流体剪应力对人脐静脉内皮细胞葡萄糖调节蛋白78和C/EBP同源蛋白表达的影响

目的探索流体剪应力对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和C/EBP同源蛋白(CHOP)表达的影响。方法以HUVECs作为实验细胞,设计并构建流体动力学模拟实验系统,控制流体动力学模拟实验系统中灌流液的流速,以实现对实验细胞施加不同的流体剪应力。按实验细胞在实验系统中所承受的不同流体剪应力,将实验细胞分为低剪应力组(A组;0.4 Pa)、中剪应力组(B组;0.8 Pa)和高剪应力组(C组;1.2 Pa)。每组HUVECs包含3个细胞玻片,每个玻片经实验系统灌流液反复循环流经12 h。采用蛋白质印迹法对各组细胞中GRP78和CHOP蛋白水平进行检测,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应技术测定各组细胞GRP78和CHOP蛋白及其信使RNA(mRNA)相对水平。应用GraphPad Prism 8.0软件对数据进行统计学分析。结果(1)A、B、C组HUVECs中GRP78蛋白相对表达水平分别为1.33±0.46、0.93±0.34、0.64±0.30;多组间比较差异有统计学意义(F=36.17,P<0.05)。A组GRP78蛋白相对表达水平高于B组、C组(均P<0.01),B组GRP78蛋白相对表达水平高于C组(P=0.0013)。3组HUVECs中CHOP蛋白相对表达水平分别为:A组1.29±0.38,B组0.90±0.34,C组0.59±0.29;多组间比较差异有统计学意义(F=41.27,P<0.05)。A组CHOP蛋白相对表达水平高于B组、C组(均P<0.01),B组CHOP蛋白相对表达水平高于C组(P=0.0004)。(2)A、B、C组HUVECs中GRP78 mRNA相对表达水平分别为18.3±3.4、11.3±1.8、5.4±2.2;多组间比较差异有统计学意义(F=189.20,P<0.05)。A组GRP78 mRNA相对表达水平高于B组、C组(均P<0.01),B组GRP78 mRNA相对表达水平高于C组(P<0.01)。3组HUVECs中CHOP mRNA相对表达水平分别为:A组20.4±3.8,B组14.2±2.1,C组7.8±1.3;多组间比较差异有统计学意义(F=171.80,P<0.05)。A组CHOP mRNA相对表达水平高于B组、C组(均P<0.01),B组CHOP mRNA相对表达水平高于C组(P<0.01)。结论低流体剪应力可能增加HUVECs中GRP78、CHOP的蛋白及其mRNA表达水平。

梯度流体剪应力下破骨前体细胞迁移与胞内钙分布的关联性

目的阐明局部梯度流体剪应力(fluid shear stress,FSS)是否会造成胞内Ca^(2+)浓度梯度的特异性分布,并最终决定细胞的迁移方向。方法利用COMSOL软件对流动腔内FSS分布进行数值模拟。建立FSS作用下破骨前体细胞RAW264.7胞内Ca^(2+)染色方法,并对细胞施加梯度FSS,定量分析胞内Ca^(2+)浓度分布和动态变化以及细胞迁移参数。结果破骨前体细胞更倾向于向低FSS区域迁移,且振荡流会调节细胞内Ca^(2+)沿细胞迁移方向分布,当阻断力敏感阳离子选择性通道、磷脂酶C、内质网钙信号通路和清除细胞外钙后,细胞向低FSS方向的迁移速度显著降低,但是沿液体流动方向的迁移速度显著增强。同时,细胞沿液体流动方向的Ca^(2+)分布显著升高。结论梯度FSS作用下,破骨前体细胞可以感受到这种梯度效应,且胞内Ca^(2+)沿迁移方向的特异性分布,最终导致破骨前体细胞向低FSS区域迁移。研究结果为最终阐明动态外力作用下骨组织重建的细胞和分子机制提供了较为重要的基础数据。

梯度流体剪应力下细胞膜张力的数值模拟

目的分析梯度流体剪应力(fluid shear stress,FSS)流场中细胞膜张力分布。方法构建梯度平板流动腔模型,采用流固耦合数值模拟方法,研究不同FSS梯度和幅值、不同静水压下细胞膜的膜张力分布。结果当流动腔入口流量增大时,FSS流场梯度呈正比例增大。梯度FSS流场下,细胞膜张力由贴壁侧向顶部呈先减小后增大的趋势。在正常人体血压下,静水压越大,细胞膜张力越大。当FSS幅值一定时,增加FSS梯度,细胞高、低FSS区域平均膜张力差值增大;当FSS梯度一定时,增加FSS幅值,细胞高、低FSS区域平均膜张力差值增大。结论梯度FSS流场会引起细胞膜张力的局部差异,其可能是破骨前体细胞在梯度流场中定向迁移的重要原因。

可用于体外培养破骨细胞的流体剪应力系统

基于传统的平行平板流室理论和方法,设计制作一套可用于破骨细胞等细胞经受流体剪应力作用的实验系统。用金属夹具和医用硅橡胶密封圈封闭流室,同时不影响流室高度的准确性。调整载玻片与上储液池液面到同一水平面,降低了液体静压力对细胞的影响。此系统可用于研究破骨细胞等细胞在形态学、生理生化等方面对剪应力的反应。

流体剪应力对大鼠破骨细胞骨吸收活性的影响

探讨流体剪应力对大鼠破骨细胞骨吸收活性的影响。我们采用低温离心法获取6月龄健康雌性SD大鼠椎骨骨髓细胞,以1.6×106细胞密度种植于血盖片上,采用1,25-(OH)2维生素D3体外诱导获取破骨细胞。于破骨细胞诱导的第7d取出细胞爬片,置于流体剪应力装置中,分别加载5.97、11.36、16.08、20.54dyne/cm2大小的流体剪应力,持续30min,以未加载流体剪应力的破骨细胞为对照组。实验结束时,以2.5%戊二醛固定细胞爬片,置于0.25mol/L氢氧化铵液超声处理10min,清除细胞爬片上的破骨细胞,经1%硪酸固定,梯度酒精脱水,醋酸异戊酯置换酒精,CO2临界点干燥,喷金后扫描电镜观察骨吸收陷窝并计数,图像分析法测定骨吸收陷窝的面积;同时分别收集每次灌流液10ml,冻干,用1ml复溶后,紫外分光光度仪检测抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)活性的变化。结果显示:在本实验中所选用的流体剪应力可增强破骨细胞TRAP活性,而骨吸收陷窝的数量和面积也增加,尤其是剪应力在16.08dyne/cm2时,破骨细胞TRAP活性增强以及骨吸收陷窝的数量和面积增高最为明显。结果表明,一定范围内的流体剪应力可以增强破骨细胞的骨吸收活性。

流体剪应力对成骨细胞的作用研究

研究了生理范围内不同大小的流体剪切力对成骨细胞增殖分化和功能的影响,从细胞水平验证流体剪切力在骨组织力学适应性中发挥的重要作用。运用流室系统提供精确可控的流体剪切力,对原代培养的大鼠颅骨成骨细胞施以5、10、20、30mN/cm2的剪切力刺激,分别在加载后的3、6、9、12、24、36h采集样品,检测细胞周期分布,碱性磷酸酶活性,胞外钙质分泌的变化。5mN/cm2和10mN/cm2的剪应力促进细胞增殖,进一步增大会有抑制作用,而5、10和20mN/cm2的剪应力对ALP活性和胞外钙分泌均有促进作用,并且与静态培养相比ALP活性高峰期提前,30mN/cm2表现出抑制效应。结果显示成骨细胞的增殖、分化、矿化均能受到剪应力的调节,这种调节表现出对剪应力大小的依赖性。

流体剪应力对成骨细胞OPG和ODF表达的影响

通过平板流动腔装置对大鼠成骨细胞施以流体剪应力,研究剪应力作用对成骨细胞中骨保护因子(osteoprotegerin,OPG),破骨细胞分化因子(osteoclast differentiation factor,ODF)基因表达的影响.分别考察了剪应力大小和作用时间,以及单一水平和梯度变化的剪切力加载方式的影响.运用RT-PCR和蛋白质印迹技术检测OPG、ODFmRNA和蛋白质表达的变化,结果显示,剪切力作用下OPG的表达得到促进,ODF的表达受到抑制,mRNA与蛋白质表达的变化一致,这种影响与剪切力的大小和作用时间有关.1.0和1.5N/m2的剪应力作用效果比0.5N/m2明显,梯度变化的作用方式在作用效果上与最后一个梯度水平相当的恒定剪应力单独作用没有显著差异,在加载的24h内剪应力对OPG、ODF表达的影响始终存在.这种影响使得OPG/ODF的平衡向着OPG占优的方向发展,这种变化意味着骨吸收会受到抑制,提示力学刺激可能通过OPG/ODF调控系统对骨代谢平衡进行调控.

流体剪应力作用下VWF-A1A2A3介导的血小板P-选择素的原位表达

目的探讨流体剪应力(fluid shear stress,FSS)对VWF-A1A2A3介导的血小板表面P-选择素表达的影响。方法利用平行平板流动腔实验系统,以CD62P:FITC作为血小板表面P-选择素表达的指示剂,采用荧光显微镜观察分析在不同FSS条件(0、1、2 Pa)下,血小板经由VWF-A1A2A3特异介导黏附后P-选择素表达随时间的变化过程,提取特征参数。结果 FSS扣动了血小板激活并产生P-选择素表达的扳机,激活比率受FSS大小和持续时间的正向调节,在1 Pa和2 Pa时的最高激活比率分别为9.42%和14.59%;P-选择素表达水平随FSS作用时间的延长先提高后降低,呈现一个"双相"的变化过程,最佳作用时间为7.5 min;P-选择素表达的荧光峰值随剪应力的增加而上升。结论血小板P-选择素表达受FSS和VWF-A1A2A3的协同调控,表达水平与力信号的持续时间相关。

流体剪应力作用于间充质干细胞对其诱导内皮分化后抗氧化能力的影响

探讨流体剪应力对间充质干细胞(MSCs)诱导的内皮细胞抗氧化能力的影响。体外培养大鼠骨髓MSCs,于流室中加载不同强度的流体剪应力,加载后向内皮细胞系诱导,检测所得细胞总抗氧化能力(T-AOC)、一氧化氮(NO)生成量的变化。流体剪应力对MSCs体外诱导所得内皮细胞的总T-AOC、NO均有上调作用,并呈强度依赖关系。流体剪应力对骨髓MSCs体外诱导培养的内皮细胞具有保护性作用,为缺血性心脏病的细胞治疗及心血管组织工程提供了理论基础。

生理水平流体剪应力对三维多孔支架中成骨细胞力学敏感性及黏附、分化的影响

目的 构建可以达到生理剪应力水平的三维流动模型，研究流体剪应力对成骨细胞黏附、分化及力学敏感性的影响。方法 利用灌注式流动腔对生长在β-磷酸三钙（β-TCP）多孔支架内的MC3T3-E1成骨样细胞施加不同强度的流体剪应力6 h，比较加载组和静态组的细胞活性表征细胞黏附；一氧化氮（NO）和碱性磷酸酶（ALP）表征力学敏感性和细胞分化。采用流固非线性耦合的数值计算，获得支架内各流量下的剪应力分布。结果 平均剪应力小于0.4 Pa，细胞的黏附率为74% - 81%；0.41 Pa时，黏附率为60.22%。NO的产生率在加载后5 min达到最大，15 min显著降低，30 min后产生率趋近于0。在0.232 - 0.304 Pa平均剪应力强度范围，ALP水平随着剪应力的升高显著增强（P〈0.01）；而在0.304 - 0.412 Pa范围，剪应力增加对ALP水平的改变无显著影响（P〉0.05）。结论 生理水平剪应力条件下，支架内大部分细胞可以维持正常黏附。三维条件下细胞力学敏感性与剪应力变化率成正比，与二维条件的规律相同。支架内平均剪应力小于0.304 Pa，剪应力显著促进细胞分化；大于这一剪应力，细胞分化水平不再明显变化。该研究有望加快骨组织工程的实现。

流体剪应力对EA．Hy926细胞IL-8受体mRNA表达的影响

为研究EA．Hy926细胞在不同时间、不同大小流体剪应力作用下IL-8受体CXCR1、CXCR2 mRNA的表达规律,通过体外培养人脐静脉内皮细胞株EA．Hy926细胞,分别施加5．56、10．02、15．27 dyn／cm2三种剪应力,选取剪切5 min、10 min、15 min、20 min、25 min和30 min、1、2、4和8 h等10个时间点进行观测,以半定量RT- PCR方法检测IL-8受体mRNA表达变化。结果表明,在5．56 dyn／cm2剪应力作用下,与静止组相比,各时间点CXCR1 mRNA与CXCR2 mRNA表达均显著升高(P<0．05)。在10．02 dyn／cm2剪应力作用下,CXCR1 mRNA表达随时间相对缓慢下降;而CXCR2 mRNA表达在30min出现短暂的升高,然后随着作用时间的延长开始缓慢下降。在15．27 dyn／cm2剪应力作用下,其CXCR1、CXCR2 mRNA的表达随时间呈现较显著性降低(P<0．01),当持续作用4 h以上其CXCR2 mRNA表达极低。以上结果表明,不同强度、作用时间的流体剪应力参与调节IL-8受体表达。

流体剪应力对血管内皮细胞的作用研究与应用

血管内皮层具有重要的生理功能。血流剪应力作用影响内皮细胞的形态结构。功能、增殖和迁移过程，其作用是通过应力转导途径实现的。对应力转导的深入研究，不仅揭示了人体血管内的许多生理过程，解释动脉粥样硬化等心血管疾病的病理机理，而且可将其机理应用于改进临床治疗手段。

流体剪应力在骨髓基质干细胞成骨向分化中作用机制的研究进展

细胞在体内受到流体剪应力、机械应变、流体静压力等机械应力的作用,其中流体剪应力（fluid shear stress,FSS）被认为是维持骨稳态及骨改建过程中最重要的应力。目前研究多集中在FSS对骨细胞及成骨细胞的作用上,骨髓基质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）的研究相对较少。BMSCs对骨改建及治疗具有重要的意义,BMSCs对FSS的应答越来越受到关注。BMSCs对FSS的反应涉及细胞骨架、基质刚度及弹性、成骨信号等方面。总结FSS在BMSCs内的力转导机制、对其分化及功能的改变等方面的研究进展,为今后构建组织工程化骨、骨病变的治疗等研究提供思路。

流体剪应力作用下E-选择素介导的中性粒细胞钙响应

目的探讨流场下E-选择素介导的中性粒细胞钙响应过程。方法采用平行平板流动腔结合荧光显微镜,在0~600 m Pa流体剪应力（fluid shear stress,FSS）下,实时观察中性粒细胞在不同浓度E-选择素上的黏附及随后产生的钙响应。结果在流场环境下E-选择素可特异性介导中性粒细胞的稳定黏附和钙响应,细胞的黏附数和激活比率随浓度的提高而逐渐增加。只有固定的E-选择素才能传递力信号来有效触发细胞的钙响应,FSS的增加不仅提高了细胞的激活比率（从23%增至70%）,增加了钙响应的强度（从0.92增至1.45）,而且大大缩短了细胞自黏附到钙响应启动的时间（从70 s减为27 s）。结论 FSS和E-选择素协同调控中性粒细胞的钙响应,FSS对钙响应的速度和水平实行正向调节。研究结果可深化血流环境下白细胞免疫响应过程的理解。

vWF-A1突变与流体剪应力协同调控的血小板整合素的激活

目的当炎症及血管受损时,血管内皮细胞会分泌血管性血友病因子vWF,通过结合血小板表面的糖蛋白受体GPIba捕获循环血小板,进而激活整合素αIIbβ3导致血小板的铺展、积聚及止血栓的形成。因此,探明VWF突变及血流环境对vWF-A1/GPIba介导的血小板黏附及整合素活化的影响,对血管性血友病病理过程的理解和临床治疗均有重要意义。

ATRA处理后HL-60细胞表型及响应流体剪应力运动特征的改变

目的急性早幼粒白血病(APL)是急性髓细胞白血病的一种特殊类型。目前APL治疗过程仍易发生严重出血和危及生命的分化综合征(DS)。与其他类型白血病患者治疗相比,APL患者仍然存在较高的死亡风险。通过全反式维甲酸(ATRA)处理可诱导人APL细胞分化。而ATRA分化的APL细胞是否能像正常嗜中性粒细胞(neutrophils)在流场下响应炎症信号。

以骨内流体剪应力为主要影响因素的骨结构演化规律研究

目的人们早已发现骨组织会通过骨重建过程优化其结构以适应变化的力学载荷环境。力学载荷作用下骨内孔隙结构中的液体流动所产生的流体剪应力是使骨组织细胞产生生物学响应并调控骨重建的主要因素,但其具体的作用机制仍不明确。提出以破骨细胞作为力学感受器的骨结构演化理论,并通过有限元模拟的方法,对不同影响因素作用下的骨结构演化规律展开研究。方法通过编写两种骨结构演化算法,即将骨细胞作为力学感受器、探测固体应变能密度(固体驱动算法)。

流固耦合模拟研究振荡流作用下细胞表面流体剪应力分布

目的骨重建过程中,破骨前体细胞会定向迁移至微裂纹处进行骨吸收。在骨微裂纹处的间隙液会产生梯度流体剪应力场,那么该流场环境下破骨前体细胞发生定向迁移是否与细胞表面的局部壁面流体剪应力(FSS)的分布极性有关?为回答此问题,需要明确液体流动作用下细胞表面的流体剪应力分布是否具有极性。

基于六孔板的细胞流体剪应力加载装置

目的体液流动产生的流体剪应力可以调控细胞的增殖、分化、凋亡、迁移等过程。目前体外常用平板流动腔对细胞施加流体剪应力,但此装置具有使用不便、易造成细胞污染等缺点,不利于细胞长期加载。借鉴锥板黏度计的原理,设计一种新型细胞力学加载设备。方法基于细胞培养常用的六孔培养板,设计锥板流动腔。然后利用有限元方法模拟分析锥板转动情况下底板上细胞所受的流体剪应力,并研究多个物理参数对于壁面流体剪应力分布的影响,最后根据计算结果优化装置设计。

不同速度增加的剪应力对干细胞分化的调节

间充质干细胞(MSCs)在创伤或化学物质刺激后会被招募到肌肉骨骼系统中,在微环境的刺激下分化为骨或软骨细胞。流体剪切应力(FSS)在肌肉骨骼系统中对组织的发育、功能以及修复至关重要。前期的研究表明不同速度增加的FSS通过调节阳离子选择性通道(MSCC),细胞内钙水平和F-actin可以刺激MSCs向不同方向分化。0-0’促进MSC朝软骨向分化,相比之下,0-2’促进MSCs朝成骨向分化,0-20’引起适度的成骨和软骨形成表型(0-0’、0-2’、0-20’分别表示从静置后的0 min,在0、2和20 min内剪应力大小以线性速度从0 dyn/cm^2增加到10 dyn/cm^2)。此外,还发现20 min FSS的分化效果与5 d的化学刺激和2 d的硬度基底诱导相当,证明FSS是MSCs分化控制的有效调节手段。在本研究中继续对FSS调控MSCs分化的机制进行研究。发现0-0’和0-2’处理组Lamin A的表达量最高,0-20’处理组最低。当用siRNA将Lamin A的表达降低后发现,成骨分化的关键转录因子runx2的表达没有变化,但是软骨细胞分化的关键转录因子sox9的表达量显著降低。本研究表明,MSCs对不同的FSS具有极高的敏感度,这为训练骨质疏松症和骨关节炎患者提供参考依据。