纳米流式检测技术的研发、应用及前景

针对生命科学、生物医药、纳米科技等领域日益增长的单粒子水平纳米颗粒表征需求,本课题组将瑞利散射和鞘流单分子荧光检测技术结合,成功研发了纳米流式检测技术(nano-flow cytometry,nFCM),实现单个纳米颗粒(7~500 nm)以及细胞外囊泡、病毒、细菌、亚细胞器等天然生物纳米颗粒的粒径及其分布、颗粒浓度和生物化学性状的高灵敏、高选择性、高通量检测.本文对nFCM研发的重要性、挑战及如何实现超灵敏检测进行探讨,对基于该技术所发展的一系列生化分析新技术和方法进行综述,并对nFCM的应用前景进行展望.

纳米流式检测技术在细胞外囊泡临床诊疗研究中的应用

细胞外囊泡(EV)是细胞分泌的极具异质性的纳米小囊泡,携带着来源于母细胞的各种生物活性分子,广泛分布于各种体液中,近年来在液体活检和疾病治疗中显示出巨大的应用前景。然而,传统流式细胞仪难以检测粒径小于300 nm的EV。基于瑞利散射和鞘流单分子荧光检测技术研发成功的纳米流式检测技术(nFCM)将EV的检测下限推进至40 nm,通过单粒子水平的多参数同时检测,可实现粒径、颗粒浓度和多种生化性状的同时分析,并可应用于EV临床诊疗研究中。

窥探纳米世界:纳米流式检测技术的研发及单颗粒水平表征应用

纳米颗粒的准确表征对于推动生命科学认知、改善疾病诊断和治疗以及促进纳米科技的发展至关重要。由于纳米颗粒存在高度的个体差异性和异质性,迫切需要开发单颗粒水平的快速检测技术。基于瑞利散射与鞘流单分子荧光检测技术研发的纳米流式检测技术(nano⁃flow cytometry,nFCM),能够以每分钟高达10000颗粒的速率实现对人工合成纳米颗粒(7~500 nm)以及细胞外囊泡、病毒等天然生物纳米颗粒的粒径分布、颗粒浓度和生化性状的高灵敏、高选择性、高通量多参数分析。通过讨论nFCM研发的重要性、挑战、进展以及产业转化,回顾该技术在纳米颗粒研究中的应用,并展望其未来的应用前景。

应用流式细胞检测技术检测肺炎支原体患者外周血T淋巴细胞亚群的变化

目的:研究肺炎支原体患者实施流式细胞检测技术检测的价值及对外周血T淋巴细胞亚群变化的影响。方法:纳入本院(2015-10~2018-10)接收的肺炎支原体患者(n=47)作为研究对象(实验组),同期选择发热就诊者为对照组(n=40)对87例受检者实施流式细胞检测技术检测,评估其外周血T淋巴细胞亚群变化。结果:外周血T淋巴细胞亚群:实验组CD4^+T、CD3^+T、CD4^+T/CD8^+T低于对照组,CD8^+T高于对照组(P<0.05)。结论:肺炎支原体患者实施流式细胞检测技术检测的价值显著,其可明确评估患者的外周血T淋巴细胞亚群指标,进而进行辅助诊断,值得借鉴。

猴D型逆转录病毒p27基因的原核表达及流式免疫荧光微球检测技术的建立

目的构建猴D型逆转录病毒的p27蛋白,并建立流式免疫荧光微球检测技术用于猴D型逆转录病毒的检测。方法通过PCR扩增p27基因片段,与p GEX-4T-1表达载体进行连接,转化至BL21(DE3)进行表达。通过SDS-PAGE分析蛋白表达的形式及最佳诱导时间。采取GST树脂纯化目标蛋白,包被磁珠,建立流式免疫荧光微球检测技术,用于临床样本的检测。结果重组蛋白以可溶的上清液进行表达,诱导的最佳时间为4 h。包被磁珠后,成功建立流式免疫荧光微球检测技术,对阳性血清稀释81倍仍可检测为阳性,对猴类其他病原的阳性血清无交叉反应,特异性强,与ELISA法同时对24份临床样本进行检测,其中3份样品的流式免疫荧光微球检测结果为阳性,ELISA检测结果为2份阳性,1份阴性,两种方法的检测结果符合率为96%。结论成功表达猴D型逆转录病毒p27蛋白,并运用该蛋白建立了灵敏度高,特异性强,样本需求少的流式免疫荧光微球检测技术,为后续推广应用多重流式免疫荧光微球检测技术奠定了基础。

血小板计数检测方法学研究进展

血小板计数是临床诊断与治疗决策的重要依据,准确的血小板计数能够辅助临床做出正确诊断和采取有效的治疗措施。综述用于血小板计数的常用检测方法,包括外周血涂片血小板估测法、鞘流阻抗法、光学法、显微镜数字化成像技术和流式细胞仪间接计数法,分析上述方法的优劣和适用条件,介绍血小板计数的新型检测技术,以期为血小板计数检测方法的选择提供参考意见,为研发新的血小板计数方法提供思路。

细胞外囊泡的单颗粒分析技术

细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是细胞分泌到细胞外基质中的纳米尺度的脂质小膜泡,携带着母细胞来源的各种生物活性分子,如蛋白质、核酸、脂质等,是细胞间沟通交流的信使。EVs参与免疫调控、血管新生、疾病发生、肿瘤转移等生理病理过程,广泛存在于各种体液中,在液体活检、疾病治疗中显示出巨大的应用前景,也因此成为生命科学领域炙手可热的前沿研究方向。然而EVs在粒径、生化组成等方面具有高度的个体差异性和多样性。因此,迫切需要发展EVs的单颗粒分析技术以精准表征EVs亚群的分子组成,深入了解其生物学功能,促进EVs临床诊断与治疗应用的发展。该文针对近年来发展的EVs的单颗粒分析技术进行综述,从检测原理、性能和应用范围等方面对这些技术进行讨论,并对单颗粒表征技术未来的发展趋势进行了展望。

酵母细胞表面展示HIV-1 gp41用于血清中抗体的检测的研究(英文)

以Hexa-His和Flag为标签,利用酵母表面展示技术将HIV-1囊膜蛋白gp41展示于酿酒酵母(Saccharomycws cerevisiase)细胞MT8-1表面.流式细胞测定结果表明His标签成功展示于重组酵母细胞MT8-1/pICAS-His和MT8-1/pICAS-His-gp41表面;活性的gp41成功展于重组酵母MT8-1/pICAS-His-gp41表面,荧光显微镜观测结果表明了这一点;Flag标签可以在TM8-1/pICAS-Flag表面检测到,但Flag和gp41均不能在MT8-1/pICAS-Flag-gp41表面检测到活性.利用展示在酵母表面的gp41蛋白建立酵母细胞CbELISA体系,可成功用于检测单克隆抗体,其浓度达到了10 ng/mL,此体系可用于检测血清中的抗体.

GFP报告因子结合流式细胞术的蛋白-蛋白相互作用单细菌水平分析

在基于腺苷酸环化酶功能重构的细菌双杂交(BACTH)系统中引入lac启动子控制的gfp基因作为蛋白质相互作用的报告基因,采用实验室自行研制的超高灵敏流式检测装置(HSFCM)建立了一种单细菌水平的、简单、快速、高通量的蛋白-蛋白相互作用分析方法.将分别携带有相互作用蛋白对编码基因和gfp报告基因的质粒共转化至报告菌株,利用HSFCM对单个细菌的散射光和荧光同时进行检测.结果表明蛋白-蛋白相互作用激活了gfp报告基因的表达,并存在双稳态现象:即一部分细菌的gfp报告基因被激活,细菌荧光信号强度明显高于阴性对照组,而另一部分细菌的gfp报告基因未被激活,细菌荧光信号分布与阴性对照组重叠.利用HSFCM在单细菌水平对荧光信号强度和表达GFP报告因子的细菌比例进行分析,能有效地区分表达GFP报告因子的阳性菌和报告基因未被激活表达的阴性菌,揭示了细菌个体蛋白的异质性表达.这将为相互作用蛋白对的检测及筛选提供一种快速的分析方法.

右归丸抑制肾阳虚型慢性再生障碍性贫血患者Th17细胞活化的观察

目的:探讨右归丸对肾阳虚型CAA患者外周血中Treg/Th17细胞功能的调节作用。方法:对2组肾阳虚型CAA患者进行干预,其中加服右归丸设为观察组,另为对照组,均治疗30 d比较2组患者治疗前后Th17细胞百分比、p-STAT3、SOCS3、IL-6、IL-17、IL-23及RORγt的表达变化。结果:治疗前后CAA患者外周血Th17细胞百分率、IL-6、IL-17、IL-23、p-STAT3以及RORγt水平均高于健康对照组,治疗后观察组上述指标低于对照组,SOCS3表达则与上述指标趋势相反。结论:右归丸在抑制Th17细胞介导的炎症反应过程中具有重要作用,它通过抑制STAT3信号发挥作用,为自身免疫性疾病提供治疗靶点。

线粒体荧光标记的单颗粒水平高通量评估方法

线粒体是真核细胞能量代谢和信号转导的调控中枢,虽然各种灵敏、特异的线粒体荧光标记技术已经被广泛应用于线粒体研究,但仍缺乏单线粒体水平的荧光染色性能评估方法。基于超高灵敏流式检测技术(High sensitivity flow cytometry,HSFCM)能对单个线粒体进行高灵敏、高通量、多参数定量分析的独特优势,本研究发展了一种单线粒体水平的荧光标记高通量评估方法。将携带靶向线粒体绿色荧光蛋白基因的p Ac GFP1-Mito质粒转染至人宫颈癌He La细胞中,用G418筛选出稳定转染细胞,分别从瞬时转染和稳定转染的细胞中提取线粒体。此外,从未转染质粒的正常He La细胞中提取线粒体,分别进行Mito Tracker Green标记以及SYTO 62线粒体DNA染色,应用实验室自行研制的超高灵敏流式检测装置在单线粒体水平对这4种线粒体标记方法的荧光亮度、标记效率和稳定性进行评估。实验结果表明,稳定转染细胞中单个线粒体的绿色荧光蛋白(GFP)荧光亮度为瞬时转染的17.7倍,比Mito Tracker Green标记的线粒体亮度高约两个数量级,且标记稳定性好。本研究为线粒体标记方法的选择提供了一种先进的分析方法。

热盐水致胃黏膜细胞凋亡及对热休克蛋白表达影响

目的:研究热盐水灌胃导致的大鼠萎缩性胃炎(CAG)胃黏膜组织中的凋亡细胞、增生细胞和 Bcl-2、Fas、HSP60、HSP70、HSP90α及 P53表达状态,以探讨 CAG 发病机制及长期热咸饮食与慢性萎缩性胃炎发生的关系.方法:采用脱氧核糖核酸转移酶介导等缺口末端标记(TUNEL)技术及免疫组织化学染色技术.细胞凋亡时 DNA 含量分析采用流式细胞检测技术.结果:TUNEL 检测细胞凋亡显示:在热盐水所致的大鼠萎缩性胃炎中凋亡细胞数明显增多,在黏膜全层均可见到,呈弥漫性分布.萎缩性胃炎中凋亡细胞指数显著高于正常大鼠胃黏膜(P<0.05);免疫组化法检测凋亡相关基因和 PCNA,显示:Bcl-2、Fas、HSP60、HSP70、HSP90α、P53及 PCNA在热盐水灌胃所致的萎缩性胃炎中的表达率显著高于正常胃黏膜(P<0.05);流式细胞检测显示:在萎缩性胃炎时,在G0/G1峰前可见一个亚 G0/G1峰,也即凋亡细胞峰出现,而在正常胃黏膜时未显示亚 G0/G1峰.结论:热盐水灌胃可导致大鼠胃黏膜组织细胞增生和细胞凋亡异常,其调控基因(Bcl-2、Fas)及 HSP60、HSP70、 HSP90α、P53在热盐水所致的大鼠萎缩性胃炎发生中起重要作用.

血液系统肿瘤细胞系中CD34^+干细胞特性研究

目的探讨造血系统多种肿瘤细胞系中CD34+干细胞是否存在,并对其性质进行研究。方法利用流式细胞检测技术,检测了急性单核细胞白血病细胞THP_1、红白血病细胞MEL、慢性粒细胞白血病细胞K562,急性淋巴细胞白血病细胞MOLT_4,恶性淋巴瘤细胞RAJI,多发性骨髓瘤细胞RPMI8226、SP2/0和树突状细胞肉瘤DCS肿瘤细胞中CD34+的肿瘤细胞所占的比例。选取了MOLT_4和K562细胞系,分选出CD34+细胞,继续培养,观察CD34+细胞比例变化;比较CD34+与CD34-肿瘤细胞在功能状态、细胞周期、分化状态、耐药性的差异。结果8种不同类型造血系统肿瘤细胞中CD34阳性率依次为2·5%、5·2%、3·1%、2·1%、1·4%、0、0和6·2%。从K562细胞中分选出CD34+细胞,继续培养后恢复为原来比例。MOLT_4和K562细胞系中分离出的CD34+细胞RNA含量低、细胞处于G0/G1期的比率较高(81·5%和77·9%)、分化抑制蛋白Id_1表达强阳性/阳性(分化程度低)、多耐药蛋白p_gp高表达(耐药性强)。结论血液系统肿瘤细胞系中有一小部分肿瘤细胞带正常造血干细胞的标记,并且带有这种标记的细胞表现出更为原始的细胞特性,其中包括血液肿瘤细胞干细胞。

重组乙型肝炎表面抗原(汉逊酵母菌表达)免疫小鼠后不同细胞免疫测定方法的比较研究

目的探讨不同细胞免疫测定方法对小鼠免疫乙型肝炎表面抗原(HBsAg)后细胞免疫应答测定的影响。方法小鼠皮下接种HBsAg,于免疫后4、7、10、14和25d分离脾单个核细胞(MNC),应用酶联斑点法(ELISPOT)测定MNC细胞体外刺激后所产生的细胞因子IFN-γ斑点形成细胞计数(SFC),其中刺激物选择多肽和HBsAg;流式荧光检测技术(Luminex)测定MNC体外经HBsAg刺激后所产生的细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-10含量;小鼠血清检测抗-HBs。结果小鼠接种HBsAg后,应用ELISPOT法测定,7d和14d小鼠IFN-γ阳转率分别为60%和80%;而应用Luminex方法测定,7d和14d小鼠IFN-γ阳转率均为80%;IL-4、IL-5、IL-10阳转率分别为60%,80%;100%,100%;80%,100%;25d时,IFN-γ与14d比较统计学上差异有统计学意义(P25,14d=0.030,<0.05),而IL-5、IL-10和IL-4与14d比较差异均无统计学意义(P>0.05)。抗-HBs水平随时间而呈上升趋势。结论Elispot和Luminex法测定小鼠IFN-γ应答符合率高,小鼠接种单针HBsAg后细胞免疫应答高峰为免疫后7～14d。25d时IFN-γ分泌水平随抗-HBs抗体水平升高而下降,而IL-4、IL-5、IL-10分泌继续保持较高水平。

辛伐他汀对人高转移卵巢癌细胞HO-8910PM侵袭转移及Ras表达的影响

目的：研究辛伐他汀（SIM）通过抑制法尼基化途径对人高转移卵巢癌细胞HO-8910PM侵袭转移相关能力及Ras信号转导作用的影响。方法：以MTT法、流式细胞技术分析检测SIM对HO-8910PM细胞生长增殖和细胞周期的影响；用Transwell小室法及细胞粘附人工重组基底膜实验检测SIM对HO-8910PM细胞侵袭粘附能力的影响；RT-PCR、Western blot法检测SIM对HO-8910PM细胞Ras、ERK2表达水平的影响；采用7-32P掺人法检测MAPK活性。结果：（1）4～64μmol／L的SIM处理24～72h后，HO-8910PM细胞的生长增殖受到一定的抑制；各给药组内G1期细胞明显增多，G2、S期细胞减少，用药浓度高时有指示细胞凋亡的亚G1期“凋亡峰”出现。以上作用均有浓度一效应和时间依赖关系。（2）SIM能够明显地抑制HO-8910PM细胞的体外趋化运动、侵袭和粘附能力（P〈O．05）。（3）随用药浓度的增高，K-RasmRNA的表达没有明显的变化，细胞膜上Ras蛋白水平逐渐降低，胞浆中Ras蛋白水平逐渐增加，总Ras蛋白的表达变化不大；SIM能明显下调HO-8910PM细胞的ERK2蛋白表达。（4）激酶活性检测结果显示，SIM能明显抑制MAPK活性（P〈O．01）。结论：SIM能抑制人高转移卵巢癌细胞HO-8910PM的侵袭、运动和粘附能力。SIM抗肿瘤转移的作用机制与它们抑制某些蛋白（如Ras蛋白）的法尼基化反应有关。SIM能抑制Ras蛋白的法尼基化即抑制它锚定于细胞膜上，抑制了其生物活性，从而影响Ras-MAPK信号转导作用和其下游靶蛋白。

XT4000i全自动血液分析仪RET新参数的临床应用值探讨

近年来,随着科技的发展,血细胞分析技术得以快速的发展,特别是流式核酸荧光染色技术的应用,使血液分析仪的标本处理能力和血液分析参数更加完善.作为世界著名的血液分析仪制造商,日本Sysmex公司2010年推出的XT4000i全自动血液分析仪在网织红细胞（RET）的检测上应用了半导体激光流式细胞检测技术,同时结合多种细胞化学荧光染色,使之除进行网织红细胞计数和网织红细胞成熟度的分类外,还能检测网织红细胞的血红蛋白含量等,这极大地拓展了网织红细胞检测在临床上的广泛应用.

慢性乙型肝炎患者外周血中记忆T细胞亚群分布研究

目的了解慢性乙型病毒性肝炎患者外周血中CD4+、CD8+T细胞的分布,以及相应记忆细胞亚群的表达水平,为研究记忆T淋巴细胞在抗乙肝病毒感染中的作用提供基础。方法采用多色流式细胞仪检测技术,检测慢性乙肝病例和健康对照外周血单个核细胞(PBMC)中T淋巴细胞表面标志CD3、CD4、CD8、CD45RO、CD62L、CCR7的表达情况。结果乙肝组CD4+、CD8+T淋巴细胞分别占外周血PBMC的(11.56±5.78)%、(13.11±6.64)%,均低于对照组,差异均有统计学意义(P值均<0.05)。乙肝组和对照组外周血PBMC中,CD4+TEM的表达水平高于CD4+TCM,CD8+TEM的表达水平高于CD8+TCM,差异均有统计学意义(P值均<0.05);CD4+TEM、CD4+TCM所占CD4+Tm的比例,差异均无统计学意义(P值均>0.05);CD8+TEM、CD8+TCM所占CD8+Tm的比例差异无统计学意义(P值均>0.05)。结论慢性乙肝病例外周血PBMC中,CD4+、CD8+T淋巴细胞均减少。对照组和乙肝组外周血PBMC中,CD4+、CD8+T记忆淋巴细胞均以TEM为主。

中央记忆T细胞和效应记忆T细胞亚群在肝癌患者外周血中分布特点分析

目的研究肝癌患者外周血中CD45RO^+记忆T细胞(memory T cells,Tm)表面标志CD45RO、CD62L和CCR7的表达,以了解CD45RO^+CD62L~^+CCR7^+T细胞(中央型记忆T细胞,central memory T cells,TCM)和CD45RO^+CD62L^-CCR7^-T细胞(效应型记忆T细胞,effector memory T cells,TEM)亚群在肝癌患者外周血中的分布特点。方法获取正常人健康志愿者(正常对照组)28例和2011年8月至2013年8月的初诊慢性乙型病毒性肝炎患者(乙肝对照组)28例以及同期患有乙肝的肝癌患者(乙肝肝癌组)30例的外周静脉血,分离外周血单个核细胞(PBMC)。用多色流式细胞仪检测技术(polychromatic flow cytometry,PFC)检测外周血PBMC中记忆T淋巴细胞表面标志CD3、CD4、CD8、CD45RO、CD62L、CCR7的表达情况。结果乙肝肝癌组外周血PBMC中,CD4^+T淋巴细胞和CD8^+T淋巴细胞分别占外周血PBMC的比例显著高于乙肝对照组(28.15±12.32 VS 11.56±5.78,29.33±15.54 VS 13.11±6.64)(P<0.001,P=0.019);而较正常对照组无明显差异。乙肝肝癌组外周血PBMC的T淋巴细胞中CD4^+T_(EM)占CD4^+T记忆淋巴细胞比例显著高于乙肝对照组、正常对照组(93.78±5.63 VS 75.82±19.74,93.78±5.63 VS 68.25±15.65)(P=0.001,P=0.018),而CD4+TCM则显著低于乙肝对照组、正常对照组(0.55±1.02 VS 4.87±6.28,0.55±1.02VS 4.16±3.49)(P均小于<0.001)。三组的CD4^+TEM记忆细胞占外周血PBMC中CD4^+T记忆淋巴细胞的比例显著高于CD4^+T_(CM)记忆细胞占外周血PBMC中CD4^+T记忆淋巴细胞的比例(91.78±5.63 VS 0.55±1.02,75.82±19.74 VS 4.87±6.28,68.25±15.65 VS 4.16±3.49)(P值均小于0.001)。乙肝肝癌组外周血PBMC的T淋巴细胞中CD8^+TEM和CD8^+TCM占CD8^+T记忆淋巴细胞比例与乙肝对照组、正常对照组相比,差异均无显著意义。三组的CD8+TEM记忆细胞占外周血PBMC中CD8^+T记忆淋巴细胞的比例显著高于CD8^+TCM记忆细胞占外周血PBMC中CD8^+T记忆淋巴细胞的比例(80.12±13.56 VS 3.25±2.47,79.21±11.34 VS 4.44±7.19,73.33±16.88 VS 2.66±3.10)(P值均小于0.001)。结论在乙肝肝癌组、乙肝对照组和正常对照组中,无论是CD4^+T记忆淋巴细胞,还是CD8^+T记忆淋巴细胞,均以TEM占绝大多数,而TCM比例很小。乙肝肝癌组中,CD4^+TEM显著高于乙肝对照组和正常对照组,CD4^+TCM显著低于乙肝对照组和正常对照组,而CD8^+TEM和CD8^+TCM则与乙肝对照组、正常对照组均无明显差异。

Sysmex XE－2100全自动五分类血球分析仪常见故障分析及维护

日本东亚公司推出的全自动五分类血液分析仪Sysmex XE－2100是目前世界上测试速度最快的血细胞分析仪，可实现完全无人化的操作，每小时可检测150个标本。它具有灵活的七种检测模式和真正随机进样分析，能满足临床不同标本检测要求，并节约试剂成本；它除了采用传统的电阻抗法和射频法外还应用了半导体流式细胞检测技术，同时结合特殊的细胞化学试剂及荧光染料对外周血白细胞进行分类，