miR-199a-3p通过靶向CABLES-1调控流体剪切力介导的成骨细胞增殖

目的探讨miR-199a-3p在流体剪切力(fluid shear stress,FSS)诱导成骨细胞增殖中的作用及其可能的分子机制。方法对成骨细胞MC3T3-E1加载1.2 Pa FSS,时间分别为0、15、30、45、60、75、90 min。使用miR-199a-3p模拟物或miR-199a-3p抑制物转染MC3T3-E1细胞。使用将过表达的miR-199a-3p以及其阴性对照分别转染MC3T3-E1细胞,并以1.2 Pa FSS处理45 min。将pcDNA NC、pcDNA-CABLES-1、si RNA NC、si RNA CABLES-1转染至MC3T3-E1细胞中。分别共转染pc DNA-CABLES-1与miR-199a-3p mimic以及si RNA-CABLES-1与miR-199a-3p inhibitor。CCK-8实验检测细胞活性;RT-qPCR检测CABLES-1、miR-199a-3p、CDK 6、Cyclin D1、PCNA表达水平;荧光素酶报告实验检测CABLES-1和miR-199a-3p的靶向关系。免疫荧光检测CABLES-1蛋白表达。Western blot检测CABLES-1、CDK 6、PCNA、Cyclin D1的蛋白表达。结果FSS作用下MC3T3-E1细胞中的miR-199a-3p出现显著下调。过表达的miR-199a-3p抑制成骨细胞增殖,下调miR-199a-3p表达促进成骨细胞增殖。miR-199a-3p可以逆转FSS诱导的成骨细胞增殖。双荧光素酶实验表明,miR-199a-3p靶向作用于CABLES-1,过表达的miR-199a-3p可抑制CBALES-1蛋白表达。CABLES-1能够促进成骨细胞增殖。miR-199a-3p通过CABLES-1抑制FSS诱导的成骨细胞增殖。结论FSS诱导的成骨细胞增殖通过下调miR-199a-3p并通过靶向作用于CABLES-1实现。研究结果为FSS诱导成骨细胞增殖机制的研究提供新方向,也为未来机械刺激在骨关节疾病治疗中的临床应用研究提供新思路。

流体剪切力通过下调p21促进MC3T3-E1成骨细胞增殖

目的探讨流体剪切力(fluid shear stress,FSS)对成骨细胞p21表达的影响,并明确p21在FSS诱导的成骨细胞增殖过程中的作用。方法对成骨细胞加载不同时间(0、15、30、45、60 min)、1.2 Pa FSS。用CCK-8实验、EdU实验检测成骨细胞增殖活性。用siRNA p21或pcDNA p21转染成骨细胞,并用Western blotting检测转染效果。Western blotting检测不同干预条件下p21、cyclin D1、CDK4的表达变化。结果加载1.2 Pa FSS后,p21表达显著下调,且加载45 min后表达水平最低。加载FSS和下调p21表达都显著增强成骨细胞增殖,并增加cyclin D1、CDK4表达。而上调p21表达后,加载FSS不再具有增强成骨细胞增殖和增加cyclin D1、CDK4表达的作用。结论1.2 Pa FSS能够下调成骨细胞p21表达,在加载45 min时下调最为明显。p21下调对成骨细胞增殖具有促进作用,且FSS通过下调p21促进成骨细胞增殖。

流体剪切力下CD44-HA介导的MDA-MB-231细胞及HL60细胞的滚动黏附

目的探究胞外基质中的透明质酸(hyaluronic acid,HA)如何调控血流中CD44+肿瘤细胞的黏附滚动行为。方法采用平行平板流动腔装置,观察记录流场中MDA-MB-231细胞及HL60细胞在固定HA上的运动,提取细胞滚动黏附特征参数。结果MDA-MB-231细胞在HA底板上的黏附受到HA浓度的正向调控,但不受HA分子量影响;与物理吸附相比,生物素-亲和素固定的HA可显著提高细胞的黏附比率。在30~50 mPa剪切力范围内,剪切力的增加加快了细胞的滚动速度,降低了细胞的黏附比率,但对细胞的栓缚时间影响不大。同样流场中,与MDAMB-231细胞比较,CD44表达水平较低的HL60细胞在HA底板上的栓缚时间短、滚动速度快、黏附比率低(<1.5%)。结论流体剪切力可能通过调节CD44-HA的结合速率而非解离速率来调控MDA-MB-231细胞的滚动速度;CD44-HA相互作用参与HL60细胞的初始黏附,但不起主要作用。研究结果为抗肿瘤药物的开发提供参考。

流体剪切力对软骨细胞作用的研究进展

软骨细胞是力学敏感细胞之一,其对压力、张力、剪切力均比较敏感。软骨细胞可通过力学敏感通道来感受周围微环境的变化,从而调控细胞的各项生理功能,维持软骨的健康和稳态。流体剪切力是组织液于压力负荷驱动下在人体各种细胞表面流动产生的一种流体源性的机械力,可影响软骨细胞的形态发生、骨架重塑、代谢、增殖与凋亡等多种细胞生理过程。长期不对称的力学刺激将导致软骨退化和破坏,最终引起骨关节炎等疾病的发生。本文就流体剪切力对软骨细胞代谢、软骨细胞表型、软骨细胞的凋亡及软骨影像的研究进展进行综述,进一步探索骨关节炎发病机制,为治疗提供理论基础。

流体剪切力作用下间隙连接蛋白Cx43在骨改建中的机制初探

目的 探讨骨细胞在受到机械流体剪切力作用后,间隙连接蛋白Cx43参与骨改建的机制。方法 将受流体剪切力作用的骨细胞分成5组,即施加生理流体剪切力组,过大流体剪切力组,siRNA干扰组,18a-GA阻断组,对照组。收集加力后系统内的循环液体作为条件培养基对单核细胞株RAW264.7和骨髓间充质干细胞MSCs进行培养,观察破骨细胞的生成和钙化结节形成情况。结果 抑制骨细胞内Cx43的表达或阻断胞间的间隙连接通路,均能导致破骨细胞诱导生成相关因子增加,促进破骨细胞生成,抑制骨髓间充质干细胞MSCs成骨向分化。结论 间隙连接蛋白Cx43作为骨细胞上的力学感应受体,能通过影响成骨、破骨活动对骨改建发挥重要的调节作用。

震荡流体剪切力通过ERK5信号通路促进成骨细胞增殖

目的探讨震荡流体剪切力(oscillatory shear stress,OSS)通过ERK5信号通路在诱导成骨细胞增殖中发挥的作用。方法对成骨MC3T3-E1细胞进行不同的处理,分为正常组、OSS组、XMD8-92组和OSS+XMD8-92组。采用MTT实验分别测定4组细胞的增殖活性并绘制生长曲线;蛋白免疫印迹法分别检测P-ERK5、ERK5和Cyclin D1等蛋白水平变化。结果 OSS可显著增加成骨MC3T3-E1细胞增殖活性,但此效应可被ERK5高选择性抑制剂XMD8-92阻断。OSS可显著上调Cyclin D1的表达,而XMD8-92可显著下调OSS诱导的Cyclin D1的表达。结论 OSS通过激活ERK5信号通路促进成骨细胞增殖,Cyclin D1是ERK5信号通路下游的重要靶点基因。

流体剪切力作用强度对极化破骨细胞ATP6V1a1 mRNA的影响

目的观察不同作用强度流体剪切力对鼠极化破骨细胞ATP6V1a1 mRNA表达水平的影响。方法联合应用形态学观察、特异性染色和吸收实验,对长骨机械分离法获得的正在进行骨吸收的极化破骨细胞进行培养鉴定。然后将细胞分为对照组和0.9、2.9、8.7、26.3dynes/cm2实验组,作用时间30min,行实时荧光定量PCR检测ATP6V1a1 mRNA表达水平,并进行统计分析。结果获得的细胞满足破骨细胞的鉴定标准,属于正在进行骨吸收的极化破骨细胞。对照组和0.9、2.9、8.7、26.3dynes/cm2实验组ATP6V1a1 mRNA表达量分别为(1.14±0.06)×106、(1.62±0.09)×106、(2.28±0.13)×106、(3.24±0.18)×106、(9.16±0.53)×106个拷贝数,所有组间均有显著性差异(P<0.05)。结论极化破骨细胞对流体剪切力反应敏感,随着加载强度的增加,ATP6V1a1 mRNA表达水平有增加趋势。

流体剪切力作用下鼠极化破骨细胞的形态变化

目的探讨流体剪切力作用下大鼠极化破骨细胞的形态变化。方法机械分离培养大鼠极化破骨细胞，对破骨细胞鉴定后，采用本课题组白行研制的流体剪切力装置在0．29Pa条件下，观察流体剪切力作用0、15、30、45、60、75、90、105、120min时破骨细胞的形态变化。结果大鼠极化破骨细胞抗泊石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色阳性，吸收试验阳性，细胞形态较大，直径约30μm，形状不规则以类圆形多见，核3～20个，可见空泡，周边大量细胞丝。随流体剪切力作用时间的延长，极化破骨细胞面积、直径均有增大趋势，30min组、105min组与0min组（对照组）间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论在本试验条件下，随流体剪切力作用时间的增加，SD-大鼠极化破骨细胞的形态呈波动性变化，直径和面积均有增大的趋势。

灌注式生物反应器中流体剪切力对大段组织工程化骨构建的作用

目的结合流体力学模型研究灌注式生物反应器中大段组织工程化骨的构建与多孔支架内流体剪切力的关系。方法利用灌注式生物反应器对复合骨髓基质干细胞的多孔磷酸三钙支架进行灌注培养。培养基的黏度分别为1.12mPa.s,2.23mPa.s及3.35mPa.s。通过细胞增殖、成骨分化及组织形态学评价组织工程化骨的构建,建立流体力学模型,求解支架内的流体剪切力。结果培养基黏度2.23mPa.s组,细胞增殖高于其他组。培养基黏度2.23mPa.s及3.35mPa.s组第28d的碱性磷酸酶活性及第7d后的骨钙素分泌高于1.12mPa.s组。培养基黏度越高,骨桥蛋白的分泌高峰出现越早。28d后,黏度3.35mPa.s组的钙化基质最多。流体力学模型分析,培养基黏度1.12mPa.s,2.23mPa.s及3.35mPa.s组中,支架内的平均流体剪切力分别为5mPa,11mPa和15mPa。结论在利用复合人骨髓基质干细胞的多孔磷酸三钙构建大段组织工程化骨的过程中,15mPa的流体剪切力最有利于组织工程化骨的构建。

流体剪切力在骨生长、重建中的重要作用

骨组织具有最优化结构,是一个典型的结构-功能受生物力学控制的例子。力学因素在骨的生长、重建和成形中起着十分重要的作用,但力学刺激的本质形式至今无法确认。骨组织存在多孔结构,力学负荷引起的变形会促使流体流动对骨细胞产生作用,离体实验也证实骨细胞能对流体产生响应,因此流体剪切力是研究骨组织受力学调控时考虑的一个重要方面。现有的研究主要体现在流体的有效作用形式,细胞的生物学反应,以及流体剪切力在细胞中的力学转导;各个方面的研究都提示,流体剪切力至少部分的参与了骨组织内的力转导。作者就这方面的研究进展作一综述。

流体剪切力对大鼠成骨样细胞生成NO的调节作用

机械应力在骨改建中起着重要的作用。本研究试图探讨机械应力刺激调节成骨细胞生理功能过程中一氧化氮 (NO)的作用机制。通过流室系统对体外培养的大鼠成骨样细胞施加 12 dyn/ cm2的流体剪切力 ,采用 NO荧光检测试剂盒检测细胞受力 5、10、15、30、6 0、12 0 min后不同时段的 NO的表达。结果表明 ,大鼠成骨样细胞受力后生成的 NO明显高于空白对照组 (P<0 .0 5 )。受力细胞在受力后 6 0 min内 ,NO的生成在各时段无明显提高 ,但在6 0 m in后开始明显增加 (P<0 .0 5 )。而空白对照组各时段 NO的生成无显著性差异 (P>0 .0 5 )。机械应力作用下 ,成骨样细胞早期释放 NO,可能是骨组织细胞将机械应力刺激转导入细胞 ,促进骨形成的生化信号分子。流体剪切力刺激诱导的反应早期可能是直接通过激活 c NOS的生化通道来实现 ,在后期可能是通过 i

流体剪切力诱导喉鳞癌Hep2细胞上皮-间充质转化

目的探究流体剪切力(fluid shear stress,FSS)对喉鳞癌Hep2细胞发生上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的影响。方法对Hep2细胞加载140 m Pa的FSS,观察不同时间点细胞的形态学变化;划痕实验检测力学加载后Hep2细胞迁移能力的变化;共聚焦显微镜下观察细胞骨架蛋白F-actin的分布;Western blotting检测EMT相关蛋白的表达。结果 FSS力学加载后,Hep2细胞形态由多边形向梭形转变,撤销FSS后,细胞恢复初始的多边形;Hep2细胞迁移能力的增加依赖于FSS加载时间。FSS促使细胞骨架蛋白F-actin重排,从而增强Hep2细胞的迁移行为。FSS使Hep2细胞EMT标志蛋白发生了时序性变化。结论 FSS是诱导Hep2细胞发生EMT的一个重要物理因素。

混凝(沉降)反应中“流体剪切力与物理化学”的相互效应研究

假定颗粒之间都是发生有效碰撞,根据分形维数提出了评判混凝过程的物理模型,并指出其混凝反应效果主要取决于初始阶段的剪切过程。进一步的试验表明,在药剂加入的初始阶段,存在“流体剪切力与物理化学”的相互效应;添加有机絮凝剂时需要较强的搅拌强度,而添加无机药剂时不能有太强的搅拌强度。

流体剪切力与17-β雌二醇对MC3T3-E1细胞增殖活性协同作用的研究

目的探讨对体外培养的成骨细胞增殖活性促进作用最佳的17-β雌二醇的浓度及作用时间、流体剪切力(FSS)的力值及作用时间,以及此双因素共同作用对成骨细胞增殖活性的影响。方法成骨细胞系MC3T3-E1细胞传代培养后,分别对其施加不同浓度的17-β雌二醇和不同力值的FSS,采用MTT法检测细胞的增殖情况,并检测ALP活性,筛选出最佳的浓度及力值;再将二者共同作用于MC3T3-E1细胞,检测其增殖情况和ALP活性。结果浓度为10-8mol.L-1的17-β雌二醇作用5 d时,MC3T3-E1细胞的增殖及ALP活性优于其他17-β雌二醇处理组;FSS力值为12×10-5N作用60 min时细胞的增殖及ALP活性大于其他FSS处理组。当二者同时作用于MC3T3-E1细胞时,细胞的增殖活性大于任一单因素处理组。结论 17-β雌二醇和FSS对成骨细胞活性的促进作用皆有一个适宜的阈值;二者具有协同作用,对成骨细胞分化及增殖功能的影响优于单一因素作用。

周期性和持续性流体剪切力对成骨细胞OPG、RANKL蛋白表达的影响

目的:观察两种不同加载模式的流体剪切力(周期性或持续性)对MC3T3-E1成骨细胞增殖以及骨保护素(OPG)、细胞核因子k B受体活化因子配体(RANKL)蛋白表达的影响,同时探讨影响成骨细胞功能的最佳流体剪切力加载模式。方法:对MC3T3-E1成骨细胞分别加载生理强度为12 dyn/cm2的周期性流体剪切力或持续性流体剪切力。其中,持续性模式采用12 dyn/cm2的流体剪切力,加载成骨细胞2 h,静息2 h;周期性流体剪切力采用12 dyn/cm2流体剪切力加载成骨细胞30 min,然后静息3 0min,如此往复循环4次,总的加力时间为2 h。最后,MTT法检测不同加载模式下成骨细胞的增殖情况,Westernblot检测两组成骨细胞OPG、RANKL蛋白的表达影响。结果:MTT结果显示,两种加载模式的流体剪切力均能够显著促进成骨细胞的增殖(P<0.05),与持续性流体剪切力相比,周期性流体剪切力更能有效的促进成骨细胞的增殖(P<0.05)。另外,两种模式的流体剪切力均能有效地调控MC3T3-E1成骨细胞OPG、RANKL的表达(P<0.05)。但与持续性流体剪切力相比,周期性流体剪切力对成骨细胞OPG蛋白的促进作用更为显著(41.34%±5.37%vs 80.42%±4.19%,P<0.05);对成骨细胞RANKL蛋白的抑制作用更为明显[(24.17±5.92)%vs(8.45±2.18)%,P<0.05]。结论:与持续流体剪切力相比,周期性流体剪切力对成骨细胞增殖以及OPG、RANKL蛋白有更显著的调节作用。

流体剪切力在移植肾机械灌注中的机制及研究进展

近年来,机械灌注临床应用日益成熟,相关设备开发越加完善,其临床获益效果也逐步得到认可。然而,机械灌注对于肾脏的保护机制仍然不明确,可能与机械灌注可以不断提供营养、带走代谢废物以及模拟生理条件下血管内皮经受流体剪切力(FSS)的内环境密切相关。本文就FSS缺失诱发氧化应激反应、FSS突现加重氧化应激损伤以及FSS在机械灌注保存移植肾中的作用进行综述。

不同加载时间流体剪切力对成骨细胞中piezo1机械敏感型蛋白表达的影响

目的:研究加载不同时间流体剪切力(FSS)对MC3T3-E1成骨细胞piezo1机械敏感型离子蛋白表达的影响。方法:利用自行设计的平行平板FSS加载装置,对MC3T3-E1成骨细胞施加12 dyn/cm^2FSS 0、15、30、45、60、90 min,采用免疫荧光染色实验检测piezo1机械敏感型离子蛋白的表达水平。结果:piezo1明显表达于成骨细胞细胞质及细胞核,细胞质尤为明显。对体外培养的MC3T3-E1细胞加载12 dyn/cm^2FSS,随着加载时间的延长,piezo1蛋白表达上调,在45 min左右达到高峰。结论:加载不同时间的12 dyn/cm^2FSS能够上调MC3T3-E1成骨细胞piezo1机械敏感型离子蛋白,加载45 min最合适。

流体剪切力对MC3T3-E1细胞OPG、RANKL蛋白表达的实验研究

目的探讨流体剪切力(fluid shear stress,FSS)作用下,两种调节骨骼重建的重要分子骨保护素(osteoprotegerin,OPG)和细胞核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)的蛋白表达情况。方法采用体外模型对MC3T3-E1细胞加载流体剪切力,细胞经不同时间加力后(0,30,60,90,120min),对细胞分别进行染色和裂解,运用免疫荧光和蛋白印迹法对OPG和RANKL的蛋白表达水平进行定量分析。结果 FSS作用30,60,90,120min后能够显著增加OPG的蛋白表达(P<0.05),减少RANKL的蛋白表达(P<0.05)。两者共同作用使得OPG/RANKL值显著增高(P<0.05)。结论流体剪切力刺激提示OPG/RANKL的比值可能在成骨细胞和破骨细胞联合调节骨骼形成和吸收的过程中起着重要的调节作用。

成骨细胞中激活剂蛋白-1家族成员对流体剪切力的响应

目的研究激活剂蛋白_1家族成员FosB,c_Fos,c_Jun,JunD,JunB,Fra_1和Fra_2对不同大小的流体剪切力的生理响应。方法对新生SD大鼠颅盖骨中分离出的成骨细胞施加流体剪切力,分成4组,每组加载的水平剪切力大小分别为0.8 Pa,1.2 Pa,1.4 Pa及1.6 Pa。每组在加载剪切力0 min,10 min,15 min,30 min,60 min后分别用逆转录聚合酶链反应测试FosB,c_Fos,c_Jun,JunD,JunB,Fra_1和Fra_2 mRNA的表达。结果FosB,c_Fos,c_Jun,JunD和JunB在水平剪切力加载15 min时表达明显增高(P<0.05),Fra_1和Fra_2在流体剪切力刺激后都有增高,但是各个时间组之间却没有统计学差异(P>0.05)。当剪切力为1.2 Pa时,FosB,c_Fos,c_Jun,JunD和JunB mRNA表达明显高于其他各组和空白对照组(P<0.05)。结论FosB,c_Fos,c_Jun,JunD,JunB,Fra_1和Fra_2等参与了力学刺激引发细胞响应的过程。当成骨细胞受到外界力学刺激后,激活剂蛋白_1在外界信号刺激引起的信息传递级联反应中起重要的偶联作用,充当核内第三信使和基因转录调控的分子开关。

流体剪切力和细胞骨架阻断对肌动蛋白丝的影响

目的:探讨流体剪切力对成骨细胞细胞骨架的影响.方法:实验分为3组,Ⅰ组(流体剪切力),Ⅱ组(流体剪切力+细胞松弛素D,Cytochalasin D),Ⅲ组(流体剪切力+噻氨酯哒唑,Nocodazole).分别对Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ组施加12dyne/cm2流体剪应力,应力作用时间分别为:0,10,30,60min.采用激光共聚焦显微镜、免疫荧光显微镜技术和免疫荧光染色方法对小鼠成骨细胞骨架进行形态学观察、F-肌动蛋白表达的荧光定量分析.结果:细胞在不同时间点受到同一剪切应力后,细胞的排列方向发生改变,细胞内的F-肌动蛋白排列同应力方向一致,随着应力时间延长到1h,F-肌动蛋白变得厚而丰富,F-肌动蛋白的荧光强度同0时段剪切力组相比明显增强(P<0.01).当加入细胞松驰素D后,细胞内F-肌动蛋白结构发生改变,在力的作用下,细胞内微丝断裂明显,随着拉伸时间的延长,微丝断裂更为明显,F-肌动蛋白的荧光强度同0时段剪切力组相比显著减弱(P<0.01).加入噻氨酯哒唑后,在剪切力作用下细胞内微管断裂,F-肌动蛋白丝完整且边缘呈锯齿状改变,它的荧光强度同0时段剪切力组相比也有明显减弱(P<0.05).结论:不同时间点受到同一剪切应力对细胞骨架微丝、微管结构产生一定的影响,微丝解聚和重排以及微管断裂与否在细胞力传导中起重要作用.