猪流产嗜性衣原体omp-1基因噬菌体疫苗免疫效果评价

本试验对猪流产嗜性衣原体omp-1基因噬菌体DNA疫苗进行了免疫效果评价。将猪流产嗜性衣原体omp-1基因插入λNM1149噬菌体载体构建成DNA疫苗,筛选获得阳性噬斑;使用重组的噬菌体疫苗按250 ng/只分别在第2、16和30天三次免疫Balb/c小鼠,以1B弱毒活疫苗(10μg/只)、噬菌体空载体(250 ng/只)为对照组。免疫后分别以ELISA法测定小鼠抗体以及MTT法检测淋巴细胞刺激指数。结果表明重组λ-MOMP噬菌体疫苗虽然未能在短期内(免疫第29天)激发高水平的抗体(1B组免疫第29天抗体D450=0.347,重组噬菌体组免疫第29天抗体D450=0.19;1B组免疫第43天抗体D450=1.12,重组噬菌体组免疫第43天抗体D450=0.38),但能诱导抗体水平逐渐升高(重组噬菌体组免疫前D450=0.086,免疫第29天抗体D450=0.19,免疫第43天抗体D450=0.38),而且显著性诱导T淋巴细胞的增殖(1B组免疫第29天SI=11.67,重组噬菌体组免疫第29天SI=15.8)。相反弱毒疫苗1B株能激发高水平的抗体,但细胞增殖指数显著低于噬菌体疫苗(1B组免疫第29天细胞增殖指数SI=11.67,重组噬菌体组免疫第29天细胞增殖指数SI=15.8)。试验显示λNM1149噬菌体载体具有潜在增强猪流产嗜性衣原体omp-1基因的免疫效果。

猪流产嗜性衣原体omp-1基因的重组质粒与重组蛋白免疫组合效果

为增强猪流产嗜性衣原体omp-1基因的免疫措施进而筛选出高效新型分子疫苗,本实验将猪流产嗜性衣原体omp-1基因克隆入pcDNA3.1(+)载体构建DNA疫苗,初次和二次免疫分别以核酸/重组蛋白(DNA/r-MOMP)、重组蛋白/核酸(r-MOMP/DNA)、重组蛋白+核酸/重组蛋白+核酸(r-MOMP+DNA/r-MOMP+DNA)、核酸+核酸(DNA/DNA)和重组蛋白+重组蛋白(r-MOMP/r-MOMP)5种组合接种BALB/c小鼠,同时以载体和弱毒为对照。二次免疫后14 d以ELISA和T淋巴细胞增殖实验检测特异性体液免疫和细胞免疫应答水平。结果显示核酸与重组蛋白同时免疫可以诱导产生较高的体液免疫和细胞免疫水平,而DNA/r-MOMP组合的细胞免疫和体液免疫水平高于r-MOMP/DNA组合,单独免疫DNA组或r-MOMP都不能获得好的细胞和体液免疫。

基于重组外膜蛋白的猪流产嗜性衣原体病抗体ELISA检测方法的建立

为建立检测流产嗜性衣原体(C.abortus)抗体的快速检测方法,本研究以纯化的重组表达C.abortus主要外膜蛋白(MOMP)为包被抗原,采用方阵法确定包被抗原和待检血清的最佳工作浓度,对反应条件进行优化,建立了C.abortus抗体的间接ELISA检测方法。该方法与猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒阳性血清均无交叉反应;该方法检测稀释800倍的C.abortus阳性血清仍呈阳性;批内和批间变异系数均小于10%。采用所建立的ELISA方法与间接血凝(IHA)方法分别对62份临床血清样品进行检测,阳性率分别为83.87%(52/62)和70.97%(44/62),符合率为87.09%(54/62)。由此表明,本实验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,适于C.abortus流行病学调查。

羊流产嗜性衣原体蛋白-蛋白相互作用网络的构建

病原菌的相互作用组学研究是揭示潜在信号转导通路和新型药物靶标的有力工具。通过同源蛋白映射的方法构建了羊流产嗜性衣原体(Chlamydia abortus)的蛋白-蛋白相互作用网络。结果表明,所构建的互作网络包含220个蛋白和1276个相互作用关系。通过分析蛋白的互作频率,确定了在羊流产嗜性衣原体中互作频率最高的20个蛋白,主要与转录、翻译、分子伴侣等功能相关。进一步分析发现,伴侣蛋白DnaK、GroEL、DnaJ发生互作的频率较高,能与核糖体蛋白、代谢相关蛋白等多种功能蛋白发生相互作用。若DnaK、GroEL、DnaJ的功能受到抑制,将会对羊流产嗜性衣原体的正常生命活动造成较大的影响。

羊流产嗜性衣原体MOMP基因的克隆及序列分析

为探讨羊流产嗜性衣原体MOMP蛋白的生物学功能、揭示其在流产衣原体病诊断和防治中的作用。本试验根据Gen Bank公布的流产嗜性衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因序列,设计并合成4条特异性引物,以羊流产嗜性衣原体青海分离株感染的鸡胚卵黄囊中提取的衣原体基因组为模板,应用套式PCR扩增到MOMP全基因序列。通过生物信息学软件对该基因的结构及其推导的氨基酸序列进行了预测分析,同时分析了与其他流产嗜性衣原体的同源性。结果显示,该基因全长1 170 bp,可编码389个氨基酸,蛋白分子量理论值为41.8 ku,理论等电点7.54,编码蛋白理化性质较稳定。其第1位到第19位氨基酸残基为信号肽序列,具有3处N-糖基化位点。含有多个能被其他酶修饰的位点,以无规则卷曲为主,含5个跨膜区,3个亲水性较强的抗原表位。同源性分析表明与其他流产嗜性衣原体分离株的一致性高在93%以上,系统进化分析表明与OCLH196株(序列号为AJ440239)位于同一进化分支。

猪流产嗜性衣原体MOMP基因的克隆及原核表达

【目的】克隆猪流产嗜性衣原体青海株主要外膜蛋白(Major outer membrane protein,MOMP)基因,并进行序列分析及原核表达。【方法】根据GenBank公布的猪流产嗜性衣原体MOMP基因的核苷酸序列,设计并合成4条特异性引物,用套式PCR方法扩增猪流产嗜性衣原体青海株MOMP基因,将其克隆入pMD18-T载体中,进行测序及序列分析。然后将MOMP基因亚克隆入原核表达载体pGEX4T-1中,在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测。【结果】扩增到猪流产嗜性衣原体青海株1170bp的MOMP全长基因。序列分析结果表明,该基因与已发表的猪流产嗜性衣原体B11001株和CP/12株核苷酸同源性均为99.7%。SDS-PAGE电泳可检测到分子质量约为66ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在。Western-blot分析表明,重组蛋白可被猪流产嗜性衣原体抗体识别。【结论】成功克隆了猪流产嗜性衣原体青海株MOMP基因,并进行了原核表达,表达的蛋白具有抗原活性。

猪流产嗜性衣原体POMP90蛋白的原核表达及反应原性分析

设计特异性引物进行PCR扩增,获得猪流产嗜性衣原体CP/12株的pomp90基因,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-KG中。阳性重组质粒转化原核表达宿主菌E.coliBL21,用IPTG进行诱导表达,获得高效表达的融合蛋白。采用Western-blot和间接ELISA检测表明纯化的重组蛋白具有良好的反应原性,初步选择其最佳包被浓度为1μg/mL。

猪流产嗜性衣原体病诊断方法研究进展

猪流产嗜性衣原体病是引起母猪流产,产弱胎、死胎的重要传染病之一,严重危害养猪业的健康发展。正确诊断对防制该病极为关键。本文就该病的病原学诊断、血清学诊断、分子生物学诊断方法进行了综述。

流产嗜性衣原体MIP蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定

为制备抗流产嗜性衣原体MIP蛋白单克隆抗体,以纯化的重组MIP蛋白为抗原,免疫Balb/c小鼠后经细胞融合,间接ELISA法筛选阳性细胞克隆并进行有限稀释克隆化,建立了两株分泌抗MIP蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,将其分别命名为M1,M2。间接ELISA测杂交瘤细胞上清抗体效价为1∶1600、相对亲和力为10μg/m L;Western blot鉴定两株单克隆抗体能特异识别MIP重组蛋白;细胞核型实验鉴定单抗符合杂交瘤细胞的特性;单克隆抗体亚类检测试剂盒鉴定两株单抗免疫球蛋白类型均为Ig G1,轻链为κ链;体外中和试验表明,两株单抗均能有效阻断感染。抗MIP单克隆抗体的成功制备将为建立诊断、治疗方法及MIP蛋白的进一步研究奠定基础。

云南流产山羊中检出流产嗜性衣原体与Q热立克次氏体混合感染

建立山羊流产嗜性衣原体与Q热立克次氏体基因组DNA特异扩增检测方法,对云南省河谷地区可疑流产病料时行病原检测并最终证实病原的存在,在此基础上了解病原的进化。获得特异基因产物完成测序验证后递交GenBank,能过BLAST初步分析后调取相关基因,应用DNAstar5.0计算序列间的相似性,计算遗传距离,应用MEGA5.2软件进行比对并构建系统发育树,进行聚类分析。云南流产嗜性衣原体KR778870与有参考序列的衣原体毒株比较其核苷酸同源性均为100%,属同一基因型,与鹦鹉热衣原体同源率最高为94.9%;Q热立克次氏体云南毒株KR697576与纳米比亚毒株CP007555同源性为100%,其次美国毒株为CP00102同源率99.7%,台湾株EU000273为99.4%,同源率最低的毒株EU009657仅为42.6%。通过基因特异性PCR确定流产山羊中检测到流产嗜性衣原体及Q热立克次氏体,流产嗜性衣原体PMP基因无变异,Q热立克次氏体TransⅢ基因则有一定的变异。

羊流产嗜性衣原体MOMP基因的克隆与原核表达

为了对羊流产嗜性衣原体MOMP基因片段进行原核表达,试验采用PCR方法扩增出去信号肽序列的MOMP基因片段,将其克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,转化E.coli感受态细胞BL21(DE3),用IPTG诱导表达该基因片段,并对重组质粒表达产物进行Western-blot检测。结果表明:重组质粒pGEX-4T-MOMP构建成功,并成功表达出蛋白质相对分子质量约为66 ku的重组质粒表达产物,该重组质粒表达产物主要以包涵体形式存在;经Western-blot检测,该重组质粒表达产物可与羊流产嗜性衣原体阳性血清反应。说明试验成功表达了羊流产嗜性衣原体MOMP基因片段。

流产嗜性衣原体1B株pomp18基因β折叠区的克隆与表达

为探索POMP18蛋白的生物学功能、揭示其在流产衣原体病诊断和防治中的作用,本试验依据流产嗜性衣原体S26/3株全基因序列设计引物,用PCR法扩增流产衣原体pomp18基因β折叠区,将特异性扩增片段克隆入pMD18-T载体,测序比较分析序列后确认为目的基因,提交GenBank(Accession EU326104)。与GenBank中流产嗜性衣原体S26/3株的pomp18基因和氨基酸序列的相似性均达99%,与其他各型衣原体代表株的相似性为79%~80%。将pomp18基因β折叠区亚克隆到pET-32a(+)表达载体上,重组表达载体转化BL21(DE3)表达宿主菌,以IPTG诱导该重组菌,结果显示该重组菌表达了59 kD大小的融合蛋白;用羊流产嗜性衣原体多克隆抗体对表达的重组蛋白进行Western blotting试验,结果显示该重组蛋白具有免疫原性。本研究首次克隆、表达了流产衣原体pomp18基因β折叠区,原核表达获得了59 kD重组蛋白,为进一步探讨其生物学功能奠定基础。

猪源嗜性衣原体HB1043株主要外膜蛋白(MOMP)基因的分析及重组表达

根据GenBank中衣原体主要外膜蛋白(MOMP)全基因序列设计特异性引物,以临床分离的衣原体病原中提取的衣原体全基因组为模板,利用特异性引物PCR扩增得到MOMP全基因序列。通过BLAST比对,结果显示其与已提交的猪流产衣原体CG1株的MOMP序列(EU531729)有1个碱基不同。根据对测序结果进行信号肽序列预测及内切酶位点分析,选用BamHⅠ和SalⅠ双酶切将目的蛋白序列克隆到表达载体pET-28a上,得到重组质粒pET-28a-MOMP。将重组质粒转化入E.coli BL21进行表达,表达产物使用镍离子亲和层析柱进行纯化得到目的蛋白rMOMP。目的蛋白经Western-blot检测,证明其具有免疫学活性。