新疆伊犁地区马鼻肺炎、马腺疫、马流产沙门菌病的血清学调查

为了解新疆伊犁地区的马鼻肺炎、马腺疫及马流产沙门菌病的流行现状和特点,本研究从新疆伊犁地区养马最为集中的10个乡镇和3个国有马场采集了818份血清样品。分别采用ELISA法和微量凝集法进行马疱疹病毒(EHV)、马腺疫链球菌(S.equi)和马流产沙门菌(S.abortus)的抗体检测,并应用统计学方法从年龄、性别、地域及养殖规模等方面对影响这3种病感染的风险因素进行了分析。检测结果显示该地区EHV抗体阳性率为28.85%,S.equi抗体阳性率为24.69%,S.abortus抗体阳性率为25.31%。性别和年龄对马鼻肺炎感染影响显著(p<0.05)。地域和年龄对马链球菌抗体阳性率的影响显著(p<0.05);地域对马流产沙门菌抗体阳性率的影响显著(p<0.05)。马疱疹病毒(EHV)和马腺疫链球菌(S.equi)的混合感染率较高。本研究为新疆地区马的这3种传染病有效防控提供了调查数据。

马流产沙门菌鞭毛蛋白FliC对马腺疫链球菌SeM蛋白免疫效应分析

为研究马流产沙门菌(Salmonella abortus equi)鞭毛蛋白FliC对马腺疫链球菌(Streptococcus equi subsp.equi)SeM蛋白免疫效果的增强效应,为马腺疫新型高效疫苗的研发奠定基础。本研究构建并诱导表达了FliC,经亲和层析纯化目的蛋白,Western blot检测其免疫原性。将该纯化后FliC与SeM蛋白联合免疫C57BL/6小鼠,免疫后对小鼠进行抗体水平、抗体类型和攻毒保护力的检测。结果表明,成功表达、纯化了FliC重组蛋白,SDSPAGE电泳检测显示该蛋白质为52ku。抗体分型检测结果显示产生的抗体主要以IgG1为主;免疫30d后FliC+SeM免疫组的攻毒保护率为87%,高于SeM免疫组的保护率67%。马流产沙门菌来源的鞭毛蛋白FliC能够增强SeM蛋白的免疫保护效果,该结果为进一步更好地利用SeM蛋白奠定了基础。

马流产沙门菌fimY基因同源性分析及蛋白表达

为对马群中沙门菌进行快速、准确检测,根据GenBank公布的沙门菌菌毛蛋白fimY基因为模板设计一对特异性引物,用PCR方法扩增fimY部分基因。将fimY目的基因亚克隆至PGEX-4T-2原核表达载体,转入BL21(DE3)感受态细胞后用IPTG进行诱导表达,并对目的蛋白进行反应性检测。结果表明,克隆fimY基因大小为490bp;成功构建fimY原核表达载体PGEX-fimY,经SDS-PAGE显示带有GST标签的目的蛋白大小为47ku,与预期相符;Western blot证明,目的蛋白fimY能够结合沙门菌标准阳性血清,为建立马流产沙门菌间接ELISA检测方法奠定了基础。

宁夏奶牛流产沙门菌的分离与鉴定

为了查明引起奶牛发生不育、胚胎早期死亡及流产的原因,试验采集6份流产胎儿肝脏、脾脏、肾脏及真胃内容物作为病料进行了病原的分离与鉴定,并对分离菌株进行了药敏试验。结果表明:共分离到4株致病菌,在实验室经微生物学诊断和鉴定证实其中3株菌为流产沙门菌;分离菌对环丙沙星、氟苯尼考、阿奇霉素呈现高度敏感。

马流产沙门菌噬菌体vB-SabS-Sds2的分离鉴定及生物学特性

为探究治疗驴沙门菌病的新方法,以驴源马流产沙门菌为宿主菌,利用双层平板法进行沙门菌烈性噬菌体的分离鉴定及生物学特性研究。结果分离到1株长尾噬菌体vB-SabS-Sds2,对3株驴源马流产沙门菌裂解率为100%,对17株鸡白痢沙门菌裂解率为6%。最佳感染复数为0.000 1,噬菌体效价达3.23×109 PFU/mL。该噬菌体潜伏期为10 min,爆发期为30 min,爆发量为8.6 PFU/cell,对氯仿不敏感,对紫外线较为敏感,在高温及pH 3~13环境中均有较高活性。结果表明噬菌体vB-SabS-Sds2作为1株烈性噬菌体对驴源马流产沙门菌具有广泛的裂解能力,具有较强的特异性和抵抗力。本试验为驴沙门菌病的噬菌体治疗提供了科学依据。

新疆地区2株驴源马流产沙门菌的分离鉴定及致病性分析

【目的】研究确定导致新疆地区2个规模化驴场出现流产的疑似病原沙门菌,并探究其致病能力和耐药性情况。【方法】通过细菌分离培养、形态学观察、生化试验对分离菌进行了鉴定,并对分离菌的鞭毛基因FliC进行了PCR扩增及序列分析,通过致病性测定、荷菌量检测及病理组织学观察,鉴定和分析了分离菌的致病性,并通过药敏试验分析其耐药性。【结果】通过细菌分离培养、形态学观察、生化试验,确定分离到的2株细菌均为马流产沙门菌,分别命名为G1-1和XD1-2。对这2个分离株的鞭毛基因FliC的遗传进化分析结果显示,2株分离菌FliC氨基酸序列之间的相似性为99.0%,2株分离菌FliC氨基酸序列与爱尔兰马源马流产沙门菌分离株Ireland-HE801373、Ireland-HE801378株相似性均最高,且均为99.3%;分离株G1-1与爱尔兰马源马流产沙门菌分离株Ireland-HE801373和Ireland-HE801378及国内马源马流产沙门菌分离株China-KJ486797.1和China-KJ486769.1亲缘关系较近,分离株XD1-2则与美国肠炎沙门菌分离株USA-EBQ1214032.1亲缘关系较近,相似性分析与进化树结果一致。小鼠致病性试验显示,2株分离菌对小鼠的毒性均较强且致病性存在差异,XD1-2对小鼠的致病性强于G1-1。分离菌G1-1对9种抗菌药物耐药,对11种抗菌药物敏感。分离菌XD1-2对11种抗菌药物耐药,对5种抗菌药物敏感。【结论】本试验成功分离到2株驴源沙门菌,不同养殖场来源的驴源沙门菌的致病能力和耐药性有一定差异,对鞭毛基因FliC的进化分析也显示出差异,本研究结果为驴源沙门菌的防治提供了一定的参考依据。

马流产沙门菌鞭毛蛋白FljB的表达及对小鼠免疫效果的分析

为评价马流产沙门菌来源的鞭毛蛋白FljB（flagellinB）的免疫原性及免疫效果，本试验通过PCR扩增该菌的鞭毛蛋白基因FljB，构建重组质粒pET28a—FljB，并用表达纯化的重组蛋白FbB免疫小鼠。结果显示，该重组蛋白大小约为41300。该蛋白能够诱导小鼠产生较高的体液免疫水平，二免后小鼠血清中抗体水平可达1：21500。该蛋白免疫后对小鼠的攻毒保护力为75％。本试验结果为进一步利用该蛋白进行马相关传染病的预防与控制奠定基础。

ELISA和微量凝集法检测马流产沙门菌血清抗体的比较

为比较微量凝集(MSAT)和间接ELISA方法检测马流产沙门菌血清抗体的检出率和符合率,本试验分别用全菌包被间接ELISA、MSAT法对采集的191份马血清及标准阴阳性血清进行马流产沙门菌抗体的检测,并对两种方法进行比较分析。MSAT法和间接ELISA法的阳性检出率分别为45.03%和47.12%,MSAT法与间接ELISA法的符合率为89%。MSAT法不需要精密的仪器,便于操作,操作周期短,但存在观察时的人为误差;间接ELISA具有较高的敏感性、特异性和准确性。在实践中可以将两种方法相结合使用。

沙门菌马流产凝集试验阳性血清国家参考品的制备及标定

为研制沙门菌马流产凝集试验阳性血清国家参考品,以提高沙门菌马流产凝集试验抗原国家参考品、抗原及阳性血清国家参考品、阳性血清的半成品和成品检验的可靠性和可重复性,本研究按照沙门菌马流产凝集试验阳性血清制备的现行标准及标准物质研究的相关规定,规范了沙门菌马流产凝集试验阳性血清参考品的制备及检定方法。用沙门菌马流产凝集试验抗原国家参考品测定阳性血清效价,将血清稀释至1∶1600、1∶3200、1∶6400,分别准确定量分装后,按照特定的冻干曲线冻干,分别用抗原国家参考品测定冻干血清的效价,测定3种效价血清的均一性和稳定性,将阳性血清国家参考品应用于生产检验。结果表明,该参考品均一性良好,在有效期内效价稳定,可以作为国家参考用品应用。

驴源马流产沙门菌的耐药表型及毒力基因检测

为了解驴源马流产沙门菌临床分离株的耐药表型及毒力基因的携带情况,本试验通过K-B药敏纸片扩散法对9株马流产沙门菌进行11种临床常用抗菌药物的敏感性测试,采用PCR方法检测与沙门菌致病性相关的10种毒力基因。结果显示:9株驴源马流产沙门菌存在2种耐药表型,对链霉素耐药率达100%,对阿莫西林耐药率为33%;10种毒力基因中仅traT未被检出,invA、avrA、ssaQ、mgtC、sopB、spvC、spvR、pefA和misL的检出率均为100%。结果表明,驴源马流产沙门菌耐药谱较为单一,但携带的毒力基因为多样性组合。

马流产沙门菌双重PCR检测方法的建立

为建立一种检测马流产沙门菌的双重PCR方法,以实现对驴场中马流产沙门菌和其他血清型沙门菌感染的快速检测。首先针对马流产沙门菌Ⅰ相鞭毛基因FliC和沙门菌保守毒力基因invA分别设计引物,建立单特异性PCR方法,在此基础上建立双重PCR,并对该双重PCR方法进行特异性、敏感性检测。同时利用该双重PCR方法对临床样品进行检测,通过符合率比较验证该方法的实用性。结果显示,马流产沙门菌能分别扩增出针对特异基因的747 bp的目的条带和针对保守基因的175 bp的目的条带,其他血清型沙门菌只能扩增出针对保守基因的175 bp的目的条带,非沙门菌均无扩增条带;对模板DNA的最低检出限为34.8 pg;利用建立的双重PCR方法对186份临床样品进行检测,结果显示,与细菌分离培养方法和单重PCR方法的符合率均为100%。说明本试验建立的双重PCR方法特异性强、灵敏性高。该方法的建立为马流产沙门菌的快速检测提供了有力的技术支撑。

马流产沙门菌重组鞭毛蛋白FliC和FljB免疫原性比较

为评价与比较马流产沙门菌(Salmonella abortus equi)2种不同鞭毛蛋白FliC(Flagellin C)和FljB(Flagellin B)的免疫原性,为进一步利用这两种蛋白奠定实验基础,本研究诱导表达及纯化FliC和FljB蛋白,将纯化后的蛋白分别免疫小鼠,对免疫后小鼠的抗体水平、滴度及抗体亚型进行检测,攻击小鼠后进行免疫相关受体检测及病理组织学观察。结果显示,成功诱导表达了重组蛋白FliC和FljB,纯化后蛋白的相对分子量分别为52 kDa和42 kDa。两种蛋白分别免疫小鼠,产生较高水平的特异性抗体IgG,FljB免疫组抗体水平高于FliC免疫组,且抗体亚型以IgG1为主。FljB免疫组攻击保护率为87.5%,高于FliC免疫组的75%,病理组织学及脏器荷菌数检测结果显示,FljB免疫组效果优于FliC免疫组;FljB免疫组诱导TLR2、TLR4、MHC-I、TCR(T细胞抗原受体)的水平均高于FliC免疫组。该结果表明,FljB免疫组诱导小鼠免疫应答的水平高于FliC免疫组。

马流产沙门菌鞭毛重组蛋白FliC的原核表达及对小鼠的免疫保护试验

为研究马流产沙门菌新疆分离株鞭毛蛋白FliC(flagellin C)的免疫生物学特性及保护特性。本研究利用PCR技术扩增获得该菌的Fli C基因,并将其连接到原核表达载体p ET-28a(+)上,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,用IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE和Western-blot检测与分析表达蛋白,并将纯化的重组蛋白免疫小鼠。结果显示,成功诱导表达了52 ku的重组蛋白,该蛋白第2次免疫小鼠第14天时血清中的特异性Ig G抗体效价可达1∶72 900,且抗体亚型以Ig G1为主,免疫小鼠的攻击保护率可达73%。结果表明,Fli C重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护效果。为进一步开展马流产沙门菌亚单位疫苗的研究奠定了基础。

基于新型佐剂的驴流产沙门菌病-兽疫链球菌病二联灭活苗的制备及其安全性和免疫原性

旨在研制预防以马流产沙门菌(S.abortus equi)和马链球菌兽疫亚种(SEZ)感染引起的孕驴流产和新生驴驹腹泻的驴流产沙门菌病-兽疫链球菌病二联灭活疫苗,并进行安全性与免疫原性评价。从山东某驴场分离和鉴定出的S.abortus equi、SEZ分离株为疫苗候选菌株,经甲醛灭活,分别与氢氧化铝佐剂和角鲨烯佐剂制备驴流产沙门菌病-兽疫链球菌病二联灭活苗。首先,检测灭活疫苗对BALB/c小鼠的安全性,比较2种不同佐剂诱导免疫保护的效果;以驴流产沙门菌病-兽疫链球菌病二联角鲨烯佐剂灭活疫苗免疫驴,凝集试验检测免疫血清的总抗体水平及血清杀菌试验检测功能性抗体水平,进一步评价二联灭活疫苗的免疫原性。结果显示,以氢氧化铝佐剂二联灭活苗免疫对5倍LD_(50)S.abortus equi和SEZ攻击BALB/c小鼠的保护率分别达到62.5%(5/8)和75.0%(6/8),而角鲨烯佐剂二联灭活疫苗对2种病原的攻击保护率均达到100%(8/8);以角鲨烯佐剂制备的二联灭活疫苗免疫驴的血清中抗流产沙门菌(10^(8)CFU/mL)的抗体凝集效价几何平均值可达1∶32,功能性抗体对S.abortus equi和SEZ的血清杀菌效价为1∶16(杀菌效率68.99%)和1∶4(杀菌效率65.47%)。S.abortus equi和SEZ 2种抗原免疫不会产生免疫干扰,角鲨烯配方佐剂与抗原结合诱导的抗S.abortus equi和SEZ致死剂量攻毒产生的保护作用强于氢氧化铝佐剂,且该二联灭活疫苗在小鼠和驴体内具有较强的保护效力与免疫原性,且安全性良好。本研究为该基于新型疫苗佐剂二联疫苗的研发奠定了坚实的基础。