甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗对小鼠的免疫原性观察

目的:观察国产甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗对小鼠的免疫原性。方法:将不同血凝素含量(20、30、40μg/ml)各3批甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗分别免疫小鼠,腹腔注射0.5 ml/只,每批疫苗又分为1针组、2针组,每组10只,2针间隔1周,同时设对照组。首针免疫后21天,分别采血,分离血清,检测血凝抑制抗体效价和中和抗体效价,观察疫苗的免疫原性。结果:血凝素含量为20μg/ml的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗1针组、2针组血凝抑制抗体效价均小于1∶40,中和抗体效价均小于1∶200;血凝素含量为30、40μg/ml的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗1针组、2针组的血凝抑制抗体效价均大于1∶40,中和抗体效价均大于1∶200;血凝素含量为30、40μg/ml的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗1针组和2针组的血凝抑制抗体和中和抗体效价比较,差异均无统计学意义。结论:血凝素含量为30μg/ml的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗接种1针即可达到理想的免疫效果。

亚单位流感疫苗对小鼠哮喘模型的影响

目的探索亚单位流感疫苗对哮喘模型小鼠的影响。方法将45只6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为PBS对照组、哮喘对照组、亚单位流感疫苗组。哮喘对照组与亚单位流感疫苗组小鼠于第0、7、14天,腹腔注射50μg鸡卵清蛋白(OVA)与2 mg氢氧化铝混合乳液,PBS对照组给予相同体积的PBS。第21、28天,亚单位流感疫苗组小鼠分别被肌注0.1 m L及滴鼻40μL亚单位流感疫苗。此后,第42、43、44天,哮喘对照组、亚单位流感疫苗组小鼠被OVA雾化激发连续3 d。最后1次雾化48 h,眼球取血后处死小鼠并进行肺泡灌洗,收集的肺泡灌洗液(BALF)用于细胞计数及分类;取肺组织进行HE染色检测病理学变化,ELISA测定血清Ig E及BALF中白细胞介素4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)、IL-5、IL-13水平。结果与PBS对照组相比,哮喘对照组及亚单位流感疫苗组均出现明显的炎症反应、黏液分泌增多、血清及BALF中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13水平均显著增高。然而,哮喘对照组与亚单位流感疫苗组间无显著差异。结论亚单位流感疫苗接种于哮喘小鼠,不会加重哮喘症状,是相对安全的。

抗三价流感病毒亚单位疫苗IgY防治小鼠流感病毒感染的实验研究

目的：探讨抗三价流感病毒亚单位疫苗IgY（Immunoglobulin Yolk）预防及治疗流感病毒感染小鼠的作用。方法：建立A/fm/1/47（H1N1）流感小鼠模型;分5组,观察各组小鼠死亡率,脾、肺指数及肺指数抑制率。结果：0.2%抗三价流感病毒亚单位疫苗IgY于攻毒前24、6、1小时滴鼻3次显著地预防流感病毒致死率（30.0%）,而攻毒后1、6、24小时分别滴鼻3次,此后每天滴鼻1次,持续5天,致死率为20.0%,两组与阳性对照组（致死率90.0%）、非特异性IgY预防和治疗组（致死率80.0%,70.0%）比较差异显著（P〈0.01）。0.2%抗三价流感病毒亚单位疫苗IgY预防组和治疗组肺指数显著低于阳性对照组（P〈0.05~0.01）,其治疗组也低于非特异性IgY预防和治疗组（P〈0.05）。结论：抗三价流感病毒亚单位疫苗IgY感染前后24小时内多次滴鼻能有效地预防和治疗流感病毒感染。

亚单位流感疫苗免疫效果与人群血型相关研究

目的探讨亚单位流感疫苗的免疫效果与A、B、O血型的关系.方法选择同一工作单位的54名,年龄22～66岁之间(平均年龄27.38岁)健康人作为调查对象.于2003年9月接种亚单位型流感疫苗,应用血凝抑制试验(HI)进行了流感抗体检测,同时依据血型分类.结果 54名被观察者均无局部或全身反应.H1N1、H3N2、B三个型别免疫阳转率分别达到96.40%～96.92%、93.62%～93.71%、90.41%～90.50%;抗体几何平均滴度分别增长5.83～5.88倍、4.63～4.70倍、6.26～6.32倍;H1N1型中B型血组高于A型组差异有显著性意义(t=-0.2110 P＜0.05),其余各型别血型组之间均差别无显著性.结论亚单位流感疫苗安全性好,免疫效果亦良好.提示:A、B、O不同种类血型对流感疫苗的免疫原性的反应存在一定差异.

一种用于流感病毒亚单位疫苗纯度分析的改进方法

目的:在SDS-PAGE方法的基础上建立一种改进方法,用于流感病毒亚单位疫苗中间体的杂质分析。方法:用糖苷酶F对不同亚型的疫苗中间体去糖基化处理后进行SDS-PAGE,与未经去糖基化处理的还原型SDS-PAGE结果进行比较。结果:去糖基化处理消除了血凝素的糖基化对电泳迁移率的影响,从而实现了血凝素亚基和杂质的电泳分离。结论:此方法应用于流感病毒亚单位疫苗中间体的杂质分析,较之常规的还原型SDS-PAGE方法具有更高的分辨力。

甲型流感病毒H1N1血凝素茎部亚单位疫苗与不同佐剂组合在小鼠中诱导的免疫应答与保护

通过真核表达系统表达并纯化流感病毒H1N1血凝素(Haemagglutinin,HA)茎部,将其与不同佐剂联合免疫小鼠,评价其免疫原性及攻毒保护效果。本研究以密码子优化且结构修饰的甲型流感病毒A/Brisbane/59/2007(H1N1)的HA茎部为目的基因构建真核表达质粒pcDNA3.1‐MiniHA(H1),转染HEK‐293T细胞,通过镍离子亲和层析柱纯化Mini‐HA。将Mini‐HA分别与Al(OH)_(3)、Al(OH)_(3)+CPG ODN、AddaS03^(TM)三种佐剂联合免疫小鼠,通过ELISA、ELISPOT和细胞内因子染色进行体液与细胞免疫检测,以H1N1‐PR8进行攻毒保护试验,监测小鼠存活率、体重变化、肺病毒载量以及肺组织病理变化,评估其保护效果。结果显示,Mini‐HA表达形成三聚体结构,Mini‐HA各组初次免疫后即可检测到针对HA茎部及全长HA的特异性IgG,加强免疫后抗体滴度显著增高;Mini‐HA联合Al(OH)_(3)+CPG ODN佐剂可以刺激Th1型细胞因子分泌,联合AddaS03^(TM)佐剂可以刺激Th1/Th2型细胞因子分泌;攻毒保护试验中,Mini‐HA联合Al(OH)_(3)+CPG ODN或AddaS03^(TM)佐剂组小鼠存活率达100%,体重下降低于5%,其中Mini‐HA联合AddaS03^(TM)佐剂组肺组织结构完整,仅见小部分肺泡腔代偿性扩张以及少量淋巴细胞浸润。本研究成功纯化了HA茎部蛋白Mini‐HA,联合佐剂免疫小鼠具有良好的免疫原性,以AddaS03^(TM)佐剂效果最好,可以诱导产生特异性体液与细胞免疫应答,保护小鼠抵御H1N1‐PR8流感病毒的攻击,有效抑制病毒复制、减少肺组织病理损伤。

流感病毒亚单位疫苗中间体中沙门菌快速检测方法的建立

目的:建立一种能够快速、准确地检测流感病毒亚单位疫苗中间体样品中沙门菌污染的方法。方法:首先利用选择性增菌培养基对样品进行增菌培养,然后提取样品中的细菌基因组DNA,通过沙门菌特异性引物对基因组DNA进行PCR扩增,以琼脂糖凝胶电泳实现对目的片段的检测。结果:该PCR反应体系的扩增检测灵敏度可达1 pg的沙门菌DNA,利用选择性增菌培养配合该PCR体系可在最快24 h内实现对沙门菌的准确检测,测定结果与传统方法相符。结论:此方法应用于流感病毒亚单位疫苗中间体的沙门菌检查,较之传统的培养法结合生化鉴定的方法,大大缩短了检测周期,降低了结果判读的难度,在实际生产中有很好的应用前景。

一款四价流感病毒亚单位疫苗在≥65岁健康人群中安全性和免疫原性的非劣效Ⅲ期临床试验

目的评价一款四价流感病毒亚单位疫苗在≥65岁健康人群中的安全性和免疫原性。方法采用随机、盲法、阳性对照的非劣效Ⅲ期临床试验,在河南省两个区县招募≥65岁健康人群,随机接种1剂次试验疫苗(试验组)或已上市的四价流感病毒裂解疫苗(对照组),观察免疫后0-30 d不良反应和6月内严重不良事件,分析发生率;检测免疫前后血清A(H1N1)、A(H3N2)、BV和BY流感病毒血凝抑制抗体,分析抗体阳转率和几何平均滴度(GMT)增长倍数。结果试验组和对照组受试者不良反应发生率分别为7.00%(28/400,95%CI:4.70%-9.96%)、5.25%(21/400,95%CI:3.28%-7.91%),所有不良反应均发生在免疫后0-7 d,无4级和严重不良反应。试验组免疫后A(H1N1)、A(H3N2)、BV、BY流感病毒抗体阳转率分别为78.99%(312/395)、87.85%(347/395)、82.03%(324/395)、79.24%(313/395),与对照组阳转率的率差(95%CI)分别为5.69(-0.24-11.61)、2.46(-2.28-7.20)、5.70(0.06-11.34)、5.94(0.03-11.85)。试验组免疫后各型流感病毒抗体GMT(1:)分别为314.43、331.43、134.96、305.19,与对照组GMT的比值(95%CI)分别为1.10(0.93-1.31)、1.21(1.03-1.43)、1.14(0.97-1.35)、1.28(1.06-1.53),分别是免疫前GMT的13.88倍、13.98倍、10.19倍、7.62倍。结论试验流感疫苗在≥65岁健康人群中具有较好的安全性和免疫原性,非劣于对照流感疫苗。

四价流感病毒亚单位疫苗在≥3岁健康人群中的免疫原性和安全性:一项随机、盲法、阳性对照设计的Ⅲ期临床试验

目的评价四价流感病毒亚单位疫苗在≥3岁人群中接种后的免疫原性和安全性。方法采用随机、盲法、阳性对照的设计开展Ⅲ期临床试验,于2020年5月至2021年8月,在河南省开封市祥符区和濮阳县招募符合标准的≥3岁健康居民为受试者,共3000名,按1∶1比例随机接种四价流感病毒亚单位疫苗(试验组)或已上市的四价流感病毒裂解疫苗(对照组),≥9岁受试者全程接种1剂,3~8岁受试者全程接种2剂(间隔28 d)。所有受试者采集首剂免疫前及免疫后28 d的血样进行流感病毒血凝抑制抗体(HI)检测,计算抗体几何平均滴度(GMT)、几何平均增长倍数(GMI)、阳性率、阳转率,并对试验组和对照组各型抗体GMT比值和阳转率率差进行非劣效比较。收集接种后30 d内的不良反应和6个月内的严重不良事件,比较两组间差异。结果3000名受试者中男性为1504名(50.13%)。所有受试者接种1剂流感疫苗免疫后28 d,试验组与对照组H1N1、H3N2、BV和BY 4种血清型抗体GMT(95%CI)分别为400.54(377.27~425.25)比333.39(315.47~352.33)、438.38(412.57~465.81)比385.00(362.13~409.32)、77.31(73.06~81.82)比67.62(63.94~71.51)、266.52(250.99~283.01)比180.26(169.99~191.17)(均P<0.05),4种血清型抗体阳转率(95%CI)分别为82.73%(80.70%~84.62%)比78.56%(76.39%~80.62%)、91.23%(89.67%~92.62%)比89.25%(87.56%~90.78%)、84.89%(82.96%~86.67%)比80.98%(78.89%~82.95%)、88.33%(86.58%~89.92%)比81.92%(79.87%~83.85%),除H3N2外,差异均有统计学意义(均P<0.05)。试验组和和对照组4种血清型抗体GMT比值的95%CI下限均>2/3、阳转率率差的95%CI下限均>-10%,与对照疫苗相比,试验疫苗免疫原性达到了非劣效标准。试验组阳转率95%CI的下限均>40%,阳性率95%CI下限均>70%、GMI均>2.5,试验疫苗免疫原性达到了绝对标准。所有受试者接种1剂流感疫苗免疫后30 d内,试验组和对照组总不良反应发生率分别为10.67%(160例)和11.21%(168例),其中18~64岁受试者试验组和对照组总不良反应发生率分别为6.29%(22例)和10.86%(38例)(P<0.05);不良反应主要症状包括疫苗接种部位疼痛和发热,不良反应严重程度以1、2级为主,试验组和对照组均未发生严重不良反应。结论四价流感病毒亚单位疫苗应用于≥3岁人群具有更好的免疫原性和较好的安全性。

四价流感病毒亚单位疫苗在3-64岁人群中的免疫原性评价

目的评价四价流感病毒亚单位疫苗在3~64岁健康人群中接种后的免疫原性。方法选择3~64岁的健康人群为研究对象,采用随机、盲法、阳性对照的非劣效试验,招募受试者后按1∶1随机接种相对应的实验疫苗或对照疫苗,受试者全程接种1剂。采集所有受试者免疫前和全程免疫后28 d的血样,血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)试验检测流感病毒H1N1、H3N2、B/Victoria(BV)和B/Yamagata(BY)血清抗体水平,分析抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)增长倍数、抗体阳转率和抗体保护率。结果符合方案分析集的共有3~64岁受试者2157例,其中实验组1074例,对照组1083例。两组受试者免疫前H1N1、H3N2、BV和BY型抗体GMT和抗体保护率差异均无统计学意义(P>0.05),两组基线均衡。全程免疫后,实验组各型别抗体GMT增长倍数分别为11.16、17.77、9.61和15.13,抗体阳转率分别为84.08%(903/1074)、92.46%(993/1074)、86.03%(924/1074)和91.71%(985/1074),抗体保护率分别为96.74%(1039/1074)、97.58%(1048/1074)、88.08%(946/1074)和94.97%(1020/1074)。实验组4个型别抗体GMT均较免疫前增长2.5倍以上,抗体阳转率95%CI下限均>40%,抗体保护率95%CI下限均>70%;实验疫苗与对照疫苗4个型别抗体的阳转率率差的95%CI下限均>-10%,GMT实验组/GMT对照组的95%CI下限均>2/3。结论在3~64岁人群中,实验疫苗具有较好的免疫原性,且非劣效于对照疫苗。

禽流感病毒M2蛋白研究进展

禽流感病毒M2蛋白是由97个氨基酸残基组成的同源四聚体,大量表达于感染细胞的表面,具有对病毒脱壳和出芽起重要作用的离子通道活性。M2蛋白不仅可诱导机体产生抗体,而且是CTL的靶抗原,因此可作为研究流感亚单位疫苗的靶蛋白。

老年人同时接种23价肺炎球菌多糖疫苗与流感病毒亚单位疫苗的安全性观察

目的提高老年人对同时接种23价肺炎球菌多糖疫苗(PPV23)和流感病毒亚单位疫苗的安全性认识。方法 2012年10-12月对符合接种条件的≥60岁的老年人在接种流感病毒亚单位疫苗的同时接种23价肺炎球菌多糖疫苗(须分别注射于不同手臂),观察接种后30 min内的即时反应、72 h内的局部反应和全身反应。结果不良反应发生率36.2%,发生的预防接种反应都是一般反应,并以局部反应为主,且无1人发生急性过敏反应和疑似异常反应。流感病毒亚单位疫苗的局部反应发生率为11.9%,低于PPV23(28.5%,χ2=20.07,P<0.01);健康老人与患有慢性疾病的老人同时接种疫苗后不良反应发生率差异无统计学意义(χ2=1.67,P>0.05)。结论老年人同时接种23价肺炎球菌多糖疫苗和流感病毒亚单位疫苗是安全的、可耐受的。

四价流感病毒亚单位疫苗的制备和检定

目的建立四价流感病毒亚单位疫苗制备方法。方法将4株毒种分别接种于9~11日龄的健康鸡胚尿囊腔中,在33~35℃培养箱培养48~72 h后,冷胚处理,收获尿囊液,经澄清、病毒灭活、裂解和纯化,除菌过滤制成单价疫苗原液;利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法,分析有效成分及纯度。将收获的4种单价疫苗原液进行混配,制成四价流感病毒亚单位疫苗。最终按《中华人民共和国药典》2015年版对成品疫苗进行全面检定。结果成功制备出四价流感病毒亚单位疫苗,其有效成分血凝素含量占总蛋白比例为91.4%。4种疫苗株血凝素含量分别为H1N1:30μg/ml、H3N2:34μg/ml、B1:36μg/ml、B2:30μg/ml,对成品的检定完全合格。结论本研究所制备的四价流感亚单位疫苗符合生产和检定规程要求。

亚单位流感疫苗中裂解剂壬苯醇醚-9含量HPLC检测方法的建立

目的建立亚单位流感疫苗中裂解剂壬苯醇醚-9含量的HPLC检测方法。方法采用4倍体积甲醇沉淀处理亚单位流感疫苗样品,HPLC色谱条件为：色谱柱：Thermo BioBasic-4 C4柱（4.6 mm×150 mm,5μm）,流动相：甲醇∶水=80∶20（v/v）,流速：1 ml/min,紫外检测器检测波长：275 nm,柱温：33℃,上样量：100μl。并对建立的HPLC法进行验证。结果建立的HPLC法检测壬苯醇醚-9标准品在5~2 500μg/ml浓度范围内线性关系良好;检测壬苯醇醚-9的专属性良好;检测壬苯醇醚-9在灭活流感全病毒提取液和亚单位流感疫苗中的回收率约为100%;检测各浓度壬苯醇醚-9标准品溶液和亚单位流感疫苗的日内和日间精密性均小于3%;检测限和定量限均为5μg/ml。结论建立的HPLC法简便、快速、准确,适用于实验室对亚单位流感疫苗中裂解剂含量的常规检测。

亚单位流感疫苗中裂解剂壬苯醇醚-9含量两种检测方法的比较

目的比较高效液相色谱法(HPLC)和紫外分光光度法检测亚单位流感疫苗中裂解剂壬苯醇醚-9含量的效果。方法分别采用HPLC法和紫外分光度法检测亚单位流感疫苗中间体和成品中壬苯醇醚-9的含量,并取中间体进行SDS-PAGE分析。结果紫外分光光度法测定亚单位流感疫苗成品和中间体的壬苯醇醚-9含量比HPLC法高10%以上,测定中间体3壬苯醇醚-9含量的结果差异更显著;SDS-PAGE分析显示中间体1、2、3的核蛋白(NP)含量差异显著,大多数存在于中间体3中。结论 HPLC法可代替紫外分光光度法检测亚单位流感疫苗中裂解剂壬苯醇醚-9的含量。

甲型流感病毒重组血凝素蛋白的真核表达及免疫效力分析

利用真核表达系统稳定表达HA重组蛋白并评价其免疫原性及攻毒保护效果,为重组流感亚单位疫苗的研制提供更多的理论基础。本研究以H1N1型流感病毒HA胞外区域序列为目的基因构建重组质粒KS001-HA并转染至CHO细胞得到表达重组蛋白rHA的单克隆细胞株,通过离子交换层析法纯化rHA。将rHA与佐剂联合免疫小鼠以评估免疫原性,并对免疫后的小鼠进行攻毒,监测小鼠存活率和体重变化,检测其肺组织病毒载量,并分析肺组织的病理变化。重组质粒KS001-HA在CHO细胞中稳定整合并分泌表达rHA蛋白,其相对分子质量约70 kD,经PNGaseF酶处理后,蛋白大小变为60kD。纯化后rHA蛋白纯度>95%。加强免疫后小鼠血清抗体效价显著增强,佐剂配伍免疫效果优于rHA单独免疫,其中HA203佐剂配伍组15、30、60μg剂量组免疫效应显著高于阳性对照组H1N1疫苗原液组。攻毒后HA203佐剂配伍组无小鼠死亡,小鼠体重平均下降率低于10%,肺组织肺泡结构清晰,仅见肺泡壁轻度增厚,伴随少量的炎性细胞浸润,仅检测到少量呈灶性分布的棕黄色颗粒。本研究成功构建了重组质粒KS001-HA,于CHO细胞中表达,并筛选出稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株。rHA蛋白以单体形式存在且糖基化丰富。rHA蛋白独自作用小鼠产生的免疫原性较低且不能保护小鼠抵抗H1N1型流感病毒的攻击,rHA蛋白联合佐剂免疫小鼠后具有较好的免疫原性,以HA203佐剂效果最好。HA蛋白配伍HA203佐剂可以诱导小鼠产生特异性体液免疫保护小鼠抵御H1N1型流感病毒的攻击,减少炎性细胞浸润,有效抑制病毒的复制。