1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

【目的】了解广东地区猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)的流行情况并探究其分子生物学特征。【方法】采集广东某猪场疑似猪流感病毒感染猪的鼻拭子和肺脏组织样品进行病毒分离鉴定、遗传进化和关键氨基酸位点分析。【结果】样品经实时荧光定量RT-PCR检测为猪流感病毒核酸阳性;在红细胞凝集试验中,该病毒对鸡红细胞有凝集作用,血凝效价为1∶128;8个基因片段序列结果经BLAST比对和进化树分析显示,HA、NA基因属于欧亚类禽猪流感病毒(H1N1)分支,PA、PB 1、PB 2、NP和M基因属pdm/09分支,NS基因属于北美三源重组分支,因此,本试验分离株属于G4基因型欧亚类禽猪流感病毒,将其命名为A/swine/Guangdong/CJM2/2022(H1N1)。关键氨基酸位点分析显示,分离株HA蛋白裂解位点序列为PSIQSR/GL,具有典型低致病性流感病毒的分子特征。HA基因在受体结合位点处的190、225、226位氨基酸分别为D、E、Q,表明其既具有结合人型唾液酸受体的潜能又具有结合禽型唾液酸受体的潜能。NA基因关键氨基酸残基均未发生突变,提示分离株对奥司他韦和扎那米韦等神经氨酸酶抑制剂的敏感性较高,而M基因3处氨基酸位点突变为V27A、A30T、D44A,提示对金刚烷胺类药物耐药性增加。【结论】本研究分离鉴定的毒株为G4基因型欧亚类禽猪流感病毒,关键氨基酸位点分析提示该毒株具有适应在哺乳动物中复制和毒力增强的特征。本研究结果为广东地区猪流感的防控提供了参考数据。

一株c基因型牛副流感病毒3型病毒的分离鉴定

从黑龙江省某牛场当中患有呼吸系统疾病的病牛鼻拭子中分离到一株病毒,该病毒在MDBK细胞上能够产生典型的病变。经免疫荧光鉴定表明成功分离到一株牛副流感病毒3型,命名为HLJ1。将病毒的M基因与GenBank中已发表BPIV3毒株的M基因进行同源性比较及系统进化分析,结果表明HLJ1与BPIV3c型参考毒株NX49的同源性最高为99.7%,因此HLJ1分离株属于c基因型BPIV3。我们的结果将为牛副流感病毒3型检测试剂盒及疫苗的研发工作奠定基础。

山东省H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定及其致病性评价

本试验从山东省某集团养猪场采集疑似猪流感(swine influenza, SI)病猪的鼻拭子样品25份,将样品处理后接种10日龄SPF鸡胚,培养72 h后收集鸡胚尿囊液进行血凝试验和RT-PCR分型鉴定,并对分离到的病毒进行基因测序以及对仔猪致病性研究。结果显示,成功从鼻拭子样品中分离到一株猪流感病毒(swine influenza virus, SIV),经RT-PCR分型鉴定为H1N1亚型SIV,命名为A/swine/Shandong/12/2023(H1N1),简称SIV H1N1 SD12株。序列比对分析显示,SIV H1N1SD12株HA基因与GenBank中的A/swine/Shandong/LY059/2019(H1N1)的同源性最高为97.82%,HA蛋白的裂解位点为PSIQSRGL,具备低致病性SIV的分子特征,蛋白具有6个潜在糖基化位点;NA基因与A/swine/Beijing/0301/2018(H1N1)的同源性最高为97.80%,NA蛋白具有7个潜在糖基化位点,与NA抑制剂类药物敏感性相关的氨基酸位点未发生改变。致病性实验结果显示,感染组的仔猪出现猪流感典型症状(发热、流涕、喷嚏等),鼻拭子样品均检测到SIV排毒,剖检后仔猪肺脏出现实变,表明SIV H1N1 SD12株对仔猪具致病力。综上,本研究成功从山东省分离到1株H1N1亚型SIV,遗传进化分析显示SIV H1N1 SD12株属于欧亚类禽分支,对仔猪具有致病性,这为H1N1亚型SIV流行情况监测和猪流感防控提供参考。

H5N2亚型禽流感病毒分离鉴定与鸡致病性研究

禽流感是由A型禽流感病毒引起的,多种家禽及野生禽类发病的一种高度接触性传染病,又称为“真性鸡瘟”或“亚洲鸡瘟”,其表现形式是多种多样的,有的只能通过检出抗体和分离病毒才能确诊感染疾病。在本研究中,从患有禽流感病史的鸡中,分离出了一株H5N2亚型禽流感病毒,导致鸡胚半数感染量以及致死量居高不下,因此研究H5N2亚型禽流感病毒的分离和鉴定,以及其对鸡的致病性,这对于我国禽类养殖中能有效防控禽流感具有重大的意义。

中国猪源H5N1和H9N2亚型流感病毒的分离鉴定

猪是禽流感病毒"禽＿猪＿人"传播链中重要的中间宿主,了解猪流感的疫情动态将为动物流感及人流感的疾病预测及防制提供重要依据。1999～2001年间进行的血清学和病毒学监测发现我国猪群存在大范围的H1和H3亚型猪流感感染(李海燕等,2002)。2002～2003年,我们进一步对来自全国14个省市的1936份血清进行了H9亚型猪流感的检测,同时在广东、福建等省进行了H5亚型猪流感的检测。2002年辽宁、广东、山东及重庆猪血清中出现H9亚型流感抗体,阳性率分别为7.3%、6.8%、5.1%和1.6%。2003年采集的猪血清H9亚型流感抗体均为阴性,同时发现广东、福建两省2003年出现H5亚型流感阳性猪群,阳性率分别为4.7%和8.2%。从2001～2003年收集和送检的样品中分离鉴定了6株H9N2亚型和2株H5N1亚型猪流感病毒,部分序列分析发现H9和H5亚型猪流感病毒均与我国分离的禽流感病毒高度同源。本研究进一步确证了我国猪群中存在H9N2亚型流感病毒,并且首次发现我国猪群已出现H5N1亚型流感病毒,为人类流感及动物流感的防制敲响了警钟。对这两个亚型流感病毒所具有的公共卫生和兽医公共卫生危害性应予以高度重视。

葡萄扇叶病毒的分离、鉴定、提纯及血清学研究

从表现扇叶和叶肉褪绿斑驳症状的先锋、葡萄园皇后和北醇的杂交单株中分离到3个与国外扇叶病毒(GFV)DIL分离物相似的GFY-DIL类似物。它们在昆诺藜、苋色藜、千日红和菜豆上表现症状。提纯病毒颗粒为直径约30nm的球形颗粒。在免疫双扩散试验中均与扇叶病毒抗血清形成完全融合的沉淀线。免疫电镜下病毒颗粒受扇叶病毒抗血清的修饰。利用三种间接异种动物抗体双夹心法和金黄色葡萄球菌蛋白A夹心酶联免疫吸附试验(PAS—ELISA)从感病的葡萄植株或组培苗叶片中检测了GF。间接异种动物抗休双夹心法能检测提纯GFV的最低浓度为1.6ng—8ng/ml。春季的芽和幼叶为合适的检测器官。

通过病毒分离鉴定和基因检测首次发现虎流感

应用 F8 1 猫肾传代细胞 ,从高热、拒食和间有神经症状的死亡虎病料中分离获得 1株病毒 ,经形态学、理化学、生物学和血清学系统鉴定 ,证明为流感病毒。采用流感病毒核蛋白基因引物 ,对分离病毒及该虎病料进行 RT- PCR扩增和序列分析 ,结果从分离病毒和虎病料中均扩增出与理论值大小相符的 4 6 4 bp基因片段 ;其序列与 A、B、C 3型流感病毒相比较 ,同源性分别为 84 .9%、35 .0 %、2 4 .8%。由此说明 ,所分离病毒为 A型流感病毒 ,命名为 A/虎 /哈尔滨 (中国 ) / 0 1/ 2 0 0 2。用此分离病毒静脉接种于 3月龄家猫 3只 ,均出现与病虎相似的临床症状 ,其中 1只耐过 ,2只死亡。死亡猫剖检变化与死虎相似 ,主要呈现肺炎病变 ,并可从病料中回收到所接种病毒。以此分离病毒为 HA抗原 ,进行虎与猫血清的 HI抗体检测 ,结果康复虎血清比其病初血清、康复猫血清比其接种前血清 HI抗体均增高 4倍以上 ,表明该病毒具有致病性 ,是引起该虎与试验猫发病甚至死亡的病原。

部分省市猪群猪流感的血清学调查及猪流感病毒的分离与鉴定

对黑龙江、吉林、辽宁、安徽、山东、内蒙、河南、河北、江苏、安徽、浙江、湖北、福建、广东、海南、上海等省、市猪群进行了猪流感的血清学和病原学调查研究。从 130 6份猪鼻棉拭子样品和死亡猪肺、气管样品中分离到 39株H3N2亚型猪流感病毒 ,12株 H1亚型猪流感病毒及其它亚型猪流感病毒 ,病毒粒子在透射电镜下呈现典型的正粘病毒特征 ,有囊膜和纤突 ,多为椭圆形、圆形、或杆形 ,直径约 80～ 12 0 nm。对 1997- 2 0 0 1年 3895份猪血清的血清学调查结果表明 ,近年中国多个地区猪群存在抗SWTN77(H1)、SWCO77(H3)、DKAT6 9(H1)、TKUK6 3(H3)流感病毒抗体 ;1998年来自河北的猪血清中抗 SWTN77阳性率高达 33.3% ;1999年来自内蒙的猪血清中抗 TKUK6 3和SWCO77阳性率分别为 13.3%和 2 6 .7% ;2 0 0 0- 2 0 0 1年调查的所有省市的猪群中均存在抗SWCO77抗体 ,阳性率从 3.2 %～ 10 0 %。说明近年我国猪群中

湖北省禽流感的诊断及病毒株的分离与初步鉴定

通过采用琼脂扩散法 (AGP)对湖北省 8个发病鸡场进行禽流感抗体的检测 ,证实了禽流感的存在。从某鸡场 5只濒死鸡气管刮屑及内脏材料中分离到了一株病毒。应用HI试验和电镜负染技术确证该分离物为A型流感病毒 ,其血凝价可达 1∶2 5 6 0。该病毒粒子有囊膜 ,呈球形或椭圆形 ,大小为 80～ 12 0nm ,其血清型为H9N2

猪流感病毒的分离鉴定

用SPF鸡胚从我国东北地区猪群中分离出 3株H3 N2 猪流感病毒 (SIV) ,分别命名为A/Swine/Heilongjiang/ 1/ 2 0 0 0、A/Swine/Heilogjiang/ 2 / 2 0 0 0和A/Swine/Heilogjiang/ 3/ 2 0 0 0。SIV分离株第 8代病毒液对 0 .5 %豚鼠红血球的血凝价分别为2 0 48log2 、2 0 48log2 、40 96log2 ;将其制成琼扩 (AGP)抗原与禽流感标准阳性血清均出现清晰白色沉淀线 ;与流感病毒H3 亚型标准阳性血清的血凝抑制 (HI)价分别为 8log2 、7log2 、7log2 ,但不能被鸡新城疫阳性血清抑制。这 3株SIV都为热不稳定型 ;均能凝集驴、绵羊、鸡、兔、豚鼠、小鼠、大鼠、人O型血红血球 ,对马、牛红血球均不凝集 ;感染一个病毒最小致死量的鸡胚平均死亡时间分别为 86 .4、12 9.6和 91.2小时 ;每 0 .2ml病毒液鸡胚半数感染量分别为 4.75lg、4.5lg、和 6 .0lg ;对鸡的静脉内接种致病指数和脑内接种致病指数各为 0 .5 6、0 .32、0 .5 2和 0 .77、0 .38、0 .5 2 ;对小鼠的半数致死量分别为 2 .6lg、2 .0lg和 2 .5lg ;试验感染小鼠、豚鼠和猪均可发病并出现死亡。存活动物接种后第 6天和第 14天的血清 ,其HI价均在 8log2 以上 ,而AGP均为阴性。

猪流感病毒广东株的分离鉴定及其特性

对广东省 2 5个猪场有呼吸道症状的 30～ 6 0日龄仔猪 ,用棉拭子采样 ,接种鸡胚分离病毒。经鉴定 ,7株为H1N1亚型毒株。对其中 3株分离株的形态学、部分理化特性和生物学特性的研究结果表明 ,病毒粒子在透射电镜下为杆状、丝状、椭圆形及圆形 ,大小为 80～ 12 0nm ;血凝素(HA)均为热不稳定型 ;均不耐热且对乙醚、氯仿敏感 ;均能凝集公鸡、豚鼠、兔、大白鼠、山羊等动物红细胞 ,对小白鼠红细胞的凝集性有所不同 ,均不凝集牛和猪红细胞 ;经绒毛尿囊腔接种 9日龄鸡胚 ,不能导致鸡胚死亡 ,EID50 分别为 10 — 6 .17/ 0 .2mL、10 - 5.83/ 0 .2mL、10 - 4.4 3/ 0 .2mL ;经鼻腔途径感染小白鼠 ,均未导致小鼠出现症状和死亡 ,接种后第 14d在部分存活的小鼠血清中可检出病毒抗体。

鸭源禽流感病毒的分离和鉴定

从南京鸡鸭加工厂、孝陵卫鸭场及迈皋桥鸭场共采制１１３个泄殖腔拭子，用鸡胚尿囊腔接种传代法分离到４株禽流感病毒（ＡＩＶ），每个样品均有ＮＤＶ混感。纯化后的分离株利用电镜负染技术观察到典型的ＡＩＶ粒子。琼扩试验证明４个分离株均为Ａ型流感病毒。经血凝素亚型分析，４株均属于Ｈ９亚型。致病性试验结果表明，４株鸭源禽流感病毒对鸡均表现为较低的致病力。本研究提示环境（特别是水体）保毒是ＡＩＶ得以长期存在和传播的重要因素和媒介。

禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)全基因克隆及序列分析

本研究用无特定病原体 (SPF)鸡胚增殖禽流感病毒鹅体分离株A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) (GD1/96 ) ,提取病毒基因组总RNA ,运用反转录_聚合酶链反应 (RT_PCR)技术分别扩增该病毒分离株的 8个基因片段的cDNA ,分别克隆后进行序列测定。序列分析结果表明 ,所扩增到的 8个片段均包含相应的病毒基因的完整开放阅读框架。GD1/96株与 1997年香港禽流感事件中的 4株香港流感病毒分离株 (分别来自人、鸡、鸭和鹅 )的HA基因的高度同源性说明它们可能起源于同一种系 ,但NS基因的差异说明它们分属于不同的基因群系。GD1/96株与香港流感病毒分离株的核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性较低 ( 6 3.9%～ 98.1%) ,而香港流感病毒分离株之间的核苷酸和氨基酸序列的同源性很高 ( 96 .5 %～ 10 0 %) ,且香港各流感病毒分离株的NA均缺失 5 7个核苷酸 ( 19个氨基酸 )残基。因此 ,内地H5N1分离株GD1/96与

牛副流感病毒3型的分离鉴定及感染牛抗体消长规律的研究

目的针对黑龙江省近几年夏季奶牛经常发生以高热、气喘和流涎等症状为主的疾病,给畜牧业造成严重经济损失,本文旨在研究其病原因素及感染牛中和抗体的变化趋势。方法本研究采集爆发高热病的牛群中患病牛乳汁和鼻液进行病毒分离,经CPE和扫描电镜观察、理化特性试验、血凝试验、病毒中和试验以及RT-PCR方法鉴定分离的病毒,最后应用病毒中和试验跟踪监测5头典型发病牛中和抗体13个月。结果从病料中分离到一种RNA病毒,能够产生典型的细胞融合样CPE,有囊膜和栅栏样纤突,但是没有血凝性,能够与参考毒株牛副流感病毒3型抗血清发生病毒中和反应,HN基因的序列分析发现与牛副流感病毒3型HN基因同源性最高达99.6%。发病牛中和抗体跟踪监测结果显示康复期抗体效价是急性期的4倍以上,同时可见感染牛的中和抗体效价在6-8个月内能够维持在1:25～1:27,然后开始下降,最后维持在1:22～1:23之间。结论综上所述确定分离毒株是牛副流感病毒3型,进一步证实该病毒是引起本牛群高热病的病因之一,而且感染后中和抗体效价至少在6个月以内能够维持在较高的水平。

H3N2亚型猪流感病毒中国分离株的克隆纯化及生物学特性

以有限稀释克隆法对 2 9株 H3N2亚型猪流感病毒 ( SIV)不同地区分离株进行纯化 ,并对其生物学特性进行了研究。结果 ,8株对鸡呈现中等致病力 ,2 1株对鸡呈现低致病力。不同地区 SIV分离株 (第 5代 )的 EID50 差异较大 ,以安徽分离株最高 ,为 10 - 1 0 .77/ 0 .2 m L,其他毒株在 10 - 5.5～ 10 - 1 0 .56 / 0 .2 m L 之间。黑龙江省分离株和浙江省分离株的L D50 高达 10 - 2 .84 / 0 .1m L ,其他分离株在 10 - 1 .1 7～ 10 - 2 .56 / 0 .1m L之间。经鸡胚分离传代后 ,SIV分离株均能凝集0 .7%人“O”型血、绵羊、兔、豚鼠、小鼠、大鼠及鸡的红细胞 ,其红细胞凝集谱的差异主要表现在对马、牛、驴、猪红细胞的凝集特性上。大部分 SIV分离株为热不稳定型 ,部分毒株表现为中等热稳定型和热稳定型。从其抗原特性看 ,大部分 SIV分离株表现为亲和相 ,对 AIV参考毒株 DKUK6 3和 SIV参考毒株 SWTN77表现出较高的 HI滴度 ;部分分离株经鸡胚传代后 ,出现了相别的变异。

人副流感病毒的快速分离培养与鉴定

目的副流感病毒是婴幼儿下呼吸道感染的重要病原体，为快速准确诊断副流感病毒感染，文中探讨一种从鼻拭子快速分离培养及鉴定副流感病毒的方法。方法采集0—5岁诊断为急性呼吸道感染的患儿鼻拭子标本，以3000r／min离心1h接种至96孔板预制LLC—MK2细胞以及按照传统培养法进行接种，最后补充含4ug/mLTPCK胰酶的病毒维持培养基。每天观察细胞病变，培养第2、5、8天分别作血吸附、血凝试验，试验阳性时作免疫荧光鉴定。结果从83份鼻拭子标本中分离鉴定6株副流感病毒，阳性率7．2％。离心培养法与传统培养法在标本培养2d后其分离率分别为7．2％和0，差异有统计学意义（P〈0．05）。阳性标本感染的细胞镜下可见局部变长、融合、破碎的细胞病变，血凝试验4℃凝集而室温不凝集，血吸附试验4℃阳性而室温阴性，免疫荧光可见细胞内特异性苹果绿荧光。结论快速分离培养方法可最快在2d内从鼻拭子标本中获得有毒力和生物活性的副流感病毒并进行鉴定。

H1N1亚型猪流感病毒中国分离株血凝素基因分子演化的研究

对 2 0 0 1年中国华南及东北地区的 15株H1N1亚型猪流感病毒 (SIV)分离株的血凝素 (HA)基因进行了序列测定和分析 ,并绘制了进化树。研究结果表明 ,15株H1N1SIV和HA基因核苷酸全长为 1778bp ,共编码 5 6 6个氨基酸 ;而且 ,15株H1N1亚型SIV的HAI蛋白在 10、11、2 3、87、2 87位都存在高度保守的糖基化位点 ,此外 ,在 2 76位多了一个“_NTT_”糖基化位点 ,与参考毒株SW /IW / 93/ 0 1一致 ,这可能是近期H1N1亚型SIV的一个分子特征。本研究进一步发现 ,15株H1N1亚型SIV的HA基因切割位点氨基酸组成为IPSIQSR↓G ,具有非高致病力毒株分子特征 ;而其受体结合位点在HA蛋白上第 2 2 6位是Q ,第 2 2 8位是G ,可能具有感染禽的潜力。经同源性比较 ,15株H1N1亚型SIV的HA基因与古典型H1N1猪谱系中的WIS/ 4 75 4 / 94的同源性相对最高 ,核苷酸和氨基酸序列同源性分别达到 95 7%～ 96 1%和96 5 %～ 97 2 %。由同源性比较结果和进化树分析可见 。

猪流感病毒河南株的分离鉴定和生物学特性

从河南省有呼吸道症状的5个不同猪场采集棉拭子和肺组织样品。样品处理后,通过尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚。获得3株病毒,经血凝和血凝抑制试验鉴定,为H3N2亚型流感病毒,并对其部分生物学特性进行了研究。结果表明,其半数鸡胚感染量(EID50)分别是0-9.56/0.2mL,10-8.56/0.2mL和10-8.44/0.2mL,对小白鼠的半数致死量(LD50)分别是10-1.56/0.1mL,10-1.45/0.1mL和10-1.50/0.1mL;它们的血凝素对热不稳定,能凝集1%马、牛、驴、猪、绵羊、鸡、兔、豚鼠、小白鼠及人O型血的红细胞。这为了解河南猪群中流行的流感病毒奠定了基础。

福建省甲型H1N1流感病毒分离及首例分离株全基因组序列分析

目的分离甲型H1N1流感病毒,分析福建省首例病毒分离株全基因组序列和遗传特征,为研究病毒进化、致病性、流行规律提供科学依据。方法采用MDCK细胞和Real-time PCR法进行病毒分离、鉴定;提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增其8个基因片段,测定核苷酸序列,利用生物信息软件拼接全基因组序列;分析重要基因位点,利用GENBANK中相关序列对首例病毒分离株A/Fujian/01/2009(H1N1)进行基因进化树分析。结果从82例甲型H1N1流感确诊病例标本中分离出50株甲型H1N1流感病毒,第一代分离阳性率60.98%。在福建省首次获得甲型H1N1流感病毒株及全基因组序列。基因组序列分析证明:该毒株与2009年大流行株高度同源,其基因组存在四源重组现象;氨基酸位点分析其对达菲药物敏感,对金刚烷胺类药物耐药;相对于猪流感代表株A/Swine/Iowa/15/1930(H1N1)存在6个HA抗原决定簇位点变异。结论MD-CK细胞对甲型H1N1流感病毒具有较高敏感性;福建省首例甲型H1N1流感病例分离病毒株与北美流行株高度同源;相对于以往古典型猪流感代表株出现了HA蛋白抗原性漂移;为今后进一步开展甲型H1N1流感病毒分子生物学研究奠定基础。

鸭源禽流感病毒的分离鉴定及特性研究

从湖北某鸭场采集泄殖腔棉拭子 2 0份 ,通过传统的禽流感病毒分离方法即鸡胚尿囊腔接种法分离到 1株鸭源禽流感病毒 (AIV)。血清学试验表明 ,该病毒分离株为A型流感病毒 ,经血凝素亚型鉴定为H9型 ,与禽流感病毒H9亚型标准阳性血清的血凝抑制 (HI)价为 8log2 ,电镜负染拍照后 ,可清楚观察到典型的流感病毒粒子形态 ;致病性试验表明 ,该流感病毒对鸡表现为较低的致病力。研究表明 ,水禽 ,特别是鸭 ,正日益成为禽流感的高度易感动物 。