流式液相蛋白定量技术测定生物医用材料产品体液免疫评价中免疫球蛋白含量

该研究采用流式液相蛋白定量技术测定生物医用材料产品体液免疫评价中免疫球蛋白含量。选用牛源异种脱细胞真皮基质为试验样品,按照高、中、低剂量组植入至Balb/C小鼠皮下至4周。4周后用流式液相多重蛋白定量技术测定IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM,将试验组与对照组的数据进行统计学分析。结果表明,与阴性对照组相比,阳性对照组中IgG3、IgA含量未见明显差异,而IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM含量显著性高于阴性对照组;样品组高、中、低剂量组均未见明显差异。结果表明该方法适用于生物医用材料产品体液免疫评价中免疫球蛋白含量分析。

基于iTRAQ技术对低级别胶质瘤与正常脑组织差异性表达蛋白的初步筛选研究

目的应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术筛选低级别胶质瘤与正常脑组织的差异表达蛋白质。方法将6例低级别胶质瘤实体组织标本与2例正常脑组织标本各自混合后提取总蛋白,进行定量分析和酶解。iTRAQ标记后进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析。通过Mascot2.9软件进行相关图谱分析。结果有效鉴定出低级别胶质瘤与正常脑组织差异表达蛋白质162个,其中34个上调蛋白质,128个下调蛋白质,这些差异表达蛋白质具有多种生物学活性,参与不同的代谢以及信号通路。结论通过iTRAQ技术可有效鉴定出众多低级别胶质瘤与正常脑组织的差异表达蛋白质,为后续寻找低级别胶质瘤的生物标记物奠定基础。

流式微球捕获蛋白定量检测技术的原理与应用

流式微球捕获蛋白定量检测技术也被称为悬浮点阵技术、液态芯片技术,是基于流式检测技术和荧光微球捕获技术的液相、高通量、多重蛋白定量技术,基本原理是在荧光编码捕获微球表面进行的荧光标记液相抗原抗体反应,具有流式技术检测速度快、定量准确、多参数、高通量的特点,检测所需样品量小,可同时检测一个样品中数种到数十种可溶性蛋白,具有良好的可重复性,是固相酶联免疫吸附检测的一项良好的替代技术,在病毒感染、各类炎症、过敏性疾病、自身免疫病、肿瘤、移植、药物研发等相关的研究领域具有应用价值,在儿科危重病患儿的诊断和治疗、急性公共传染性疾病的研究和临床诊治中具有特殊意义。文章主要介绍流式微球捕获蛋白定量检测技术的技术原理、特点、应用与局限性。

^(18)O标记联合高效液相色谱-高分辨率质谱技术定量测定阿胶中的明胶

采用胰蛋白酶催化的^(18)O标记联合高效液相色谱-高分辨率串联质谱技术(high performance liquid chromatography-linear ion trap/Orbitrap high-resolution mass spectrometry,HPLC-LTQ/Orbitrap MS/MS)研究阿胶的特征性多肽的^(18)O标记情况和明胶混合物中阿胶、牛皮明胶的定量情况。结果表明,阿胶的特征性多肽均能被2个^(18)O原子标记,当^(18)O和^(16)O标记多肽以20∶1、10∶1、5∶1、1∶1和1∶5的质量比例混合时,检测到的^(18)O与^(16)O标记多肽比值分别为19.66、10.24、5.01、1.00和0.20。当阿胶和牛皮明胶质量比以1∶10、1∶1和10∶1混合,以^(18)O标记物为内标,检测到的阿胶与明胶比值分别为0.10、1.02和9.72。因此,胰蛋白酶催化的^(18)O标记联合HPLC-LTQ/Orbitrap MS/MS适用于阿胶产品中目标明胶的含量检测,可为阿胶产品的质量控制提供技术支撑。

鼠源炎症因子流式蛋白定量试剂盒的优化及初步应用

以小鼠炎症因子流式蛋白定量(cytometric bead array,CBA)检测试剂盒为参考,分别从降低试剂用量和缩短孵育时间两个方面进行优化,然后以沙门菌感染小鼠为模型,动态分析小鼠血清中炎症因子的分泌情况。结果表明,试剂用量由50μL降至20μL、孵育时间由2h缩短至30min仍然可以得到较好的检测效果。沙门菌感染小鼠后,利用该方法动态分析了小鼠血清中炎症因子的变化情况,并且发现炎症因子的早期分泌与沙门菌在小鼠体内的定殖呈正相关。通过CBA技术的优化和初步应用,为其推广应用提供了重要数据。

高效液相色谱-质谱联用技术在蛋白质检测中的应用

随着科学的进步,质谱从一种用来分析有机化合物的分子量和结构的强有力工具发展成了可以应用于生物大分子分析的必不可少的技术。近些年来,将具有强大分离能力的高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)发展迅猛,有着高灵敏度、高分辨率、专属性强等优点,在食品分析、药品分析、生物样品等中有着广泛的应用。本文对高效液相色谱-质谱联用技术在蛋白质组学方面与蛋白质的定性定量分析方面进行了综述。

iTRAQ技术及其在蛋白质组学中的应用

近年来随着蛋白质组学的迅速发展,其相应的方法学研究也取得了巨大的进步,一系列新技术融入了蛋白质组学研究中,极大地促进了这门学科的发展.相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术与高度敏感性和准确性的串联质谱及多维液相色谱联用技术已成为蛋白质定性和定量研究的主要工具之一.该技术可对复杂样本、细胞器、细胞裂解液等样本进行相对和绝对定量研究,具有较好的定量效果、较高的重复性.由于其能够同时对多达8种样品进行标记分析,故在生命科学的各个领域得到了广泛的应用.本文对iTRAQ的原理、实验流程、优缺点及近几年的应用进展进行综述.

初诊急性髓系白血病患者T细胞免疫球蛋白黏液素3和程序性死亡分子1的表达及临床意义

目的探索初诊急性髓系白血病患者T细胞免疫球蛋白黏液素3(Tim-3)和程序性死亡分子1(PD-1)的表达水平及其临床意义。方法回顾性选取2018年7月至2020年4月在聊城市第二人民医院住院及门诊初诊的34例急性髓系白血病患者和20例良性血液病患者作为研究对象,根据不同疾病分为观察组(急性髓系白血病,34例)和对照组(良性血液病,20例)。应用流式细胞术分别检测外周血CD3+T细胞Tim-3和细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)的表达水平,以及应用实时荧光定量PCR检测骨髓Tim-3 mRNA和PD-L1 mRNA的相对表达量,并进行对比分析。结果观察组患者的外周血CD3+细胞Tim-3的表达、骨髓Tim-3 mRNA均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001);观察组患者的外周血CD3+细胞PD-L1的表达、骨髓PD-L1 mRNA均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。结论初诊急性髓系白血病患者Tim-3和PD-L1表达水平升高,在急性髓系白血病免疫抑制微环境的形成中起到了一定作用。

iTRAQ技术及其在动物蛋白质组学中的研究进展

同位素的相对与绝对定量(iTRAQ)是一种全新且功能强大的蛋白质组学定量分析技术,该技术具有灵敏性高、重复性好、分析范围广和高通量等优点,其与多维液相色谱和串联质谱相结合,已经成为蛋白质组学定量研究的主要手段之一。近年来,iTRAQ技术在不断优化的同时,也已经在动植物、微生物等领域,以及在寻找蛋白质标记物、多时间点蛋白动态监测等方面被广泛应用。文章介绍了i TRAQ技术的基本原理、流程,并对i TRAQ技术在畜禽及模式动物蛋白质组学领域的研究进展进行了综述。

基于质谱进行低丰度靶向蛋白质定量的实验教学设计

质谱的多重反应监测(MRM)是蛋白质组学研究的常用技术,本文拟尝试基于质谱的低丰度靶向蛋白质定量检测,探索将此技术应用到教学实验中.课程以胰蛋白酶酶解的牛血清白蛋白为样品,涵盖了方法建立、色谱分离、质谱鉴定和数据分析完整实验流程.使学生可以深入了解到三重四级杆质谱仪的高灵敏度特性和在生命分析、医学研究中的应用.该实验融入了前沿领域的研究方法,也可用于其他蛋白质的实验教学,以开拓学生视野,提高学生的综合创新能力.

液相芯片技术在国内的发展现状

从20世纪90年代开始生物芯片已在全球进行应用,其最初用于基因序列分析、基因表达谱和基因突变体的检测等,主要用于基因分析,故又称为基因芯片或DNA芯片。而随着其被广泛应用于免疫反应、受体结合等领域,出现了蛋白芯片、细胞芯片和组织芯片等[1-2]各种生物芯片。 液相芯片是在20世纪90代中期发展起来的,又被称为xMAP技术,集流式细胞技术、激光、数字信号处理系统和传统化学技术为一体的,具有新型通量大、灵活性好,灵敏度高、动力学范围广等优点[3-4]。

多重微球流式免疫荧光技术对肺癌患者外周血IL-1β、IL-6、IFN-γ水平测定及与hs-CRP的相关性分析

目的探讨多重微球流式免疫荧光技术在肺癌患者外周血白细胞介素(IL)-1β、IL-6和干扰素γ(IFN-γ)细胞因子的表达情况及与超敏C反应蛋白(hs-CRP)相关性分析。方法采用回顾性研究的方法,选择张家港市中医医院(下称该院)肿瘤科和肺病科收治的30例肺癌患者作为肺癌组,另选择同期该院收治的30例肺炎患者作为肺炎组,同时选取同期该院体检健康者30例作为对照组,通过多重微球流式免疫荧光技术检测血清中IL-1β、IL-6和IFN-γ水平,同时利用乳胶增强免疫散射比浊法测定外周血全血中hs-CRP水平。结果肺癌组与对照组比较,IL-1β、IL-6和hs-CRP水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.001),而IFN-γ水平差异无统计学意义(P>0.05);肺炎组与对照组比较,IL-1β、IL-6、IFN-γ、hs-CRP水平均显著升高,差异有统计学意义(P<0.001);肺癌组与肺炎组比较,IL-6、IFN-γ、hs-CRP水平明显降低且IL-1β水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05);肺癌组、肺炎组IL-6和hs-CRP水平分别进行Pearson相关性分析,均无明显的相关性。结论IL-1β、IL-6、IFN-γ可以作为有效评估肺癌患者免疫功能的辅助指标,多重微球流式免疫荧光技术的应用对于肺癌的诊断及监测具有潜在的临床应用价值。

流式微珠阵列术在医学中的研究进展

随着高分子微球技术的日益创新,流式细胞术与高分子微球技术相结合的流式细胞微球芯片捕获技术也随之产生,流式细胞微球芯片捕获技术又称为流式微球分析技术、流式微球技术、流式微珠阵列术,具有检测灵敏度高、特异性强、分析速度快等优点,应用前景广阔。我们就流式细胞微球捕获芯片技术在医学中的研究进展做简要综述。

桑树硬枝扦插生根过程基部皮层的差异蛋白质组分析

应用同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)技术结合液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS),分析桑树硬枝扦插生根不同阶段插穗基部皮层的蛋白质组差异,为从分子水平研究桑树扦插生根调控机制提供基础信息。在扦插初期、膨大期、发根期3个阶段的插穗基部皮层共鉴定到4 427种蛋白质,通过对同位素报告基团相对含量的定量检测,共检出2 875种蛋白质。其中,扦插初期和膨大期的差异蛋白质有595种,扦插初期和发根期的差异蛋白质有660种,膨大期和发根期的差异蛋白质有231种。从表达差异显著的蛋白质中筛选出GDP-D-甘露糖基-3’,5’-异构酶、凝集素KM+、生长素IAA水解酶、热激蛋白hsp70、丙二烯氧化物环氧酶、细胞色素b6、过氧化物酶等可能与生根过程密切相关的蛋白质,通过GO功能注释和KEGG数据库比对分析,这些差异蛋白质在扦插生根中主要执行的功能包括代谢过程、多细胞组织进程、定位系统建立、生物学调控、刺激应答、细胞要素、细胞器要素、催化活性和蛋白质结合等,并主要参与次生代谢产物的生物合成、淀粉和蔗糖代谢、内质网蛋白质加工、苯丙素生物合成、糖酵解和糖异生等代谢通路。

AFP/CEA国产试剂在Luminex 200流式分析仪上的准确性与定标周期研究

肿瘤标志物在临床辅助诊断、治疗及术后疗效观察中发挥重要作用。液相芯片技术可在同一个实验中检测数种甚至几十种项目，临床应用广泛。在液相芯片系统上应用商品化试剂，必须对商品试剂的主要分析性能进行验证，即正确度、精密度等，有关这方面的报告也多见报道。本文对国产甲胎蛋白（AFP）／癌胚抗原（CEA）试剂在Luminex200流式分析仪上的准确性与定标周期展开相关研究，报道如下。

缺血性脑血管病不同时相血小板膜糖蛋白测定的临床意义

目的探讨缺血性脑血管病不同时相血小板膜糖蛋白(GP)测定的临床意义。方法采用定量流式细胞仪测定108例缺血性脑血管病患者(包括短暂性脑缺血发作20例、腔隙性脑梗死49例及脑血栓形成39例)和30例正常对照者外周血血小板膜糖蛋白GPⅢa(CD61)、GPⅠb(CD42b)、GPⅠa(CD49b)在病程不同时相〔(急性期(≤3d)、发病1周、2周及恢复期〕的表达。同时采用ESS评分评价神经功能缺损程度及其与GP的相关性。结果脑血栓形成的急性期、短暂性脑缺血发作的急性期和发病后1周,GPⅢa表达明显高于正常对照组(P<0.05);此两种疾病状态急性期均存在GPⅠb下降,差异无统计学意义(P>0.05);腔隙性脑梗死各期均未发现GPⅢa的明显表达。在病变恢复期,脑血栓形成中GPⅠa的表达明显高于腔隙性脑梗死(P<0.05);短暂性脑缺血发作急性期GPⅠa表达略升高,恢复期降低(P>0.05)。Pearson相关分析显示ESS评分与GPⅠb的表达呈正相关(r=0.233,P<0.05),偏相关分析显示GPⅢa、GPⅠb及GPⅠa两两之间均有相关关系。结论脑血栓形成和短暂性脑缺血发作的急性期均有GPⅢa和GPⅠb的明显活化,前者恢复期GPⅠa表达亦显著增加。血小板膜糖蛋白的改变可能反映血栓前状态,可作为一种有效评估某些缺血性脑血管疾病发展及预后的因子。

SLE合并SONFH患者血清差异表达蛋白筛查

目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)合并激素性股骨头坏死(SONFH)患者血清蛋白质组学表达差异,寻找并鉴定诊断SONFH的潜在生物学标志物。方法分别采集10例SLE合并SONFH患者(SONFH组)、5例健康者(对照组)的外周血,提取血清,去除高丰度血清蛋白质,采用同位素相对标记与绝对定量技术联合二维液相色谱-串联质谱技术进行蛋白组学分析,并进一步行GO和KEGG通路生物信息学分析,寻找并鉴定差异表达的蛋白质。结果与对照组比较,SONFH组共鉴定出16个差异表达蛋白,其中铜蓝蛋白、结合珠蛋白、IGHG1蛋白、免疫球蛋白重链1、C反应蛋白、补体C9、α1-酸性糖蛋白表达上调(P均<0.05),SERPINA4蛋白、凝溶胶蛋白、凝血因子Ⅻ、色素上皮细胞衍生因子、备解素、巯基氧化酶1、凝血因子ⅩⅢ、KRTDAP蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白3表达下调(P均<0.05)。KEGG通路分析提示以上16个蛋白与补体及凝血级联反应、系统性红斑狼疮、肌动蛋白细胞骨架调节、p53信号通路、卟啉和叶绿素代谢、FcγR-介导吞噬信号通路密切相关。结论成功从SLE合并SONFH患者血清筛选出差异表达蛋白,此16个蛋白可能是诊断SONFH的潜在生物学标志物。

超高效液相色谱-三重四级杆质谱法用于阿胶糕类食品中阿胶的鉴别及马、牛、羊、猪皮源成分的检测

目的:建立以特征肽为检测指标的阿胶糕中阿胶的鉴别方法与马皮、牛皮、羊皮、猪皮源成分的检测方法。方法:采用三氯乙酸沉淀法提取阿胶糕中的蛋白质,胰蛋白酶进行酶解处理,利用超高效液相色谱-三重四级杆质谱法(UHPLCQQQ MS),电喷雾离子源(ESI),正离子模式下扫描,采用多重反应监测模式,对特征肽目标离子进行检测。结果:经验证,鉴别方法和检查方法均均有良好的专属性,灵敏度高。市售样品测定结果显示,部分样品中检出阿胶成分,有的样品中检出牛皮源成分,有的样品中未检出任何皮源性成分。结论:所建立方法操作简便,专属性强,可用于阿胶糕中阿胶的鉴别和掺假杂皮胶的检测。

3种不同方法全自动自身抗体分析仪检测抗核抗体谱结果分析

目的探究临床常用的3种不同方法全自动自身抗体分析仪检测抗核抗体谱结果的差异。方法选取2021年4月至5月在蚌埠医学院第一附属医院确诊为系统性自身免疫病(autoimmune disease,AID)的患者72例作为AID组,留取患者相关项目检测剩余的血清样本72份,同时按照性别相同、年龄相近的原则,选取同期体检无AID的31例健康者作为对照组,留取血清样本31份。采用目前临床常用的进口全自动流式点阵发光免疫分析仪(方法A)、国产全自动流式荧光发光分析仪(方法B)和多重液相芯片免疫分析仪(方法C)分别检测两组患者血清样本中的10种抗核抗体,比较3种方法的检测阳性率,分析其阳性符合率、阴性符合率、敏感度、特异性等。为了帮助选择出对临床检验更可靠的方法学及检验设备,对3种方法进行两两比较,进行一致性评价。结果方法A、B和C与间接免疫荧光法检测的AID组阳性检出率均显著高于对照组(P<0.05)。采用方法A、B和C检测对照组10种抗体的结果均为阴性,AID组10种抗体检测结果中,方法B、C检测抗Sm抗体和抗SSA60抗体的阳性率均显著低于方法A(P<0.05),3种方法检测的其他抗体阳性率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。在方法A与方法B的一致性分析中,二者的平均符合率为92.22%,有1项一致性差,3项一致性一般,6项一致性好;方法A与方法C的一致性分析中,二者的平均符合率为93.89%,有5项一致性一般,5项一致性好;方法B与方法的一致性分析中,二者的平均符合率为92.65%。有1项一致性差,4项一致性一般,5项一致性好。结论目前两种国产品牌的全自动流式荧光发光分析仪和多重液相芯片免疫分析仪与进口全自动流式点阵发光免疫分析仪检测自身抗体总符合率较高,但是检测血清抗Sm抗体的一致性较差,应密切结合临床与其他实验室指标综合判断。

基于相对和绝对定量同位素标记技术对肥胖大鼠海马区差异蛋白组学的研究

目的筛选及鉴定肥胖大鼠海马区的差异蛋白表达。方法将24只SD大鼠随机分为单纯肥胖组(Ob,n=14)及正常对照组(NC,n=10)。予高脂高糖饮食制备单纯肥胖大鼠模型,采用相对和绝对定量同位素标记技术(iTRAQ)联合二维液相色谱-串联质谱(2D-LC-MS/MS)法鉴定肥胖大鼠海马区差异蛋白表达,对所获蛋白行生物信息学分析,Western blot法对筛选的部分差异蛋白进行验证。结果成功建立单纯肥胖大鼠模型,共鉴定出310种差异蛋白表达。于KEGG数据库检索筛选出26个差异蛋白显著富集的代谢通路。选取位于蛋白功能相互作用网络交叉点的4种差异蛋白行Western blot验证,发现蛋白表达水平与质谱结果一致。结论采用iTRAQ结合2D-LC-MS/MS技术,能有效筛选肥胖大鼠海马区差异蛋白表达,为研究肥胖对中枢神经系统损伤机制提供依据。