冻干鼻喷流感减毒活疫苗病毒滴度FFA法的建立及验证

目的:建立并验证荧光灶法(FFA)检测冻干鼻喷流感减毒活疫苗病毒滴度的可行性。方法:采用FFA分别检测冻干鼻喷流感减毒活疫苗H1N1型、H3N2型、B型单一病毒收获液病毒滴度,并验证该方法的专属性、准确度、精密度、线性和耐用性。结果:该方法专属性良好;准确度回收率均为80%~115%,病毒滴度的试验内及试验间精密度RSD值均<10%;3个型别样品稀释倍数对数与病毒滴度呈线性关系,相关系数R2均>0.98;不同孵育温度的病毒滴度RSD值均<10%,耐用性良好。结论:建立的FFA具有良好的专属性、准确度、精密度、线性及耐用性,可用于冻干鼻喷流感减毒活疫苗病毒滴度检测。

流感减毒活疫苗效力试验检测新方法的建立

目的建立基于NP蛋白检测的流感减毒活疫苗病毒滴度检测方法,并进行初步应用。方法对病毒接种方式、流感病毒感染MDCK细胞培养时间、一抗和酶标二抗的稀释度、封闭液等ELISA反应条件进行筛选优化。采用建立的方法检测3批流感减毒活疫苗原液和1批疫苗成品,并与鸡胚培养法检测结果进行比较。结果选择直接接种法作为接种方式,病毒感染细胞后培养48 h进行NP蛋白表达的检测; ELISA检测条件一抗稀释度为1∶4 000,酶标二抗稀释度为1∶4 000,2%牛血清白蛋白封闭2 h,检测结果 P/N值最大。用建立的方法检测流感减毒活疫苗原液及疫苗成品效力,与鸡胚培养法检测结果差异无统计学意义(P>0.05),具有较好的一致性。结论建立了基于NP蛋白检测的流感减毒活疫苗效力试验方法,可用于生产过程中流感减毒活疫苗原液和成品的检定。

抗原特异性滤泡辅助性T细胞的活化与诱导在流感减毒活疫苗所诱导的人黏膜免疫抗体应答中发挥关键作用

当前,抗呼吸道感染的鼻内疫苗开发项目正日益吸引着越来越多的关注。对疫苗所诱导的保护力而言,抗体应答是决定性的,而人们普遍认为滤泡辅助T细胞(TFH)对于介导抗体应答非常重要。绝大多数支持TFH在免疫应答中作用的数据均来自于动物研究,而除血液中存在TFH样细胞外,来自人体的直接证据则十分有限。研究者考察了在人类鼻咽相关淋巴组织(NALT)中TFH细胞的活化与诱导,及其在流感减毒活疫苗(LAIV)所诱导的抗体应答中的作用。腺扁桃体组织的TFH细胞活化情况使用流式细胞仪分析,同时在LAIV刺激扁桃体单核细胞(MNC)后检测抗流感血凝素(anti-HA)抗体。通过使用流式细胞仪对被诱导的TFH细胞和CD154表达进行分析,研究者对由LAIV诱导的抗原特异性TFH细胞活化情况展开研究。LAIV诱导了与抗HA抗体产生有关的TFH细胞增殖,同时研究显示TFH细胞对于抗体应答至关重要。表达BCL6和CD21新诱导的TFH细胞以及随后抗HA抗体的测定表明,初始T细胞被LAIV诱导成为TFH细胞。

流感减毒活疫苗:预防流感的新选择

流感减毒活疫苗 (L AIV)给流感的预防和控制提供了新的可能性。经鼻内给予 LAIV提供了非注射接种途径。这些疫苗在儿童和健康成人中证明安全有效。一项在幼儿中进行的为期两年的安慰剂 -对照临床研究 (1996～ 1997和 1997～ 1998流感流行季节 )表明 ,L AIV与实验室证实的流感病例减少 92 %相关。疫苗接种也显著减少了中耳炎的发病和抗生素的使用。在 1997～1998流感流行季节对健康成人的安慰剂 -对照试验中 ,L AIV明显地减少发热性上呼吸道疾病和与疾病相关的误工、保健和抗生素的使用。 70 %的研究对象自己接种了疫苗。经济学分析表明 ,L AIV及其给健康成人接种的无盈亏费用是 39美元。在 1997～ 1998流感流行季节 ,L AIV中没有包括当时的主要流行株—— A/悉尼变异株 ,但疫苗还是对健康成人和儿童提供了明显的保护作用。目前正在高危人群中研究灭活疫苗和 LAIV的潜在效益。 L

国内外鼻喷流感减毒活疫苗给药装置喷雾特性的对比

目的对国内外鼻喷流感减毒活疫苗(live attenuated influenza vaccine,LAIV)给药装置喷雾特性进行对比。方法采用激光衍射法测定国内外两种鼻喷给药装置雾化颗粒粒径分布(DV10、DV50、DV90)、<10μm雾滴占比、Span跨度,Spray view仪器检测喷雾模式[最大直径(D_(max))、最短直径(D_(min))、椭圆率(ovality,D_(max)/D_(min))]和喷雾几何形态(喷雾角度及宽度),并进行比较分析。结果国内外两种鼻喷给药装置雾化颗粒的DV10、DV50、DV90粒径分布、<10μm雾滴占比及Span跨度差异均无统计学意义[莱文方差等同性检验F分别为0.622、0.135、3.067、0.212、0.058,P分别为0.434、0.714、0.085、0.647、0.810,且假定等方差显著性(双尾)值分别为0.439、0.228、0.281、0.539、0.910];喷雾模式的D_(max)、D_(min)、ovality差异均无统计学意义[莱文方差等同性检验F分别为2.102、2.666、0.514,P分别为0.158、0.114、0.479,且假定等方差显著性(双尾)值分别为0.651、0.407、0.160];喷雾角度及宽度的平均值比值分别为0.92和0.91,均在0.90~1.11范围内。结论国内外鼻喷给药装置均满足鼻喷LAIV的鼻喷给药要求,可用于鼻喷疫苗和药物的递送。

流感减毒活疫苗中 A 型流感病毒株生产用工作毒种遗传稳定性分析

目的：分析流感减毒活疫苗的生产用工作毒种A／17／California／2009／38（H1N1）、A／17／Perth／09／87（H3N2）的遗传稳定性。方法将流感减毒活疫苗生产用工作毒种接种鸡胚尿囊腔进行传代，扩增第2、3、5、10代毒株的全基因组进行测序分析，其中每个代次的6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS测序结果分别与冷适应供体毒株进行比对分析，血凝素（ HA）和神经氨酸酶（ NA）基因的测序结果分别与世界卫生组织（ WHO）推荐的适用于北半球的2011—2012年流行毒株进行比对分析，从而判断疫苗生产用工作种子毒株的基因遗传稳定性。结果扩增至10代次后，H1N1疫苗毒株基因总突变率为0．035％，H3N2疫苗毒株基因总突变率为0．022％，突变位点均未发生在冷适应性（ ca）、温度敏感性（ ts）和减毒性（ att）表型的决定位点。结论生产用工作毒种具有良好的基因遗传稳定性，扩增至第10代次的疫苗毒株同原始种子代次的同源性大于99％，工作种子批毒种符合2010年版《中华人民共和国药典》的要求。

流感减毒活疫苗诱导的粘膜反应IgA抗体检测方法的可行性分析

目的:对建立的检测流感病毒特异性IgA抗体检测方法进行验证,并且用于评价流感减毒活疫苗(LAIV)粘膜免疫反应。方法:使用来自英国生物制品所(NIBSC)的流感抗原国际参考品作为包被抗原,检测鼻咽拭子阳性样品,确定流感病毒型别特异性的IgA抗体滴度,考察该方法的特异性;通过对高低不同抗体滴度的阳性样本多次平行检测来评价该方法的重复性;在此基础上,对526份鼻咽拭子样本进行IgA抗体滴度检测。结果:只针对包被抗原阳性的样品检测到高滴度的IgA抗体,其他型别的抗体未检测到,方法特异性显著。鼻咽拭子IgA抗体检测方法的组间重复性、组内重复性、方法重复性良好。检测接种LAIV疫苗免疫前后的鼻咽拭子样本,疫苗组H1N1、H3N2以及B型IgA抗体几何平均滴度(GMT)接种前后的比值分别为1.15、1.45和1.18,均高于安慰剂组;疫苗接种组IgA抗体滴度高于免疫前2倍的比率,也高于安慰剂对照组(P<0.05)。鼻咽拭子IgA抗体检测结果与血清样本HI抗体结果缺乏相关性(P<0.001)。结论:建立的流感病毒特异性IgA抗体的检测方法能够满足LAIV粘膜免疫评价的需要。

流感减毒活疫苗诱发黏膜IgA抗体间接ELISA检测方法的优化及其实验室内控品的制备

目的优化流感减毒活疫苗诱发黏膜IgA抗体的ELISA检测方法,并制备IgA抗体实验室内控品。方法采用ELISA检测法对流感病毒抗原(全病毒及其相应HA抗原)及包被浓度(0. 5、1、2、4μg/mL)、封闭液(1%BSA、10%FBS、5%脱脂奶粉)及封闭时间(1、1. 5、2 h)、样本稀释液(含1%BSA的PBST、含2%脱脂奶粉的PBST、样本保存液)及样本作用时间(45、60、75 min)、酶标抗体稀释度(1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000)进行优化。采用优化的方法制备针对H1N1、H3N2和B型3个型别流感病毒的IgA抗体检测用实验内控品,并用该方法对接种三价流感减毒活疫苗的20名志愿者的鼻咽拭子样本进行检测。结果最适间接ELISA法检测条件为:以全病毒作为包被抗原,包被浓度为1μg/mL;以含1%牛血清白蛋白为封闭液封闭2 h;样本稀释液为2%脱脂奶粉的PBST,作用时间为60 min;酶标抗体稀释度为1∶1 000。采用优化方法制备的H1N1、H3N2、B型IgA抗体阳性实验室内控品几何平均滴度分别为23、45、35,可接受范围分别为16~32、32~64、32~64。接种疫苗后20名志愿者中3种型别IgA抗体滴度较接种前均显著增高(P <0. 001),40%~50%志愿者接种后IgA抗体滴度比接种前至少升高2倍。结论成功优化了流感减毒活疫苗诱发黏膜IgA抗体的ELISA检测方法,制备的IgA抗体的实验室内控品可用于流感减毒活疫苗接种后鼻咽拭子抗体的检测。

流感减毒活疫苗预防儿童季节性流感保护效果的Meta分析

目的评价流感减毒活疫苗(LAIV)预防2~17岁儿童季节性流感的保护效果。方法通过Web of Science、PubMed和ScienceDirect数据库,检索2003年1月至2018年11月期间发表的、研究设计为病例对照的、关于研究LAIV预防儿童季节性流感保护效果的相关文献,采用Stata 13.1软件对纳入文献进行Meta分析。结果共纳入文献14篇,均为检测阴性设计(Test-negative design,TND)研究。结果显示LAIV预防儿童季节性流感的保护效果为49%(95%CI:40%~57%)。亚组分析发现:LAIV预防A(H1N1)pdm09型、A(H3N2)型和B型流感的保护效果分别为35%(95%CI:5%~56%)、35%(95%CI:21%~46%)和71%(95%CI:55%~82%);三价LAIV和四价LAIV在儿童中的保护效果分别为56%(95%CI:48%~63%)和44%(95%CI:27%~57%);LAIV在欧洲地区和北美洲地区的保护效果分别为65%(95%CI:47%~77%)和46%(95%CI:36%~55%)。结论LAIV对2~17岁儿童季节性流感具有一定的预防作用。

减毒流感疫苗研究进展

目前流感疫苗研制已取得明显进步,但流感病毒仍然对全球公共卫生构成巨大威胁。传统的灭活流感疫苗(IIV)或减毒活流感疫苗(LAIV)接种是控制季节性流感的主要策略,但它不能对具有大流行潜力的新型流感病毒提供保护。且季节性流感病毒持续性抗原漂移,导致抗原不匹配,严重影响疫苗效力。因此,快速优化季节性流感疫苗生产和开发新的大流行流感疫苗,仍然是预防流感的重要任务。最近有报道质疑目前LAIV的有效性,因为它主要是针对疫苗中的甲型流感病毒(IAV),保护范围有限。因此,需要研究人员开发新型LAIV,以克服LAIV的局限性。基于质粒的反向遗传学的发现和应用是快速产生重配减毒流感病毒的关键技术,可用于开发新型、有效的LAIV。本文将对新型LAI的安全性、免疫原性和保护性进行阐述,并汇总有关LAIV研究方面的新进展,以启发流感疫苗研究新思路。

鸡蛋过敏的儿童接种流感减毒活疫苗--在获得新的令人信服的安全性新证据后，应改变政策并允许接种疫苗

流感疫苗是由鸡蛋衍生而来的，而且一直禁用于鸡蛋过敏人群。它含有低残留水平的鸡蛋卵清蛋白，对于鸡蛋过敏的人群，理论上有发生过敏反应的风险。然而，没有研究表明残留的卵清蛋白含量能导致不良事件（包括过敏反应相关的发病率和病死率），以及对鸡蛋过敏的接种者或鸡蛋过敏人群接种疫苗的风险高于一般人群。

靶向NS基因的流感减毒活疫苗研究进展

目前,预防流感最有效的方式是接种疫苗。传统的流感灭活疫苗虽然具有较好的安全性和有效性,但也存在一些缺点。相比之下,流感减毒活疫苗通过鼻腔接种可以模拟自然感染过程,在应对流感大流行时具有能快速制备等优势。NS基因是流感病毒基因组的第8个节段,编码NS1蛋白和NEP 2种蛋白,在抑制宿主细胞干扰素产生以及调控流感病毒复制中核糖核蛋白复合体出核过程等方面起到至关重要的作用,是流感减毒活疫苗制备过程中常用的靶点。本文将对靶向NS基因的流感减毒活疫苗相关研究进展进行综述。

流感减毒活疫苗

流感是由于机体感染流感病毒而引发的急性呼吸道感染性疾病.流感病毒很容易通过飞沫在空气中短距离传播,也能通过接触感染者和被污染物品后经由口鼻或眼睛黏膜感染,因而常常导致群体性流感暴发.全球每年在成年人和儿童中的流感发病率分别为5％-10％和20％-30％,造成300万-500万例严重疾病和25万-50万例死亡,高危人群主要为婴幼儿、老年人或慢性疾病患者.WHO认为接种流感疫苗是预防和控制流感的最佳办法.

鼻黏膜给药装置中5种抗氧剂提取方法的建立及其在鼻喷流感减毒活疫苗中的迁移

目的通过5种抗氧剂提取和迁移试验,分析鼻喷流感减毒活疫苗与鼻黏膜给药装置之间的相容性,以保证药品的安全性和有效性。方法采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)考察5种抗氧剂(3114、1010、330、1076、168)在鼻黏膜给药装置胶塞和鼻喷装置中的含量,以及在鼻喷流感减毒活疫苗中的迁移量。依据添加剂的人每日允许摄入量(permitted daily exposure,PDE),评估鼻喷流感减毒活疫苗中5种抗氧剂是否存在安全性风险。并对5种抗氧剂的提取方法进行专属性、检测限及定量限、线性及范围、重复性和准确性验证。结果胶塞中检出抗氧剂3114和1076,未检出其他3种抗氧剂;鼻喷装置中检出抗氧剂3114、1010和1076,未检出其他2种抗氧剂,符合《欧洲药典》对5种抗氧剂的限度要求。3批鼻喷流感减毒活疫苗在加速[(25±2)℃放置0、5、10 d]和长期稳定性(2~8℃放置3、6个月)试验条件下,均未检出5种抗氧剂。每日摄入量低于PDE值,方法灵敏度满足分析评价阈值(analysis and evaluation threshold,AET)的测定要求,对患者的安全性风险较小。5种抗氧剂的提取方法专属性、线性、重复性良好,准确性较高。结论鼻喷流感减毒活疫苗与鼻黏膜给药装置相容性良好。

流感减毒活疫苗的保护机制

最近，发表于Vaccine的一项研究清楚阐述了流感减毒活疫苗（LAIV）FluMist的作用机制。

流感减毒活疫苗FluMist与灭活疫苗同等有效

三价流感减毒活疫苗FluMist（阿斯利康制药公司）预防病毒感染的效力与较常用的三价流感灭活疫苗相同。1项研究对〉1000名3～15岁加拿大儿童进行了3季监测，

在胆囊纤维化病人及其家庭成员中使用流感减毒活疫苗和灭活疫苗的结果比较：三年的研究结果

在胆囊纤维化病人及其家庭成员中使用流感减毒活疫苗和灭活疫苗的结果比较：三年的研究结果［英］／［ＧｒｕｂｅｒＷＣ．．．ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ．－１９９４，１６９．－２４１～２４７］作者在４１例胆囊纤维化（ＣＦ）病人和８９例家庭成员中，进行为期３年的双盲随...