应用多重荧光标记的流式细胞分选技术检测小鼠肌卫星细胞数量及其分化能力的增龄性变化

目的应用流式细胞分选技术(fluorescence-activated cell sorting,FACS)分离检测不同鼠龄小鼠骨骼肌卫星细胞数量并观察其成肌分化能力。方法取雄性C57BL小鼠腓肠肌等组织,机械剪碎后胶原酶/分散酶联合消化,过滤离散细胞进行免疫标记染色,流式细胞仪分选CD45-/CD31-/Sca1-/ɑ7-integrin+细胞群体,培养分选细胞并进行Pax7和Desmin肌原性分子鉴定和分化诱导;观察比较青年、成年和老年小鼠骨骼肌组织中静止肌卫星细胞数量和成肌分化能力的变化。结果分选出的成年CD45-/CD31-/Sca1-/α7-integrin+细胞群体约占离散细胞总数的2%~3%,呈现Pax7、Desmin等染色阳性,经分化诱导能形成典型肌管并表达胚胎肌球蛋白重链(e MHC),青年组小鼠静止卫星细胞比例及每克肌肉内肌卫星细胞数量明显较高(P<0.05),老年组则明显下降(P<0.05),同时其肌管融合指数及大肌管比例明显减少(P<0.05)。结论基于多重免疫荧光标记的流式分选术能实现骨骼肌卫星细胞的快速高效分离,分选细胞可诱导形成肌管;老年骨骼肌组织肌卫星细胞数量与功能呈现显著下降。

流式细胞仪用于牛精液分选的技术要点

流式细胞仪应用于性控冻精生产是目前奶牛生产繁育性别控制技术的有效方法。本文阐述了流式细胞仪分离精子的工作原理及应用效果,并对流式细胞仪分离精子存在的问题进行了分析,提出了奶牛X精子和Y精子分离技术的展望。

人肺腺癌细胞系(LAC)中SP细胞亚群的分选及其干细胞特性分析

目的:分选人肺腺癌细胞系(LAC)中SP细胞(side population cells)亚群并分析其具有的干细胞特性。方法:运用流式细胞荧光激活分选技术(FACS)分选LAC中SP细胞亚群和非SP细胞亚群,利用MTT、体外克隆形成和皮下移植瘤试验分析其体内、外增殖能力,流式细胞仪分析细胞周期及细胞分化,RT-PCR方法检测其ATP结合盒转运蛋白(ABCG2)基因的表达情况。结果:流式细胞荧光激活分选结果显示:LAC中含有约1.88%的SP细胞亚群。MTT和体外克隆形成试验表明:SP细胞亚群的体外增殖能力显著强于非SP细胞亚群。同时,裸鼠皮下接种SP细胞亚群,其体内成瘤能力也要显著强于非SP细胞亚群。流式细胞仪分析结果表明:SP细胞亚群的G0/G1期比例显著高于非SP细胞(P<0.05)。细胞分化实验结果表明:两个亚群中SP细胞比率分别为(1.46±0.08)%和(0.12±0.04)%。RT-PCR结果显示:ABCG2基因mRNA在SP细胞亚群中的表达水平是其在非SP细胞亚群中的3.3倍(P<0.05)。结论:利用LAC中SP细胞亚群具有肺癌干细胞的特性,流式细胞荧光激活分选肺腺癌SP细胞亚群可能是分离肺腺癌干细胞的有效方法。

炎症性单核细胞亚群在自身免疫性疾病中的研究进展

单核细胞（monocyte，Mo）是重的固有免疫细胞，在免疫应答中参与吞噬病原微生物、呈递抗原、调控T细胞分化等过程．其功能的多样性提示循环中可能存在具有执行不同功能的单核细胞亚群。随着多色染色技术和流式细胞分选技术的迅猛发展，越来越多的研究发现单核细胞在人、鼠及其他哺乳动物中均存在异质性，许多疾病的发生发展也与单核细胞亚群的比例和功能变化明显相关。

CD133脐血干细胞对妊娠期糖尿病的影响

背景:脐血中含有大量的造血干细胞、丰富的间充质干细胞,与外周血及骨髓干细胞相比,新生儿脐血干细胞的异体排斥反应小,免疫原性低。目的:观察CD133脐血干细胞植入治疗小鼠妊娠期糖尿病的可行性,为临床妊娠期糖尿病的治疗提供新的途径。方法:采用高糖高脂喂养方法对孕鼠进行妊娠期糖尿病造模,流式细胞分选技术对脐血干细胞进行分离筛选。将筛选出的CD133脐血干细胞通过尾静脉植入妊娠期糖尿病小鼠体内,移植7 d后,测定小鼠空腹血糖、空腹胰岛素、总胆固醇和三酰甘油水平,采用苏木精-伊红染色观察小鼠胰腺组织的损伤和修复情况,采用胰岛素抵抗稳态模型分析小鼠胰岛素抵抗指数和胰岛功能。结果与结论:采用流式细胞分选技术可以从脐血单核细胞中分选出CD133脐血干细胞,分选纯度可达到(90.24±2.56)%;尾静脉移植脐血干细胞7 d后,妊娠期糖尿病孕鼠总胆固醇、三酰甘油水平、空腹血糖和空腹胰岛素水平均明显下降(P<0.05),胰岛素抵抗指数下降,胰岛功能改善(P<0.05),孕鼠胰腺组织萎缩情况逆转,炎性浸润减少。结果表明脐血干细胞移植可以使妊娠期糖尿病病情得到改善,可能与其修复胰腺损伤、降低胰岛素抵抗指数、改善胰岛功能有关。

CTC-EGFR对EGFR-TKIs一线治疗非小细胞肺癌的预后评价

目的探究CTC-EGFR表达在EGFR-TKIs一线治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的预后评价上的作用.方法选择NSCLC晚期患者81例,接受三种TKI类药物(吉非替尼、厄洛替尼、盐酸埃克替尼)中任何一种治疗1个月,治疗前随机抽取15例患者采集空腹静脉血,流式细胞分选技术分选外周血CTC并验证.采用流式细胞术检测所有患者治疗前及治疗后1个月的外周血CTC-EGFR表达,比较EGFR高表达者和低表达者的治疗效果(有效率和控制率)及生存情况.结果经流式分选技术筛选的CD45-CK18+细胞在光镜下可见如细胞核经染色加深、染色质变粗、细胞核质比增大等恶性肿瘤特征,证实CD45-CK18+细胞是外周血CTC;EGFR高表达者治疗有效率(74.1%)显著高于低表达者(23.8%),P<0.05;EGFR高表达者疾病控制率(89.7%)显著高于低表达者(40.5%),P<0.05;EGFR高表达者的中位PFS、中位OS以及2年生存率均显著高于低表达者(P均<0.05).结论EGFR高表达者采用EGFR-TKIS有较好的预后和治疗效果,临床上可通过检测外周血CTC-EGFR表达水平来判断EGFR-TKIs在治疗NSCLC上是否具有可行性.

利用慢病毒载体快速建立表达外源基因的哺乳动物细胞系

建立稳定表达外源基因的哺乳动物细胞系是一项重要的生物技术,介绍了联合使用慢病毒载体和流式细胞仪分选技术来建立稳定表达绿色荧光蛋白的293T细胞系。结果表明,在1个月左右的时间里即可获得表达绿色荧光蛋白的293T细胞系,阳性细胞率高达96.5%,而且建立的细胞系能够稳定传代。因此,联合慢病毒载体和流式细胞仪分选技术的策略对于建立稳定表达外源基因的哺乳动物细胞系快捷和可靠。

蛋白质定向进化的高通量筛选方法

定向进化是改造蛋白质分子的有效新策略。创建突变库的方法已经有很多而且比较通用,而建立有效的高通量的筛选方法是蛋白质定向进化成功的关键。本文综述了近几年发展起来的用于定向进化的高通量的文库筛选方法,介绍了各种展示技术及流式细胞分选技术的原理及其在文库筛选中的应用,分析了存在的问题及发展趋势。

两种生物除磷系统活性污泥中除磷菌的甄别——淀粉-缺氧/好氧交替与乙酸盐-厌氧/好氧交替系统

为了直接识别出污泥中的聚磷细菌和其种属,本研究采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色和流式细胞荧光分选技术(FACS)对以淀粉为唯一碳源的缺氧/好氧序批式活性污泥(SBR)系统(R1)的缺氧末期和好氧末期以及以乙酸盐为唯一碳源的厌氧/好氧SBR系统(R2)的好氧末期污泥的聚磷细菌进行了原位分选,并通过16S rRNA高通量测序技术鉴定了分选后细菌的种属.结果表明,在R1中,缺氧期和好氧期均进行生物除磷,且缺氧期吸磷量大于好氧期.R2中发生着厌氧期释磷、好氧期大量吸磷的传统生物除磷.利用FACS在R1和R2污泥中均分选得到106个相对纯度为85%的具有聚磷颗粒的细菌.测序结果表明,在R1系统中,缺氧段优势的聚磷菌属为Halomonas(37.75%)、unclassified Brucellaceae(14.15%)、Pseudomonas(6.49%)、unclassified Chlamydiales(0.027%)和Sphingopyxis(0.007%);好氧段优势聚磷菌属为Halomonas(19.72%)、unclassified Brucellaceae(14.62%)、Pseudomonas(14.28%)、unclassified Comamonadaceae(0.046%)、unclassified Acidobacteria Gp3(0.036%)和Ferruginibacter(0.026%).R1系统中unclassified Chlamydiales和Sphingopyxis仅仅在缺氧条件下具有聚磷功能,而unclassified Comamonadaceae、unclassified Acidobacteria Gp3和Ferruginibacter仅在好氧条件下才具有聚磷功能.在R2系统中,优势聚磷菌群为Dechloromonas(11.06%)、unclassified Anaerolineaceae(9.29%)、unclassified Bacteroidetes(7.44%)、unclassified Gammaproteobacteria(7.34%)以及Acinetobacter(0.31%).这意味着在新型的除磷系统(R1)中,参与除磷过程的细菌包括好氧,缺氧和兼性缺氧聚磷细菌,而在传统的除磷系统(R2)中,参与除磷过程的细菌仅为好氧聚磷细菌.

人结肠癌CW-2干细胞获取方法研究

目的运用3种不同的方法分离纯化人结肠癌CW-2干细胞,并对其分离纯化效率进行比较,探讨获得癌干细胞的有效方法。方法采用单纯无血清悬浮培养、无血清悬浮培养联合化疗药物、流式细胞分选技术分别富集人结肠癌细胞株CW-2干细胞;然后运用流式细胞术、NOD-SCID小鼠致瘤实验和Transwell侵袭实验分析比较3种方法的富集效率。结果无血清悬浮培养细胞,无血清悬浮培养联合化疗药物处理细胞和流式细胞仪分选技术分选后细胞中具有结肠癌干细胞特性的CD 44^+EPCAM^+细胞分别为(59.39±4.55)%、(74.36±6.78)%、(86.43±8.43)%;3群细胞的成瘤能力和侵袭能力都存在显著统计学差异(P值<0.05):流式细胞分选技术分选后细胞>无血清悬浮培养联合化疗药物处理细胞>单纯无血清悬浮培养细胞结论流式细胞分选技术富集癌干细胞的能力强于单纯无血清悬浮培养和无血清悬浮培养联合化疗药物,无血清悬浮培养联合化疗药物又强于单纯无血清悬浮培养。