%,而未检出单孢子虫,结果提示派琴虫广泛存在于中国南方沿海的养殖贝类中,建立的PCR方法可以用于贝类派琴虫和单孢子虫的临床快速检测。

同时检测海洋贝类包纳米虫和派琴虫的双重TaqMan MGB探针实时荧光PCR方法

根据包纳米虫(Bonamia sp.)SSU rDNA和派琴虫(Perkinsus sp.)ITS rDNA的保守区序列,设计特异性引物和Taqman MGB探针,建立了同时检测上述两种贝类原虫的双重实时荧光PCR方法.该方法可检测到包纳米虫基因的446拷贝质粒,以及派琴虫基因的171拷贝质粒,具有较高的灵敏度.以10倍系列稀释的包纳米虫阳性标准品质粒和派琴虫阳性标准品质粒为模板,测得该方法的定量标准曲线相关系数分别为0.999和1.000,显示出很好的扩增效率.同时该方法与尼氏单孢子虫(Haplosporidium nelsoni)、沿岸单孢子虫(H.costale)等其他贝类原虫,以及副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和鮰爱德华氏菌(E.ictaluri)等海水养殖常见致病菌之间无交叉反应,表现出较高的特异性.福建莆田的湄州湾、平海湾、兴化湾等地采集的296份贝类临床样本的检测证明,该方法是一种有效的快速检测鉴定上述2种贝类原虫的方法,具有良好的灵敏度和特异性,可广泛应用于海洋贝类原虫感染情况调查,以及贝类疫病检疫监控等领域.

贝类派琴虫原位杂交检测方法的建立与应用

本研究选择派琴虫特异性引物PerkITS85和PerkITS750的PCR扩增产物进行地高辛标记制备探针,探索建立了派琴虫的组织切片原位杂交检测方法,并应用该方法检测我国黄海海域采集的贝类样品。研究结果表明,PerkITS85和PerkITS750的PCR扩增产物大小为673bp,利用随机引物扩增法制备的派琴虫地高辛标记探针特异性好,与包纳米虫和尼氏单孢子虫均无交叉反应。以世界动物卫生组织(OIE)推荐的瑞氏液体羟基乙酸盐(RFTM)培养法为金标准对本研究建立的原位杂交检测方法进行评价,其诊断敏感性(Dse)为90.9%,诊断特异性(Dsp)为100%。实际检测应用表明本研究所建立的派琴虫原位杂交检测方法是一种有效的派琴虫检测方法,可以应用于派琴虫病的检测。

贝类派琴虫和折光马尔太虫二重PCR方法的建立

根据基因库中派琴虫和折光马尔太虫的基因序列,分别设计了二对特异性引物,通过对二重PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时检测鉴别这二种原虫的多重PCR。该技术对同一样品中的派琴虫和折光马尔太虫模板进行扩增,结果均同时得到2条大小与实验设计相符的596bp(派琴虫)和478bp(折光马尔太虫)的特异性扩增带,而对单孢子虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的扩增,结果全为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到10pg的派琴虫和折光马尔太虫DNA。用该二重PCR对广西沿海的119份牡蛎样品进行检测,结果派琴虫和折光马尔太虫的阳性率分别为9.24%和1.68%,提示了中国南方沿海的养殖贝类中存在派琴虫和折光马尔太虫的感染。

贝类派琴虫LUX荧光PCR检测方法的建立

为满足贝类派琴虫病的快速检测需要,本研究选择派琴虫保守的核糖体DNAITS-2区域设计引物,通过对反应体系和反应条件的优化,首次建立了LUX荧光PCR检测派琴虫的方法。试验表明,所建立方法检测质粒模板DNA的动态范围为1.0×101-1.0×108,敏感性为10拷贝质粒DNA。采用模拟阳性样品试验,可检测到100拷贝质粒DNA。而且与贝类的包拉米原虫、隐孢子虫等其它寄生性原虫无交叉反应,也不受组织DNA的干扰。50份采集样品的检测结果与RFTM培养方法一致。本研究所构建的派琴虫LUX荧光PCR检测方法具有快速、灵敏、特异等优点,可满足国内养殖场及进出口水生动物携带派琴虫的检测需要。

贝类奥尔森派琴虫可视化LAMP检测技术的建立与应用

根据环介导等温扩增(LAMP)技术原理,针对奥尔森派琴虫(Perkinsus olseni)的5.8 S核糖体RNA与内转录2间隔区序列,设计了6条特异性LAMP扩增引物,分别为两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。通过对反应条件的优化,建立了一种适用于贝类奥尔森派琴虫的可视化LAMP检测技术。该技术只对奥尔森派琴虫发生扩增反应,产生黄绿色荧光扩增产物,对其他对照DNA样品无扩增反应,不产生黄绿色荧光。对F3和B3外引物扩增产物进行测序分析,其序列与Gen-Bank中奥尔森派琴虫序列一致,检测结果具有高度特异性。对奥尔森派琴虫质粒DNA的最低检测量为100 fg。用该项LAMP技术与OIE公布的派琴虫PCR检测技术分别对50份分别来自华东及华南沿海地区的牡蛎样品进行检测,同时对PCR阳性样品进行测序分析。结果 LAMP检测到2份奥尔森派琴虫,PCR方法检测到9份派琴虫。测序分析结果表明,PCR方法检测到的9份派琴虫阳性样品中有2份为奥尔森派琴虫,其结果与LAMP检测结果相符,说明该技术适用于贝类样品奥尔森派琴虫的检测。

贝类派琴虫二温式PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中派琴虫的基因保守序列,设计了一对特异性引物,通过对二温式PCR扩增条件的优化,研究建立了检测贝类派琴虫的二温式PCR方法。该方法对派琴虫模板进行扩增,得到与试验设计相符的276bp的特异性扩增带,而对马尔太虫、单孢子虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌等病原体的扩增,结果全为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到1fg的派琴虫质粒DNA。用该二温式PCR对贝类样品进行检测,结果从广西的牡蛎检出派琴虫27份,连云港的菲律宾蛤仔检出派琴虫12份,温州的溢蛏中检出6份,结果提示,建立的半套式PCR方法可以用于贝类派琴虫的临床快速检测。

贝类派琴虫半套式PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中派琴虫(Perkinsus sp.)的基因组序列,设计了3条特异性引物Perkinsus303-1、Perkinsus303-2和Perkinsus209-1,建立了检测贝类派琴虫的半套式PCR方法。该方法对派琴虫检测得到209 bp的特异性扩增带,检测灵敏度达到0.01 fg的派琴虫质粒DNA。用该半套式PCR对临床样品进行检测,结果表明广西牡蛎、连云港的菲律宾蛤仔和温州溢蛏存在派琴虫感染,说明建立的半套式PCR方法可以用于贝类派琴虫的临床快速检测。

贝类包拉米虫和派琴虫二重荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中包拉米虫和派琴虫保守基因序列,用Primer Express3.0软件设计合成了两对引物和两条TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测包拉米虫和派琴虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对包拉米虫和派琴虫的检测敏感性达到200个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对包拉米虫和派琴虫不同模板浓度进行组合,仍可有效同时检测到这两个原虫。该方法对单孢子虫、马尔太虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌等病原体的检测,结果全为阴性。研究建立的包拉米虫和派琴虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于贝类包拉米虫和派琴虫感染的检测。

贝类派琴虫和单孢子虫二重荧光定量PCR方法的建立

根据基因库中派琴虫和单孢子虫基因组的保守序列,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能够同时检测派琴虫和单孢子虫的二重荧光定量PCR方法。该方法特异性好,对派琴虫和单孢子虫的检测敏感性分别达到400和40个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对派琴虫和单孢子虫不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测这2个原虫。对广西沿海的49份贻贝病料进行检测,结果派琴虫阳性率为16.3%,检测的派琴虫含量为2.38×106～9.21×102拷贝/μL;提示派琴虫广泛存在于中国南方沿海的养殖贝类中,建立的荧光定量PCR方法可以用于贝类派琴虫的临床快速检测。该方法对单孢子虫检测的敏感性比派琴虫高,而49份贻贝病料未检出单孢子虫,提示需要进行更多临床样品的检测。

三种贝类原虫多重PCR检测方法的建立

根据基因库中单孢子虫、派琴虫和马尔太虫的基因序列,分别设计了3对特异性引物,通过对多重PCR扩增条件的优化,建立了可同时检测鉴别这3种原虫的多重PCR方法。用该技术对同一样品中的单孢子虫、派琴虫和马尔太虫模板进行扩增,结果均同时得到3条大小与试验设计相符的244 bp(单孢子虫)、596 bp(派琴虫)和478 bp(马尔太虫)的特异性扩增带,对其他贝类病原核酸的扩增结果为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到10 pg的单孢子虫、派琴虫和马尔太虫DNA,提示该技术适用于这3种原虫的临床快速检测和鉴别诊断。

中国沿海主要养殖贝类四种原虫病流行病学的调查研究

为全面系统了解中国沿海主要养殖贝类4种原虫病的分布和流行状况,本研究从2006年10月到2012年10月的6年间,在中国主要贝类养殖海区采集牡蛎、文蛤和扇贝等11种养殖贝类331批共11291份,并对其四种原虫的感染情况进行检测和调查。结果显示,4种原虫的感染率累计为15.28%(1725/11291),其中感染率最高的为派琴虫(9.98%)(1127/11291),其次为尼氏单孢子虫(3.99%)(451/11291),最低为折光马尔太虫(1.30%)(147/11291),未检出包拉米虫的感染。在单个的牡蛎、花甲螺、菲律宾蛤仔、扇贝、溢蛏和血蛤中,存在多种原虫混合感染的现象,混合感染率为6.78%(117/1725),其它贝类均为单一感染,感染率为93.22%(1608/1725)。调查结果还表明,中国不同海域和不同品种的牡蛎,尼氏单孢子虫和派琴虫的感染率存在明显差异。该调查结果将为中国贝类养殖原虫病的防治提供重要的科学依据。