流式微球捕获芯片技术检测森林脑炎患者外周血细胞因子及淋巴细胞亚群变化

目的 用流式微球捕获芯片技术及流式细胞术,分析蜱传脑炎（Tick-borne encephalitis,TBE）患者与健康体检者外周血中细胞因子及淋巴细胞亚群百分比的差异.方法 选取2015年5月至2016年9月因蜱咬伤而在内蒙古林业总医院住院且血清森林脑炎病毒特异性抗体IgM阳性和（或）IgG≥1∶20的患者纳入TBE患者组;牙克石地区健康成年体检者纳入对照组.采用流式微球捕获芯片技术检测两组研究对象外周血细胞因子IL-17A、IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-6、IL-4和IL-2的含量,流式细胞术分别检测外周血T淋巴细胞（CD3＋、CD3＋CD8＋和CDTCD4＋）、B淋巴细胞（CD3-CD19＋）和NK细胞（CD3-CD16＋CD56＋）的细胞百分比.采用秩和检验和t检验分别比较两组间细胞因子含量和细胞百分比的差异.结果 TBE患者组外周血中7种细胞因子含量均高于对照组,差异均有统计学意义（P均值＜0.05）;TBE患者组外周血CD3＋CD19＋细胞百分比为（14.40±6.69）,高于对照组（10.87±3.26）,差异有统计学意义（t=3.34,P＜0.01）,但两组间其他细胞的细胞百分比均无统计学意义.结论 血清IL-17A、IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-6、IL-4、IL-2及外周血B淋巴细胞的变化在森林脑炎免疫炎症反应中发挥作用,可以作为森林脑炎的辅助检查指标.

基于间接竞争原理的流式微球技术快速检测麦芽中赭曲霉毒素A

建立了一种快速、灵敏检测中药麦芽中赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)含量的间接竞争流式微球方法。麦芽样品经60%甲醇/PBS提取,加入20%甲醇/PBS溶液稀释5倍后,离心取上清液制备样品。在编码荧光微球上偶联牛血清白蛋白-OTA(BSA-OTA)复合物,与样品中OTA竞争结合抗OTA特异性抗体,然后加入FITC-IgG孵育,离心洗涤后,用流式细胞仪检测微球表面的平均荧光强度,实现样品中OTA的准确定性定量测定。本方法检测OTA的半数抑制浓度IC_(50)为1.20 ng/mL,相关系数R^2=0.9892,检出限(IC_(10))为0.12 ng/mL,加样回收率为93.9%~97.4%,RSD<3.6%。16份实际麦芽样品中检测到2个阳性样品,OTA的最高含量为3.83μg/kg,未超出欧盟的OTA限量标准,与液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法检测结果相一致。本方法简单、快速、灵敏、可靠,可拓展用于其它复杂基质中多种真菌毒素的定性与定量检测。

流式微球技术在小分子化合物免疫检测中的应用

流式微球分析技术具有高通量、灵敏、快速且可同步进行多参数分析等特点,在过去的几年里主要应用于医疗诊断等领域,而用于小分子化合物的识别与检测的报道较少。该文介绍了小分子化合物流式微球免疫检测技术原理和临床疾病诊断、治疗方面的应用,探讨并分析了目前该技术存在的问题,展望了其在食品安全、环境监测等领域的应用前景,为开展小分子化合物流式微球检测技术研究提供了新的思路。

量子点流式微球技术定量检测血清胃癌相关抗原MG7的方法学建立及评价

目的建立一种基于量子点流式微球技术检测胃癌相关抗原MG7的方法,并对该方法进行评价。方法将兔抗人MG7多克隆抗体与5μm聚苯乙烯微球耦联,与MG7结合,加入鼠抗人MG7单克隆抗体,最后加入生物素化羊抗鼠Ig G和链霉亲合素化量子点,通过流式细胞仪检测量子点平均荧光强度（mean fluorescent intensity,MFI）。对该方法的灵敏度、线性范围、精密度、干扰实验、阳性临界值等指标进行初步评价,并检测19例胃癌、23例胃溃疡、25例浅表性胃炎、21例萎缩性胃炎/增生患者和25例体检健康者血清MG7水平。结果聚苯乙烯微球粒径均一性好,2 h为最佳耦联时间,耦联率为67.43%。方法检测灵敏度为0.21 ng/m L,线性范围为0.39~100 ng/m L。体检健康者混合血清及胃癌组混合血清的变异系数分别为10.43%和7.87%。低浓度胆固醇（6.50 mmol/L）、胆红素（0.15 mmol/L）和三酰甘油（18.00 mmol/L）对检测干扰较小。ROC曲线下面积（AUCROC）为0.922,最佳临界值为15.00 ng/m L。胃癌组血清MG7浓度显著高于体检健康组、浅表性胃炎组、胃溃疡组、萎缩性胃炎/增生组（P均〈0.01）;萎缩性胃炎/增生组MG7浓度显著高于体检健康组、浅表性胃炎组、胃溃疡组（P均〈0.01）;胃溃疡组MG7浓度高于体检健康组（P〈0.05）;以15.00 ng/m L为临界值时,胃癌阳性检出率为73.68%。结论本实验建立的量子点流式微球技术可用于血清胃癌相关抗原MG7的定量测定,其检测性能良好,检测结果与临床疾病发展规律相符合。

流式微球技术检测血小板特异性抗体的研究进展

血小板特异性抗体的产生是引起特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)病人血小板减少及巨核细胞成熟障碍的重要原因,其诊断缺乏特异性的临床表现,主要依靠血小板特异性抗体的检测。单克隆抗体特异性血小板抗原固定术(MAIPA)是检测血小板特异性抗体的"金标准",具有高特异性、低敏感性等特点,但由于操作繁琐、耗时等原因未在临床实验室推广使用。近年来,基于流式细胞术检测血小板特异性抗体的技术研究报道,其敏感性高于MAIPA,解决了部分操作及耗时的问题,并具有利用微球编码进行联立血小板抗体检测等优点。本文就近年来该检测方法的研究进展作一综述。

流式微球分析技术检测人心肌钙蛋白T方法的建立

目的建立流式微球分析技术(cytoometric bead assay,CBA)检测人肌钙蛋白T(cTnT)方法。方法用鼠抗人的cTnT的单克隆抗体包被在已激活的羧基化聚苯乙烯微球上,然后再用包被好的微球与检测标本进行抗原抗体免疫反应,并加入羊抗人cTnT的多克隆抗体和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的驴抗羊的IgG,室温避光免疫反应一定时间后洗涤一次,上流式细胞仪检测FITC的荧光强度,以此测定标本中cTnT含量。结果通过正交试验,在100μl反应体系中,微球含量大约为1.25×106,选择10μg的鼠抗人cTnT单克隆抗体为最佳加入量,加入标本和抗体后,选择避光反应时间为120 min,洗涤选择一次,选择8μg/ml羊抗人cTnT多克隆抗体和20μg/ml FITC标记驴抗羊IgG为最佳工作浓度;方法检测灵敏度为16.0 pg/mL,线性范围是16-5 000 pg/mL,批内重复性变异系数为5.2-11.3%,回收率是94.7-111.5%,高浓度的胆红素、胆固醇和甘油三脂无明显干扰,与Roche Elecsys的电化学发光法有较好的相关性。结论自建CBA检测cTnT技术性能较好,可在临床工作中推广使用。

流式微球技术检测血小板特异性抗体

目的建立流式微球技术检测血小板特异性自身抗体方法,并对方法学及临床应用进行初步探讨。方法用包被抗血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰb、Ⅱb、Ⅲa、Ⅱb/Ⅲa单克隆抗体的微球捕获与血小板GP结合的特异性抗体,加入FITC标记的羊抗人IgG抗体后用流式细胞仪检测分析。结果特发性血小板减少性紫癜(ITP)组4种单抗荧光强度比值与非ITP血小板减少组和正常对照组有显著性差异(P<0.01);若将ITP组患者4种单抗荧光强度比值分别大于正常对照组上限1.37、1.24、1.48和1.19判断为阳性,则流式微球技术检测血小板特异性自身抗体的敏感性为73.2%,特异性为94.3%;4种单抗联合检测总体敏感性明显高于改良间接单抗特异的血小板抗原固定试验(MAIPA)(P<0.05),且大于各单个抗体检测敏感性。结论流式微球技术可以简便、快捷地检测血小板膜糖蛋白特异性抗体,联合检测多种自身抗体可以提高检测阳性率,对于ITP的诊治具有一定的临床价值。

量子点流式微球技术检测抗胰岛素抗体方法学建立

目的将量子点荧光探针应用于流式微球技术,创建出量子点流式微球技术检测人抗胰岛素抗体的方法并对其偶联率、精密度、线性范围、灵敏度进行初步评价。方法将胰岛素与羧基化微球偶联制备免疫诊断微球,与血清或标准品中人抗胰岛素抗体结合后,加入兔抗人IgG抗体,最后加入生物素化的羊抗兔IgG抗体和链霉亲和素化的量子点,使微球表面呈现荧光,并通过流式细胞仪检测平均荧光强度(mean fluorescent intensity,MFI)并记录。结果羧基化微球偶联胰岛素的性能显著强于空白微球,偶联0.5～3 h为最佳偶联反应时间,偶联成功的免疫诊断微球放置4℃冰箱至少可稳定50 d。微球偶联微球表面所携带荧光MFI与所测抗胰岛素抗体浓度成正比,量子点流式微球技术检测同一标本的灵敏度(3.74 pg/ml)、精密度(8.24%)、线性范围(3.74～5 000 pg/ml)都优于酶联免疫吸附试验所测得灵敏度(24.53 pg/ml)、精密度(12.31%)、线性范围(24.53～2 500 pg/ml)。结论本实验创建的量子点流式微球技术可用于人血清抗胰岛素抗体测定,其检测性能良好。

流式微球分析技术联合检测Cys C、NGAL方法的建立及其在肾移植术后CMV感染患者中的应用

目的建立流式微球分析技术联合检测胱抑素(Cys)C和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的方法,并初步研究两者在肾移植术后巨细胞病毒(CMV)感染患者血清中的含量变化。方法实验方法的建立包括检测微球包被的效果和稳定性,优化Cys C和NGAL的检测含量范围,确定生物素化抗体浓度,确定PE-链霉亲和素浓度,绘制标准曲线图确定相关系数。采用该法检测对照组(10名健康人)、CMV阴性组(10例肾移植术后CMV-pp65阴性患者)和CMV阳性组(20例肾移植术后CMV-pp65阳性患者)的血清Cys C和NGAL含量。结果成功建立流式微球分析技术联合检测Cys C和NGAL的方法。对照组、CMV阴性组和CMV阳性组的血清NGAL含量分别为8 759(1 465)pg/ml、10 472(856)pg/ml、12 817(4 533)pg/ml,依次升高且差异有统计学意义(P<0.001)。3组间Cys C比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论本实验建立流式微球分析技术联合检测Cys C和NGAL标准曲线的方法相关性和重复性良好,并初步验证NGAL含量在肾移植术后CMV感染中明显升高,提示肾移植术后CMV活动性感染可能对肾小管造成急性损伤。

流式微球分析技术检测人心肌钙蛋白T的方法学性能评价

目的对自建的流式微球分析技术(Cytoometric bead assay,CBA)检测人肌钙蛋白T(cTnT)的方法进行性能评价。方法参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)系列文件,结合工作实际,对方法的精密度、准确度、分析灵敏度、分析测量范围、回收试验、干扰试验进行了评价,并进行试验比对。结果 CBA检测cTnT在高低浓度范围内批内变异系数分别为5.21%和11.31%,批间变异系数分别为6.24%和13.16%,准确度相对偏倚在3.17%～5.39%之间,回收率在94.7%～111.5%之间;检测灵敏度为16.00ng/L,分析测量范围为16.00～5000ng/L,人体正常含量或含量偏高的三酰甘油、胆固醇和胆红素对cTnT检测的干扰很小,与电化学发光分析技术无显著差异。结论自建CBA检测cTnT技术性能较好,符合公认的质量指标,可在临床工作中推广使用。

流式微球分析技术检测Hs-CRP对冠心病的临床诊断价值评价

目的探讨流式微球分析技术检测人血清中高敏C反应蛋白(Hs-CRP)水平对冠心病诊断的临床价值。方法采用流式微球分析技术检测健康人群和冠心病患者血清中Hs-CRP水平,用统计软件对其临床诊断效能进行评价。结果健康对照人群和患者血清标本中Hs-CRP水平差异有显著性。疾病组内不同病理类型(稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛和急性心肌梗死)之间Hs-CRP的检测结果差异均有显著性。根据Hs-CRP的ROC曲线下面积(AUC)进行统计分析,血清Hs-CRP水平用于诊断冠心病有显著意义,诊断灵敏度为87.5%,特异性为82.5%。结论血清中Hs-CRP水平对冠心病的诊断和分层有一定的应用价值,值得在临床上推广。

流式微球技术及量子点在实验室诊断中的应用进展

实验室诊断是医学诊断的重要内容。随着生物化学、分子生物学、基因组学及蛋白组学的飞速发展，大量未知生物大分子不断被发现，实验室诊断面临着巨大的挑战。近年来，随着高分子微球技术和纳米量子点技术逐步用于实验室诊断，极大地提高了诊断的灵敏度，某些极微量生物大分子可以简便快速地被检测出来。现将流式微球技术及纳米量子点在实验室诊断中的应用进展情况综述如下。

流式微球分析技术联合检测血清MMP-9、MPO CD40L和t-PA的方法学建立及评价

目的建立流式微球分析技术联合检测人血清中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、髓过氧化物酶(MPO)、CD40配体(CD40L)、血浆纤溶酶原激活物(t-PA)的方法并对其进行系统性评价。方法分别将四种选择好一定浓度的捕获抗体(MMP-9、MPO、CD40L和t-PA鼠抗人单克隆抗体)包被在四种已激活的不同荧光强度编码的羧基化聚苯乙烯微球上,用棋盘法对试验条件进行优化选择,并应用CLSI的有关规则进行方法学评价。结果反应体系中四种鼠抗人单克隆抗体最佳加入量为10μg,最佳生物素标记抗体浓度为1:4000倍稀释,最佳反应时间为2h,亲和素最适孵育时间为1h。MMP-9线性范围是0.20～333.33ng/mL,批内变异系数为4.60%～8.80%,批间变异系数为8.80%～9.60%,准确度相对偏倚为2.80%～3.18%,回收率是94.8～102.50%,灵敏度为0.20ng/mL;MPO线性范围是0.26～111.11ng/mL,批内变异系数为5.90%～7.70%,批间变异系数为9.10%～11.40%,准确度相对偏倚为1.44%～4.12%,回收率是97.8～103.2%,灵敏度为0.26ng/mL;CD40L线性范围是0.32～111.11g/mL,批内变异系数为5.40%～6.50%,批间变异系数为8.90%～12.40%,准确度相对偏倚为2.72%～5.95%,回收率是97.20～105.30%,灵敏度为0.32ng/mL;t-PA线性范围是1.21～111.11ng/mL,批内变异系数为2.20%～2.90%,批间变异系数为6.30%～12.20%,准确度相对偏倚为1.23%～4.60%,回收率是97.20～101.30%,灵敏度为1.21ng/mL。高浓度的甘油三酯、胆固醇和胆红素对四种因子有一定的干扰率,低浓度的甘油三酯、胆固醇和胆红素对三种因子干扰较小。分别与ELISA方法比较无显著差异。结论自建的MMP-9、MPO、CD40L和t-PA1流式微球联合检测技术,可拓展流式细胞分析技术,值得临床推广使用。

应用流式微球技术检测慢性特发性血小板减少性紫癜患者的血小板特异性抗体

目的应用流式微球技术(CBA)检测血小板特异性抗体,评价其在慢性特发性血小板减少性紫癜(CITP)诊断中的价值。方法对40例CITP患者(GITP组)、20例非免疫性血小板减少症(NITP)患者(NITP组)及20例健康体检者(健康体检组)的血液标本进行分离提取血小板,将血小板裂解后与包被过的微球孵育,之后加入FITC标记的山羊抗人IgG多克隆抗体,流式细胞仪分析。对3组标本的平均荧光强度值与阴性对照的荧光强度值比较,计算比率。结果CITP组、NITP组及健康体检组荧光强度比率均值及上下限分别为5.50(0.59～22.89)、1.15(0.67～3.76)及1.05(0.39～1.59);非参数检验CITP组荧光强度比率均高于NITP组及健康体检组(均P<0.05),NITP组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。若将健康体检组上限作为界值,比率大于1.59为阳性,则CHA诊断的敏感性为92.5%,特异性为90.0%。结论应用流式微球技术检测血小板特异性抗体对CITP的诊断有应用价值。

流式微球技术定量检测血小板膜糖蛋白在ITP中的应用价值探讨

目的应用流式细胞技术检测血小板表面膜糖蛋白,评价其在血小板减少性紫癜(ITP)诊断中的价值。方法选取2013年1月至2015年2月门诊及住院部收治的77例ITP患者(ITP组)、43例非免疫性血小板减少症患者(NITP组)及同期进行健康体检的健康者30例(健康对照组)为研究对象。应用鼠抗人GPⅡb/Ⅲa单抗、GPIa/Ⅱa单抗、GP Ib/Ⅸ单抗包被微球,采集空腹静脉血分离血样中血小板,将血小板裂解后与包被过的微球共同孵育,应用流式细胞仪结合间接荧光免疫法检测并比较三组血小板表面膜糖蛋白。分析流式微球技术诊断ITP的敏感度与特异度。结果 ITP组患者血小板表面GPⅡb/Ⅲa、GPIa/Ⅱa、GP Ib/Ⅸ的水平均明显高于NITP组及健康对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),NITP组患者高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。流式微球技术对ITP的诊断敏感度为92.2%(71/77),特异度为89.0%(65/73),准确度为90.7%(136/150)。结论应用流式微球技术定量检测血小板膜糖蛋白对诊断ITP有应用价值。

自建流式微球分析技术联合检测动脉粥样硬化破裂标志物对急性冠脉综合征诊断价值的评价

目的探讨人血清中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、髓过氧化物酶(MPO)、CD40配体(CD40L)和组织型血浆纤溶酶原激活物(t-PA)水平含量对冠心病诊断的临床价值。方法采用自建的流式微球分析技术联合检测健康人群和冠心病患者血清中MMP-9、MPO、CD40L和t-PA水平,并进行酶联免疫吸附试验(ELISA)方法比对,用统计软件对这些因子的临床诊断效能进行评价。结果健康对照人群和患者血清标本中MMP-9、MPO、CD40L和t-PA水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),病例组内不同病例类型(稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛和急性心肌梗死)之间各因子的检测结果比较,差异有统计学意义(P<0.05),与ELISA方法比较差异无统计学意义(P>0.05),根据对各个因子工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)进行统计分析,血清MMP-9、MPO、CD40L和t-PA水平用于诊断冠心病有显著意义,各因子的诊断灵敏度分别为86.80%、83.43%、86.27%和88.58%;特异性分别为80.44%、84.62%、84.86%和78.27%。结论血清中MMP-9、MPO、CD40L和t-PA水平对冠心病的诊断和分层有一定的应用价值,值得在临床上推广。

流式微球分析技术检测重组人干扰素α-2b治疗的慢性乙肝患者血清干扰素-α浓度

目的探讨流式微球分析技术检测重组人干扰素α-2b（安福隆）治疗的慢性乙肝患者血清干扰素-α浓度的可行性。方法采集2012年6月～2014年10月的健康体检者和安福隆治疗的慢性乙肝患者血清及临床资料，采用流式微球分析技术检测慢性乙肝患者治疗组和健康体检人群血清干扰素-α浓度，并与ELISA方法进行比较。结果重组人干扰素α-2b治疗的慢性乙肝患者血清标本中,CBA法检测血清IFN吨的含量范围为15．85-641．40pg/mL，其浓度为（145．65±35．42）pg／mL；而ELISA法检测IFN-α的含量范围为10．43～495．90pg／mL，其浓度为（113．73±26．47）pg／mL；CBA法检测慢性乙肝治疗组IFN-α的含量略优于ELISA法（t=5．137,P=0．0065）。CBA法和ELISA法检测健康对照组中血清IFN—α的含量分别为（3．56±0．96）pg／mL和（3．49±0．92）pg／mL。结论流式微球分析技术能够很好检测血清中的干扰素-α的浓度，为临床上监测IFN—α治疗的慢性乙肝患者血清中的IFN-α的浓度提供参考价值。

流式微球分析技术应用于小鼠血清免疫球蛋白同种型的检测研究

目的：建立流式微球分析技术鉴定免疫球蛋白同种型的方法，为其应用于单克隆抗体制备提供参考。方法：采用绵羊红细胞致敏小鼠产生相应抗体，利用Mouse Immunoglobulin Isotyping CBA Kit检测血清中免疫球蛋白同种型及κ、λ轻链的表达。结果：阴性对照显示所有免疫球蛋白同种型检测阴性；标准样品1显示IgG1λ，IgG2bλ，IgAλ和IgG1κ，gG2bκ，IgAκ，IgEκ阳性，标准样品2显示IgG2aλ，IgG3λ。IgMλ和XgG2aκ，IgG3κ，IgMκ阳性；与标准一致。原血清检测显示所有免疫球蛋白同种型均阴性；血清1：10～1：10000稀释后检测结果显示IgMλ链及IgG1，IgG2a。IgG2b、IgG2b，IgG1，IgG2bκ链随稀释倍数不同有不同的表达。血清在1：1000～1：10000稀释范围检测结果较一致。其中又以1：5000为最佳检测浓度。而血清1：100稀释后虽然κ链的表达均能检测到，但与表达的水平不相关；血清1：100000稀释后只检测到IgG1，IgG2κ链的表达。结论：CBA方法分析免疫球蛋白同种型属于定性检测，方法灵敏、简便快速且便于大量检测，是目前鉴定免疫球蛋白同种型的较优方法。

流式微球分析技术检测急性心肌梗死患者血清肌钙蛋白T的临床意义

目的用自建的流式微球分析技术(CBA)对急性心肌梗死(AMI)患者和健康对照组进行肌钙蛋白T(cTnT)检测,并与电化学发光法进行比较,观察其临床应用价值。方法用鼠抗人cTnT的单克隆抗体包被在已激活的羧基化聚苯乙烯微球,使用羊抗人cTnT的多克隆抗体与cTnT结合,标记在驴抗羊多克隆抗体上的异硫氰酸荧光素(FITC)为指示剂,建立CBA。同时以电化学发光法作对照。结果 AMI组和对照组血清cTnT经CBA方法和电化学发光法检测,2组结果差异均有统计学意义。CBA方法和电化学发光检测结果比较差异无统计学意义,2种方法的回归方程为Y=0.987X+0.013,r=0.9976,具有显著的相关性。结论自建CBA检测技术检测cTnT,与电化学技术检测结果比较差异无统计学意义,具有显著的相关性,可在临床工作中推广使用。

ELISA、流式微球载体技术和胶体金渗滤法检测梅毒抗体的比较及评价

梅毒是由梅毒螺旋体（Treponema pallidum,TP）引起的一种性传播疾病,近年来我国的梅毒发病率有逐年上升的趋势。梅毒特异性抗体的血清学检查是梅毒诊断的重要依据。传统血清学检测方法有梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）和梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）。长期以来国内外都在不断探讨更灵敏或更快速的梅毒血清学检测技术。