自制红细胞裂解液对流式细胞术测定外周血T淋巴细胞亚群的影响研究

目的比较实验室配制的红细胞裂解液的裂解时间对流式测定SD大鼠和食蟹猴外周血T淋巴细胞亚群的影响。方法(1)取15只食蟹猴的肝素钠抗凝血各50μl,血样与荧光检测抗体Per CP-CD3/FITC-CD8/PE-CD4孵育后分别经自制和市售红细胞裂解液裂解一段时间,比较样本经自制与市售裂解液处理不同时间后其CD3~+CD4~+,CD3~+CD8~+和CD3~+淋巴细胞的平均荧光强度(median fluorescence intensity,MFI)等数值的差异;(2)取15只SD大鼠的EDTA-K2抗凝血各50μl,血样与荧光检测抗体APC-CD3/FITC-CD4/PE-CD8a孵育后,分别经自制红细胞裂解液和市售裂解液裂解一段时间,比较样本经自制与市售裂解液处理不同时间后CD3~+CD4~+和CD3~+CD8~+淋巴细胞的MFI等数值的差异;(3)取15只大鼠EDTA-K2抗凝血各50μl,血样与荧光检测抗体APC-CD3/PE-CD4孵育后,分别经自制红细胞裂解液和市售裂解液裂解一段时间,比较样本经自制与市售裂解液处理不同时间后PE-CD4~+的MFI差异。结果(1)食蟹猴外周血经自制红细胞裂解液,裂解时间约15min和5min的FITC-CD8~+的MFI分别为1745±173和2439±253,淋巴细胞百分比分别为47.9%±7.2%和42.1%±7.6%;裂解时间约15min和5min的PE-CD4~+的MFI分别为12924±892和13695±984,淋巴细胞百分比分别为38.7%±7.2%和33.1%±7.2%。裂解时间约15min比裂解5min的FITC-CD8~+(t=8.779,P<0.0001)和PE-CD4~+(t=2.250,P<0.05)的MFI降低;淋巴细胞百分比占比(t=2.139,2.162,均P<0.05)增高,差异具有统计学意义。食蟹猴外周血经市售红细胞裂解液裂解15min,FITC-CD8~+,PE-CD4~+,Per CP-CD3~+的MFI分别为2413±240,12428±1208和1015±123。与自制裂解液裂解5min比较,市售裂解液裂解15min的PE-CD4~+和Per CP-CD3~+的MFI降低,差异具有统计学意义(t=3.150,4.862,均P<0.01)。(2)SD大鼠外周血经自制红细胞裂解液,裂解时间5min和2min的FITC-CD4~+的MFI分别为55.72±14.10和225.08±12.44;裂解5min与裂解2min的FITC-CD4~+的MFI比较差异有统计学意义(t=34.89,P<0.001);SD大鼠外周血经市售红细胞裂解液,裂解5min和15min的FITC-CD4~+的MFI分别为277.02±30.36和310.04±43.56,PE-CD8a~+的MFI分别为3453.43±443.19和3211.28±357.85;裂解时间5min与裂解15min的FITC-CD4~+和PE-CD8a~+的MFI比较差异有统计学意义(t=2.409,P<0.01)。(3)SD大鼠经自制红细胞裂解液,裂解5min和2min的PE-CD4~+的MFI分别为1766±67,1765±51,差异无统计学意义(t=0.045,P>0.05)。结论与市售裂解液比较,自制红细胞裂解液可缩短裂解时间。将FITC荧光抗体更换为PE荧光抗体后,在一定的裂解时间内可消除对大鼠测定淋巴细胞MFI的影响;但随着裂解时间延长会造成FITC和PE荧光抗体MFI值的下降。

不同荧光标记检测抗体组合及不同抗凝剂对流式测定食蟹猴T淋巴细胞亚群的影响

目的比较不同荧光标记检测抗体组合与不同抗凝剂对检测食蟹猴外周血T淋巴细胞亚群的影响,为相关检测提供方法参考。方法取肝素钠抗凝猴血50μl分别与两组荧光检测抗体PerCP-CD3/FITC-CD8/PE-CD4(检测抗体组合1)和PerCP-CD3/FITC-CD4/PE-CD8(检测抗体组合2)孵育,流式细胞仪测定CD3^(+)CD4^(+)和CD3^(+)CD8^(+)淋巴细胞百分比和平均荧光强度(MFI),并计算CD3^(+)CD4^(+)和CD3^(+)CD8^(+)淋巴细胞比值,比较不同荧光标记抗体组合检测食蟹猴外周血T淋巴细胞亚群的结果。取肝素钠和乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝猴血各50μl分别与上述两组荧光检测抗体组合进行孵育,测定CD3^(+)CD4^(+)和CD3^(+)CD8^(+)淋巴细胞百分比和MFI,计算这两种淋巴细胞亚群比值,比较不同抗凝剂对食蟹猴外周血T淋巴细胞亚群检测结果的影响。结果⑴肝素钠抗凝猴血荧光检测抗体测定T淋巴细胞亚群的结果显示,FITC标记抗CD4抗体检测到的CD4^(+)T淋巴细胞百分比和MFI均显著低于PE标记抗CD4抗体检测到的CD4^(+)T淋巴细胞百分比和MFI,同样,FITC标记抗体检测到的CD8^(+)T淋巴细胞百分比和MFI均显著低于PE标记抗体检测到的相应结果,应用检测抗体组合2的CD3^(+)CD4^(+)/CD3^(+)CD8^(+)淋巴细胞比值显著低于应用检测抗体组合1的,雌、雄动物均出现前述结果,雌性动物的变化更为显著。⑵应用抗体组合1检测时,与肝素钠抗凝组相比,EDTA-K2抗凝剂组CD3^(+)CD4^(+)淋巴细胞百分比显著增加、CD3^(+)CD8^(+)淋巴细胞百分比和CD8^(+)MFI显著降低,CD3^(+)CD4^(+)/CD3^(+)CD8^(+)淋巴细胞比值显著增加;应用抗体组合2检测时,仅发现EDTA-K2抗凝组比肝素钠组CD8^(+)MFI显著降低,未见其他有意义的变化。结论FITC标记抗CD4抗体和抗CD8抗体检测相应细胞百分比和荧光强度均小于PE标记的抗体,在应用这两种荧光标记抗体进行T淋巴细胞亚群检测时应注意对试验结果的影响和合理分析。使用EDTA-K2抗凝对食蟹猴外周血CD8^(+)淋巴细胞测定结果有明显影响,在进行食蟹猴T淋巴细胞亚群测定时宜使用肝素钠抗凝剂。

红细胞天然免疫功能及其测定方法

目的:探讨红细胞天然免疫分子及功能的临床应用研究方法.方法:采用显微镜与液闪仪等测定红细胞各种天然免疫反应能力变.采用PCR扩增仪、酶联仪、流式细胞仪测定红细胞免疫分子的基因表达、数量变化.结果:用于不同研究目的检测方法在我国都已开展,并得到不同程度的普及.结论:这些检测方法在不同条件的医院及科研单位的基础与临床应用研究中有实用价值,可选择使用.

抱子甘蓝花培苗倍性的快速鉴定

采用花药培养获得加倍单倍体 (DH)是甘蓝类蔬菜自交不亲和系选育的主要方法之一 .然而 ,花药培养后代是倍性水平不同的混合群体 ,及早鉴定出真正的 DH具有重要的意义 .本文阐述 DNA流式细胞仪测定法和形态学鉴定法在花培苗倍性鉴定上的应用 ,并以抱子甘蓝的花培苗群体为材料 ,采用这两种方法鉴定其倍性组成 .结果表明 ,DNA流式细胞仪测定法可以鉴别群体的各种倍性水平 ,而形态学鉴别法可以把群体中的二倍体与单倍体、四倍体及其它倍体分开 .若以 DNA流式细胞仪测定法的鉴定结果为标准 ,苗期形态学鉴定的准确率可达 94.2 % .与 DNA流式细胞仪测定法相比 ,形态学鉴定方法具有更快速。

男子精液中的Fibronectin水平及其在原因不明性不育中的作用

输精管结扎后输精管吻合术已是一种恢复生育的有效方法,但输精管结扎后产生的抗精子抗体可引起精子自动凝集及制动。