Ⅰ型胶原自组装动力学特征及其与流体切应力耦合效应的研究

目的模拟胶原体内自组装过程,探讨流体切应力在胶原自组装中的作用,为开发具有良好生物相容性和生物力学性能的新型骨修复材料提供理论依据。方法使用浊度实验、天狼猩红染色、动态光散射、扫描电镜、傅里叶红外光谱等多种检测手段对Ⅰ型胶原的自组装过程、分子结构、纤维形貌等进行表征。借助锥板黏度计施加4个不同大小的恒定流体剪切力,通过天狼猩红染色、黏度测定、圆二色光谱、扫描电镜、原子力显微镜等手段探究流体剪切力对胶原自组装过程的影响。结果实Ⅰ型胶原的自组装动力学过程包括成核、生长、平衡3个阶段。胶原溶液浓度越大,组装速度越快,纤维粒径值越大。在流体切应力的作用下,胶原分子链之间的作用力被削弱,纤维粒径值减小,刚性减弱,且在切应力作用下,胶原纤维更易朝单一方向进行组装,形成有序结构。结论成功在体外构建了化学-力学耦合体,更真实地模拟了胶原体内自组装过程。研究结果对于新型骨修复材料的开发和应用具有重要的指导意义,有助于提高生物材料的生物相容性和力学性能,促进生物医用材料等相关领域的发展。

流体切应力作用时间对内皮细胞IL-8基因表达的影响

内皮细胞对力学环境变化敏感 ,流体切应力可以直接调节内皮细胞基因的表达。为阐明内皮细胞白细胞介素 - 8(IL- 8)基因的表达除受化学因子的调节外还受力学因素的影响 ,本文用流体切应力 (2 .2 3、4.2 0、6 .0 8dyne/ cm2 )处理培养的人脐静脉内皮细胞 ,然后采用定量 RT- PCR的方法检测内皮细胞 IL- 8基因的表达情况。结果显示 :未用切应力处理的内皮细胞没有 IL- 8基因的表达 ;切应力处理内皮细胞后 ,1h IL- 8m RNA表达增加 ,2 hIL- 8m RNA表达量至最高值 ,3h IL- 8m RNA表达量开始下降 ,4h后 IL- 8m RNA持续低表达 ;各实验组 (2 .2 3、4.2 0、6 .0 8dyne/ cm2 )均表现出相同的 IL- 8m RNA随时间的变化规律。提示流体切应力确可诱导内皮细胞表达IL- 8,而且 IL- 8的表达量与切应力作用时间有关 ,呈双相性变化。流体切应力诱导内皮细胞表达 IL- 8,可能在急性炎症和动脉粥样硬化的发生、发展过程中具有重要作用。

流体切应力强度对内皮细胞IL-8基因表达的影响

内皮细胞位于血流与血管壁之间 ,内皮细胞调控的机械力相关反应已成为正常血管反应的一部分。切应力在调节内皮细胞功能上具有重要作用。流体切应力可以直接调节内皮细胞基因的表达 ,其中包括诱导内皮细胞表达 IL- 8,而且 IL- 8的表达量与切应力作用时间有关。为阐明内皮细胞 IL- 8基因的表达除了与切应力的作用时间有关外还与切应力的强度有关 ,我们用不同强度的流体切应力 (2 .2 3、4 .2 0、6 .0 8、8.19、9.6 7、12 .15、14 .4 0、16 .87、19.2 9dyne/ cm2 )处理培养的人脐静脉内皮细胞 ,然后采用定量 RT- PCR的方法检测内皮细胞 IL- 8基因的表达情况。结果显示 :未用切应力处理的内皮细胞没有 IL- 8基因的表达 ;切应力处理内皮细胞后 ,低切应力 (2 .2 3dyne/ cm2 )时 IL - 8m RNA表达量明显增加为高切应力 (19.2 9dyne/ cm2 )时 IL - 8m RNA表达量的约 6 8(作用 1h)或 5 2倍 (作用 2 h)。 IL- 8m RNA的表达量与内皮细胞所施加的切应力强度呈反变关系 ;直线回归方程 :1h时为 y=7.5 7- 0 .11x,相关系数 r=0 .97;2 h时为 y=7.92 - 0 .10 x,相关系数 r=0 .96。式中 :y为切应力作用下内皮细胞 IL- 8m RNA的表达量 (拷贝数的对数值 ) ;x为施加于内皮细胞的切应力强度 (dyne/ cm2 )。

流体切应力对内皮细胞粘附分子表达的影响

在动脉粥样硬化 (Atherosclerosis ,As)的发生发展中各种白细胞 ,包括单核细胞对内皮细胞的粘附可能起着较为重要的作用。在体内 ,血流切应力对内皮细胞的形态和功能有重要影响。为了阐明流体切应力对内皮细胞表面粘附分子表达的影响 ,本文研究了流体切应力 (2 .2 3～ 6 .0 8dyne/ cm2 )对培养的人脐静脉内皮细胞 (Hum anumbilical vein endothelial cells,HU VECs)表达 ICAM- 1、VCAM- 1和 E- selectin的影响 ,用流式细胞仪分析切应力作用下粘附分子表达的变化。结果显示 :与静止状态细胞的基础水平相比 ,不同切应力 (2 .2 3、4.2 0、6 .0 8dyne/ cm2 )作用后内皮细胞表面 ICAM- 1表达显著上调 (P<0 .0 5 ) ,且与切应力作用时间有较强的相关性 (r=0 .992、0 .997、0 .997;P<0 .0 5 ) ,但其上调与切应力大小未见有明显的依赖关系 ;在切应力 2 .2 3dyne/ cm2作用后 VCAM- 1表达显著上调 (P<0 .0 5 ) ,且与切应力作用时间呈显著正相关 (r=0 .930 ,P<0 .0 5 ) ;而在切应力 (4 .2 0～ 6 .0 8dyne/cm2 )作用后 VCAM- 1表达显著下调 (P<0 .0 5 ) ,且与切应力作用时间呈显著负相关 (r=- 0 .975、- 0 .989:P<0 .0 5 ) ;在本实验范围的切应力作用对内皮细胞表面 E- selectin的表达无显著影响。

流体切应力下SIVA-1凋亡诱导因子促成骨细胞增殖分化的双向调节作用

目的探讨流体切应力(fluid shear stress,FSS)对KM小鼠成骨细胞增殖分化及相关细胞凋亡诱导因子(SIVA-1)的调节作用。方法将传至3代成骨细胞分为应力刺激组(试验组)和非应力刺激组(对照组)。5个试验组分别给予1.2PaFSS作用0.25,0.5,1,2,4h;对照组为0h。MTT法测定细胞增殖,检测碱性磷酸酶(ALP)活性,半定量RT-PCR测定凋亡诱导因子SIVA-1的表达水平。结果FSS促增殖作用在短期(0.25,0.5h)明显,且细胞生长曲线前移;但在1,2,4h却有明显抑制增殖作用。FSS同样增加了ALP活性,尤其在应力作用0.5h时显著(ALP含量为2.4320±0.205金氏单位/100ml,相对对照达158%)(P<0.05);而应力作用1,2,4h后减低了ALP的表达。应力初期SIVA-1mRNA表达量明显下降,尤其在FSS作用0.5h后SIVA-1/GAPDH相对表达量为0.099±0.002,相对对照明显下调了71.3%(P<0.01),此效应在作用1h后减退,SIVA-1mRNA表达开始升高,4h后升高明显。结论1.2PaFSS在短时间刺激下可刺激成骨细胞增殖分化,尤其在0.5h后效应明显。早期促细胞增殖和ALP水平升高主要与SIVA-1mRNA表达下调有关,而后期抑制作用可能与SIVA-1mRNA表达升高有关。

基于机械敏感性阳离子通道Piezo1的黄芪丹参药物血清对低流体切应力诱导的人内皮细胞功能紊乱的影响

目的观察黄芪丹参药物血清调控机械敏感性阳离子通道Piezo1对低流体切应力(FSS)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)功能紊乱的影响,探讨其可能的作用机制。方法将细胞分为空白组、模型组、Piezo1激活剂组和芪参血清组,采用FSS加载分析设备加载低FSS建立细胞损伤模型,Piezo1激活剂组和芪参血清组分别给予Piezo1激活剂Yoda-1和黄芪丹参药物血清干预,空白组和模型组加入空白血清培养。MTT法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡,硝酸还原酶法检测细胞灌流液一氧化氮(NO)含量,均相竞争法检测内皮素-1(ET-1)含量,ELISA检测白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量,RT-PCR检测细胞内Piezo1、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)m RNA表达,Western blot检测细胞内Piezo1、eNOS、pro-IL-1β蛋白表达。结果与空白组比较,模型组细胞活力显著降低(P<0.05),凋亡率显著升高(P<0.01),细胞灌流液NO含量显著减少,ET-1、IL-1β和TNF-α含量显著增加(P<0.01),细胞Piezo1、eNOS mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.01),pro-IL-1β蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,芪参血清组细胞活力显著升高(P<0.01),Piezo1激活剂组和芪参血清组细胞凋亡率显著降低(P<0.01),细胞灌流液中NO含量显著增加(P<0.01),ET-1、IL-1β和TNF-α含量显著减少(P<0.01),细胞Piezo1、eNOS mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.01),pro-IL-1β蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论黄芪丹参药物血清对低FSS诱导的HUVEC炎症和功能紊乱有保护作用,其机制与调控机械敏感性阳离子通道Piezo1有关。

流体切应力作用强度对内皮细胞IL-8生成的影响

血管内皮细胞衬于血管腔的表面 ,是血流机械应力的主要感受者。切应力可以直接调节内皮细胞生物活性物质的合成和分泌 ,其中包括诱导内皮细胞生成 IL- 8,而且 IL- 8的生成量与切应力作用时间有关。为阐明内皮细胞 IL- 8的生成除了与切应力的作用时间有关外还与切应力的强度有关 ,我们用不同强度的流体切应力 (2 .0 9、4 .6 1、6 .19、8.5 1、10 .5 0、12 .5 9、14 .4 1、17.2 2、18.32 dyne/ cm2 )处理培养的人脐静脉内皮细胞 ,然后采用双抗体夹心 ABC- EL ISA技术检测内皮细胞 IL - 8蛋白质的生成。结果显示 :未用切应力处理的内皮细胞只有极少量的 IL - 8蛋白质生成 ;切应力处理内皮细胞后 ,低切应力 (2 .0 9dyne/ cm2 )时 IL - 8蛋白质生成量明显增加 ,约为高切应力(18.32 dyne/ cm2 )时 IL - 8蛋白质生成量的 6 (作用 5 h)或 7倍 (作用 6 h)。 IL - 8蛋白质生成量与内皮细胞所施加的切应力强度呈反变关系 ;直线回归方程 :5 h时为 y=76 0 .12 - 36 .0 6 x,相关系数 γ=- 0 .978;6 h时为 y=781.87-36 .6 6 x,相关系数 γ=- 0 .980。式中 :y为切应力作用下内皮细胞 IL- 8的生成量 ;x为施加于内皮细胞的切应力强度 (dyne/ cm2 )。不同的切应力作用时间 (5 h、6 h)均表现出相同的 IL- 8蛋白质生成量随切?

流体切应力促成骨细胞通过细胞周期G1/S调控点机制的研究

[目的]探讨流体切应力(FSS)促成骨细胞增殖、分化作用与细胞周期从G1期向S期转化机制的关系,为确立最佳生理应力刺激骨再生提供依据。[方法]从KM乳鼠颅盖骨提取原代成骨细胞,在体外流体小室内分别受FSS(12dyn/cm2)作用0、0.25、0.5、1、2、4h,通过MTT法分析细胞增殖能力,并利用碱性磷酸酶(ALP)的表达评价其分化能力;通过流式细胞仪、免疫荧光染色和RT-PCR测定细胞周期G1/S百分比、细胞周期依赖激酶2和4(CDK2、CDK4)的活性改变及E2F1、p27mRNA的表达实现FSS促成骨细胞由G1期转向S期的测定。[结果]FSS促增殖作用在短期(0.25h、0.5h)明显,并且细胞生长曲线前移;但在1、2、4h却有明显抑制增殖作用。FSS同样增加了ALP的活性,尤其在应力作用0.25、0.5h时显著(比对照达128%和158%);而应力作用1、2、4h后减低了ALP的表达。在FSS作用1h内细胞周期S期百分比增高,作用0.5h后与对照组比较明显增高(P<0.05);但随着时间的增加细胞周期S期百分比开始下降,当作用时间持续4h后S期百分比下降明显(P<0.05)。流体切应力增加了活化pRb的CDK2、CDK4的活性,而且与CDK2相关的E2F1表达量也明显增加;而细胞周期依赖激酶抑制剂p27在流体切应力作用下有所下降。其中流体切应力在0.25h、0.5h明显增加了E2FlmRNA的表达水平(P<0.05),此效应在作用1h后减退。[结论]适宜的流体切应力通过上调CDK2、CDK4及E2F1,下调p27,使细胞从G1期转化到S期,在流体切应力促成骨细胞增殖、分化机制中起重要作用;并且这种作用有明显的FSS作用时间限制性。

流体切应力对血管内皮细胞的生物学作用

生物医学技术的不断发展 ,为心血管人工移植物 (如人工血管、人工瓣膜 )的临床应用提供了广阔的发展空间。内皮细胞与平滑肌细胞作为血管壁的主要组成细胞在人工血管的构建研究中占有重要地位。体外培养是研究内皮细胞与平滑肌细胞细胞形态和功能的重要手段。但静态条件下的内皮细胞与平滑肌细胞的联合培养缺少在体条件下的力学环境 ,因而近年来国内外开始将两种研究方法结合起来 ,研究在力学环境下内皮细胞与平滑肌细胞的相互作用 。

流体切应力作用时间对内皮细胞IL-8生成的影响

内皮细胞对力学刺激反应敏感 ,流体切应力可以直接调节内皮细胞生物活性物质的产生。为阐明内皮细胞白细胞介素 - 8(IL- 8)蛋白质的生成受力学因素的影响 ,本文用流体切应力 (2 .0 9、4 .6 1、6 .19dyne/cm2 )处理培养的人脐静脉内皮细胞 ,然后采用双抗体夹心 ABC- EL ISA技术检测内皮细胞 IL- 8蛋白质的生成。结果显示 :未用切应力处理的内皮细胞只有极少量的 IL- 8蛋白质生成 ;切应力处理内皮细胞 1h,IL- 8蛋白质生成增加 ,处理 5 hIL- 8蛋白质生成量至最高值 ,处理 8h IL- 8蛋白质生成量下降 ,10 h后 IL- 8蛋白质维持在一个较高的水平 ;各实验组 (2 .0 9、4 .6 1、6 .19dyne/cm2 )均表现出相同的 IL- 8蛋白质随力学刺激时间的变化规律。提示流体切应力确实可以诱导内皮细胞生成 IL- 8,并且 IL- 8的生成量与切应力的作用时间有关 ,呈双相性变化。流体切应力诱导内皮细胞生成 IL- 8,可能在急性炎症或动脉粥样硬化的发生。

流体切应力作用下破骨细胞组织蛋白酶K的表达

目的:研究流体切应力作用下大鼠破骨细胞组织蛋白酶K(Cat K)mRNA的表达变化。方法:1,25-(OH)2D3/地塞米松联合诱导SD大鼠骨髓细胞,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、甲苯胺蓝染色和扫描电镜观察鉴定破骨细胞,0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA进行细胞纯化。对纯化后的破骨细胞施加不同力值和作用时间的流体切应力,实时荧光定量巢式RT-PCR检测Cat K mRNA的表达。结果:随着力值的增加(0.9～18.7 dyne/cm2)和作用时间的延长(15～60 min),破骨细胞组Cat K mRNA的表达量分别呈下降趋势(P<0.05)。结论:大鼠破骨细胞Cat K mRNA的表达水平与一定范围的流体切应力力值的大小和加载时间呈负相关。

流体切应力对中性粒细胞表面粘附分子表达的影响

采用Ｌｏｗ ｓｈｅａｒ ３０ 对中性粒细胞施加不同强度、不同形式的剪切，在经过荧光单克隆抗体标记后，用流式细胞仪检测ＣＤ１８ 和ＣＤ６２Ｌ在细胞表面的表达情况。结果显示：剪切后ＣＤ１８ 有显著升高，而ＣＤ６２Ｌ阳性细胞比率显著下降，但对ＣＤ６２Ｌ阳性细胞表面ＣＤ６２Ｌ的含量没有明显影响。不同方式的剪切影响有细微差异。ｆＭＬＰ或ＴＮＦ单独作用可以使细胞表面的ＣＤ１８ 表达轻微降低而使ＣＤ６２Ｌ同样发生脱落，刺激因子与切应力同时作用下两种粘附分子的表现有加和性。本文提示，力学作用与生物化学因子的激活作用可能是通过不同的感受器，经过不同的信号转导途径，产生不了同的效应；

流体切应力作用下乙醇对血管内皮细胞HSP70表达的影响

目的探讨在流体切应力作用下不同浓度的乙醇对血管内皮细胞HSP 70表达的影响。方法不同浓度的乙醇分别在静止状态下和1 Pa切应力下作用于培养的EA.Hy926内皮细胞1 h、2 h、4 h、6 h,不加乙醇组为对照组,用免疫组化SP法观察内皮细胞HSP 70的表达。结果对照组在静止状态下无HSP 70的表达,在1 Pa切应力作用4 h后可见表达;50 m g/dL乙醇组不管在有无切应力作用下表达HSP 70与对照组的差异均无统计学意义;150 m g/dL和300 m g/dL乙醇组在静止状态下作用于内皮细胞4 h和2 h可见HSP 70表达,在1 Pa切应力作用下表达明显增强。结论中、高浓度的乙醇与流体切应力的联合作用能明显增强内皮细胞HSP 70的表达,同时与作用时间也有密切关系。

流体切应力增加骨髓来源破骨细胞内游离钙离子浓度的研究

目的研究流体切应力对培养于载玻片上的破骨细胞内Ca2+浓度的影响。方法应用激光扫描共聚焦显微镜和Fluo-3/AM荧光探针标记技术,测定加力前后破骨细胞内游离Ca2+的荧光强度,获得的图像在计算机上用图像分析软件进行比较分析。结果在37℃、Fluo-3/AM终浓度为10μmol/L的条件下,破骨细胞可获得良好的标记效果,与未加力的对照组相比,流体切应力使破骨细胞内Ca2+荧光信号的平均强度值显著增加。结论体外培养于载玻片上的破骨细胞内Ca2+浓度对流体切应力敏感,Ca2+可介导流体切应力对破骨细胞功能的调节。

流体切应力作用于间充质干细胞对其内皮分化后细胞间黏附因子1表达的影响

目的探讨流体切应力作用于成体骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)后,其定向内皮诱导所得细胞的细胞间黏附因子1(intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1)的表达变化。方法体外培养大鼠骨髓MSCs,于流室系统中加载不同强度的流体切应力后,将其向内皮细胞系诱导,以荧光实时定量RT-PCR检测所得细胞ICAM-1的mRNA表达水平,以流式细胞仪检测ICAM-1蛋白表达水平,并进一步观察细胞传代后ICAM-1mRNA及蛋白表达水平变化。结果大鼠MSCs经过流动加载后,定向内皮诱导所得细胞的ICAM-1mRNA及蛋白表达水平均较静态对照组有所升高(P<0.05),但当细胞传代后,ICAM-1蛋白水平回落至对照组水平(P>0.05),而mRNA表达水平继续升高。结论流体切应力能增加MSCs来源的内皮细胞黏附因子的表达,证实了血流动力学因素在动脉粥样硬化发病机制中所起的重要作用。

流体切应力促进组织工程骨成骨和血管化的研究进展

流体切应力在组织工程学中得到越来越多的重视。通过模拟流体切应力作用于骨组织后对感应细胞（成骨细胞和血管内皮细胞）产生刺激，达到骨量增多和快速血管化的目的。通过阐述流体切应力对成骨细胞和血管内皮细胞的作用机制，为促进组织工程骨的成骨和血管化提供思路和依据。

流体切应力对年轻和老年大鼠肠系膜微动脉eNOS表达和NO释放量的影响

目的观察流体切应力引起的年轻和老年大鼠肠系膜微动脉内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达和一氧化氮（NO）释放量改变对血管老化的作用。方法采用选择性结扎年轻（6月龄）和老年（24月龄）大鼠肠系膜微动脉产生不同的流体切应力，制备正常和高流体切应力（NF和HF）微动脉灌流模型，术后3周分离血管测定年轻和老年大鼠NF和HF肠系膜微动脉NO的释放量及其限速酶eNOSmRNA和总蛋白及磷酸化蛋白的表达。结果增加流体切应力后，血管eNOSmRNA和蛋白质表达水平增加，NO释放量增多。结论流体切应力可以改变eNOS的表达及NO的释放量，从而改善老年大鼠微动脉的功能。

流体切应力对中性粒细胞内Ca^(2+)的影响

流体切应力是中性粒细胞的重要功能环境 ,但以往的研究很少涉及力学作用对中性粒细胞的影响。我们利用旋转粘度仪提供的流体切应力作用于分离的中性粒细胞 ,采用Fura 2 /AM与细胞内游离Ca2 + 结合 ,检测其荧光强度 ,研究不同力学条件下细胞内游离Ca2 + 浓度的变化情况 ;另外 ,分别以f MLP和TNF两种刺激因子作用中性粒细胞 ,使之激活 ,与此同时考察流体力学作用对中性粒细胞激活程度的影响。结果显示 :定常剪切流 ,切变率由低变高时 ,中性粒细胞内的游离Ca2 + 水平先是显著下降 ,切变率达到一定程度后 ,[Ca2 + ]i逐渐回升 ,并且会超过静止时的水平 ;两种刺激因子在静态下激活中性粒细胞均可使游离Ca2 + 大幅度上升 ,同时给予定常流作用 ,在较低切变率作用下 ,这一上升被明显抑制 ,当切变率升高到一定程度后 ,[Ca2 + ]i回复到静态激活水平甚至更高。正弦振荡剪切作用于中性粒细胞 ,[Ca2 + ]i随最大切变率增大而升高 ,当激活剂和剪切流同时作用时 ,[Ca2 + ]i随最大切变率升高而下降 ,逐渐接近最大切变率相同时的单纯振荡切应力作用的水平。由此我们认为 :体内不同血流环境将影响中性粒细胞的 [Ca2 + ]i,在不同循环部位的血管血流中 ,流体切应力对中性粒细胞的 [Ca2 + ]i有着不同的调节作用。