B型流感病毒B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台的搭建及BALB/c小鼠感染模型的建立

目的利用基因工程技术全基因合成B型流感病毒B/Yamagata/16/88的8个基因节段,并利用反向遗传技术从体外拯救B型流感病毒B/Yamagata/16/88,同时建立BALB/c小鼠感染模型,为下一步研究B型流感病毒致病机制、传播机制以及开发新型疫苗奠定基础。方法通过基因合成和反向遗传技术体外拯救B型流感病毒B/Yamagata/16/88。全基因组测序验证拯救病毒基因组序列与Genbank序列的一致性。将拯救病毒以105EID50的攻毒剂量人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、生存率、肺脏病毒复制等方面进行致病性分析,建立小鼠感染模型。结果成功从体外拯救出B型流感病毒B/Yamagata/16/88,命名为B-S9。全基因组测序结果表明,B-S9基因组序列与Genbank公布序列一致。B-S9能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠呈现低致病性;攻毒后第3天,B-S9感染小鼠体重出现下降,攻毒后第8天,小鼠体重开始回升;攻毒后第3天和第6天,B-S9感染小鼠的肺脏内均能检测到病毒复制,且攻毒后第3天的小鼠肺脏病毒滴度比攻毒后第6天的小鼠肺脏滴度高132倍。结论成功搭建B型流感病毒B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台,并建立BALB/c小鼠感染模型。目前国内外对B型流感病毒的研究比较少,该反向遗传操作平台的建立为B型流感病毒致病机制和传播机制的研究奠定了基础,同时也为包括B型流感病毒减毒活疫苗在内的新型疫苗的研制开辟了新途径。

B型流感病毒B/Guangzhou/01/2007株HA基因重组3型腺病毒的构建

目的:构建包含有B型流感病毒B/Guangzhou/01/2007株血凝素(HA)基因的重组3型腺病毒。方法:用PCR方法扩增得到HA基因,酶切后克隆至3型腺病毒穿梭质粒pSK-CMV,构建重组穿梭质粒pSK-CMV-HA,然后在大肠杆菌BJ5183内进行经NotI和EcoRV线性化的pSK-CMV-HA和经RsrⅡ线性化的骨架质粒pBRAdV3△E3的同源重组,AsiSI酶切线性化重组腺病毒质粒pBRAdV3△E3-HA后脂质体法转染HEp-2细胞,进行病毒包装和增殖后得到重组腺病毒rAdV3△E3-HA,并且通过病变观察、扫描电镜、RT-PCR、免疫细胞化学方法对基因组的包装和HA基因的表达进行检测。结果:将HA基因克隆入pSK-CMV获得重组穿梭质粒pSK-CMV-HA,线性化的pSK-CMV-HA与pBRAdV3△E3同源重组后获得pBRAdV3△E3-HA,线性化的pBRAdV3△E3-HA转染HEp-2细胞观察到细胞病变和HA基因的表达。结论:成功构建了带有HA基因的重组腺病毒rAdV3△E3-HA,为B型流感病毒-3型腺病毒二联活苗的研究提供了依据。

分泌抗B型流感病毒抗体杂交瘤细胞的制备及鉴定

目的制备抗B型流感病毒的单克隆抗体,用以建立特异、灵敏、简便的B型流感金标试纸检测方法。方法将B型流感病毒为完全抗原免疫BALB/c小鼠,得到的脾细胞与SP2/0细胞融合,获得稳定分泌抗流感B单抗的杂交瘤细胞株,对抗体进行鉴定。结果用杂交瘤技术,得到了3株可稳定分泌抗流感B单抗的杂交瘤细胞株,能分泌高滴度的针对B型流感病毒的特异单抗。结论所获抗B型流感病毒杂交瘤细胞株单克隆抗体,为金标法快速诊断B型流感感染奠定了基础。

清瘟解毒方治疗流感B病毒上呼吸道感染的观察护理

目的:探讨清瘟解毒方治疗流感B病毒上呼吸道感染的效果。方法:将 60例流感B病毒感染的患者随机分为观察组 30例和对照组 30例;观察组服用清瘟解毒方,每日 1剂,分 2次服,对照组服用病毒唑, 3次 /d,比较两组患者服药后体温及症状的变化。结果:观察组在体温恢复效果上显著优于对照组 (P<0.005),治愈率明显高于对照组。结论:清瘟解毒方治疗流感B病毒上呼吸道感染效果显著,副作用少。

流感病毒B监测与儿童单纯B型流感病毒肺炎临床特征分析

目的探讨流感病毒B的流行特征和儿童单纯B型流感病毒(influenza virus B,IVB)肺炎的临床特征。方法分析苏州大学附属儿童医院2008年冬季至2011年冬季因呼吸道感染住院治疗并进行病原学检查的患儿临床资料。结果 (1)2008、2009、2010年冬季流感病毒(A+B)检出率分别为0.89%、5.49%和6.24%,2011年冬季患儿流感病毒(A+B)检出率为8.72%,显著高于前3年。2008、2009、2010、2011年冬季IVB检出率分别为0%、0%、0.21%和5.36%,2011年冬季IVB检出率显著高于前3年。(2)2011年检出IVB肺炎患儿94例,其中单纯IVB肺炎27例。(3)单纯IVB肺炎患儿发病年龄以6个月以上为主;临床表现以发热(85%)、流涕(89%)、咳嗽(100%)为主,部分伴喘息(26%),少见呼吸困难(7%);少数白细胞异常(19%),部分CRP增高(30%),前白蛋白大多降低(70%),未见明显脏器功能损害;影像学表现无特异性;大部分患儿多个体液细胞免疫指标异常;平均住院时间1周左右,无重症病例,预后好。结论 2011年冬季住院患儿流感活动呈高峰;IVB活动逐渐增强。单纯IVB肺炎重症病例少,临床症状无特异性,预后较好。

贵州省2013—2016年B型流感病毒流行特征分析

目的了解贵州省B型流感病毒的流行特征和规律,为其预防与控制提供依据。方法采用描述性方法对贵州省2013年4月1日—2016年3月31日B型流感病毒RT-PCR检测结果进行统计。结果贵州省2013—2016年3个监测年度B型流感病毒RT-PCR检测阳性1 904份,其中By系1 215份、Bv系642份,2013年4月—2014年3月、2014年4月—2015年3月2个监测年度B型流感的优势流行株都是By系,而2015年4月—2016年3月是Bv和By系共同流行,流行季节主要在冬春季;B型流感病毒男性检出所占比率较高,占56.83%;15岁以下低年龄组人群B型流感病毒检出数最高(70.80%),而Bv系在0~岁年龄组最高(42.37%),By系在5~岁年龄组最高(35.56%);混合感染病原组合构成主要以By+Bv为主,占67.65%,与B型有关的混合感染数占95.59%。结论贵州省B型流感病毒存在By和Bv两种系别的流行,流行季节为冬春季,男性感染病例多于女性,发病以15岁以下人群为主,加强低年龄群体流感疫苗的接种和监测具有重要意义。

荧光定量RT-PCR快速检测B型流感病毒的研究

目的:利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测B型流感病毒的方法。方法:根据B型流感病毒HA基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线;特异性检验后利用临床标本与普通RT-PCR法进行比较。结果:B型流感病毒检测反应的灵敏度为5.0×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0.998,扩增效率为107.8%,5种非B型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法具有很好的稳定性、重现性和特异性。结论:本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测B型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。

山东省2017—2018年B型流感病毒药物敏感性检测及神经氨酸酶基因特征分析

目的检测山东省2017-2018流感监测年度B型流感病毒对神经氨酸酶抑制剂的药物敏感性,分析其神经氨酸酶(NA)基因特征。方法选取山东省2017—2018年分离的18株B型流感病毒(Yamagata系16株,Victoria系2株),通过生物学耐药实验检测病毒对奥司他韦和扎那米韦的药物敏感性。提取病毒核酸后一步法RT-PCR扩增NA基因片段,双向测定核苷酸序列,对基因序列和氨基酸序列特征比对分析。结果在检测的18株B型流感病毒中,有1株Yamagata系病毒对奥司他韦和扎那米韦2种药物的敏感性均降低,此株病毒的NA基因发生H274Y位点突变。其余15株Yamagata系病毒和2株Victoria系病毒均为奥司他韦及扎那米韦的敏感株。结论随机选取的18株B型流感病毒中大多数病毒对神经氨酸酶抑制剂敏感,临床上可继续使用此类药物对流感患者进行治疗。应加强耐药性监测,警惕耐药株的出现。

两株B型流感病毒的基因组序列分析

目的了解两株B型流感病毒的基因组序列特征。方法对两株B型流感病毒进行全基因组序列测定和基因进化特性的分析。结果成功扩增出两株B型流感病毒的全基因组序列,并且两毒株的基因组均属于Yamagata系类似株Ⅱ系。两株病毒的基因组序列与疫苗株B/Florida/4/2006(Yamagata系)以及Victoria系代表株B/Brisbane/60/2008、B/Malay-sia/2506/2004相比,HA基因同源性为89.7%～97.3%,NB基因同源性则为95.4%～98.4%。两株病毒的HA蛋白与WHO推荐的疫苗株B/Florida/4/2006(Yamagata系)相比,存在11处氨基酸突变,其中HA的N131K氨基酸位点突变,可能对抗原性产生影响。NB的S198N氨基酸位点突变可能影响神经氨酸酶抑制剂的灵敏度。结论两株B型流感病毒的遗传进化状态稳定,但是与同分支中的毒株基因序列部分位点存在差异。

B型流感病毒核衣壳蛋白ELISA捕获法的建立和临床应用

目的制备和鉴定B型流感病毒核衣壳(N)蛋白单克隆抗体(mAb),建立双抗体夹心捕获抗原ELISA,用于B型流感病毒感染的早期诊断。方法用重组B型流感病毒N蛋白和B型流感病毒抗原免疫BALB/c小鼠制备mAb,采用ELISA间接法、免疫荧光(IFA)和免疫印迹(WB)进行筛选和鉴定,通过竞争抑制试验分析抗体识别表位,并采用抗体配对试验建立双抗体夹心捕获抗原ELISA检测B型流感病毒N抗原。结果获得12株特异性针对B型流感病毒N蛋白的mAb,识别8个不同的抗原位点,根据mAb识别抗原表位,对mAb进行多种组合的配对试验,筛选出2株单抗BN4和BN8混合作为捕获抗体,辣根过氧化物酶标记的单抗BN1和BN5混合作为测定抗体,建立了双抗体夹心ELISA,测定新鲜的漱口液标本的灵敏度达100%,而对冻融的漱口液标本检测灵敏度为83.9%,与其他呼吸道病毒如A型流感病毒、副流感病毒等无交叉反应,特异度达100%。结论获得特异性好的mAb,经过抗体的配对和优化,建立了一种灵敏度高、特异性强的B型流感病毒抗原的ELISA捕捉法,可用于B型流感病毒感染的早期实验室诊断及流行病学研究。

A型和B型流感病毒抗原的快速检测方法及临床应用

目的 介绍一种检测 A型和 B型流感病毒抗原的快速方法以便及早确诊病人是否患有流感及所患流感类型 ,从而为临床提供良好的治疗依据。方法 采用一种快速 EIA法检测 A型和 B型流感病毒抗原试剂盒检测有流感症状病人的咽拭子或鼻咽拭子中是否有流感病毒抗原。结果 从 2 0 0 1年 1 0月到2 0 0 3年 6月两年内累计检测了 2 88例病人标本 ,总阳性率为 1 1 .1 % ( 32 /2 88) ,且以 A型流感病毒感染为主 ( 8.3% )。 2 0 0 2～ 2 0 0 3年流感季节 ,流感病毒感染的总阳性率为 1 8.9% ( 2 7/1 43) ,A型流感病毒感染阳性率占 1 6.1 % ( 2 3/1 43) ,B型流感病毒感染阳性率占 2 .8% ( 4 /1 43)。这一季节内阳性结果主要集中在2 0 0 3年 1月 ;5 5例病人标本中 A型流感病毒感染的阳性率为 2 9.1 % ( 1 6/5 5 ) ;B型流感病毒感染的阳性率为 1 .8%。其中 1 2 y以下儿童 2 5例 ,A型流感病毒感染阳性率为 40 % ( 1 0 /2 5 ) ,是 B型的 1 0倍 ( 1 /2 5 )。结论 采用日本生产的快速 EIA法检测 A型和 B型流感病毒抗原试剂盒 1 5 min内可确定标本中是否有流感病毒抗原并能同时区分出两种主要流感病毒感染类型— A型流感或 B型流感 ,有利于疾病的早期诊断、治疗和预防 ,防止社区

一步法多重RT-PCR快速筛查A型、B型和新型甲型H1N1流感病毒

目的建立能同时筛查A型、B型和新型甲型H1N1流感病毒的多重RT-PCR技术。方法针对A型流感病毒的M基因、B型流感病毒的NS基因设计通用扩增引物,针对新型甲型H1N1流感病毒的HA基因设计特异性扩增引物,采用一步法建立多重RT-PCR反应体系。通过盲法实验与实时荧光RT-PCR进行比对来评价方法的准确性,并应用于临床评价方法的实用性和有效性。结果琼脂糖凝胶电泳分析多重RT-PCR产物,结果显示目的扩增片段条带清晰明亮,没有非特异性产物出现,可见该方法扩增效率高,特异性强。50份样本的盲法实验结果显示两种方法检测结果完全一致,符合率为100%。结论建立的多重RT-PCR方法能通过一次实验快速、准确地同时筛检A型、B型和新型甲型H1N1流感病毒,是一项成本低廉、对流感的疫情监测和早期诊断具有实用价值的筛检技术。

四川省2006年B型流感病毒抗原性及基因特性研究

[目的]阐明2006年四川省流行的B型流感病毒血凝素抗原性及其基因变异情况。[方法]对2006年分离的B型毒株进行单向血凝抑制实验,再将病毒株进行血凝素基因HA1区核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,然后进行基因进化特性分析。[结果]2006年四川省人群中同时流行着B型Victoria系和Yamagata系毒株。Victoria系毒株与B/Hongkong/330/2001比较,病毒单向血凝抑制效价均有4倍以上差异,并且在HA1区发生8个氨基酸替换,在197位增加一个糖基化位点。Yamagata系毒株与B/Shanghai/361/2002比较,病毒单向血凝抑制效价均有4倍以上差异,并且在血凝素基因HA1区有7个氨基酸位点发生改变,在196位增加一个糖基化位点。[结论]四川省2006年B型流感病毒的抗原性与B/Hongkong/330/2001、B/Shanghai/361/2002相比已经发生了变化。

2006年河北省新分离Victoria系B型流感病毒变异株血凝素基因序列分析

目的分析2006年河北省分离的B型流感毒株HA抗原性和基因特性,阐明HA基因的变异与流感流行的关系。方法用MDCK(Madin Darby Canine Kidney)细胞分离培养流感病毒,血凝抑制(Hemasslutination Inhibition,HI)试验鉴定型别。提取病毒核糖核酸(RNA),采用RT-PCR扩增病毒HA基因,纯化产物进行核苷酸序列测定,用DNAStar软件作分析处理。结果2006年在河北省流行的B型流感病毒属Victoria系,与北半球该流行期的国际疫苗株B/上海/361/02不同,其抗原性与最近的Victoria系代表株B/Hong Kong/330/2001相比已发生较大变异,核苷酸同源性仅为96.5%～97.2%,在抗原决定簇上有6个位点发生了氨基酸替换。结论2006年在河北省流行的Victoria系B型流感病毒是一个新的变种,在HA1区域发生的变异是今年B型流感流行的主要原因,应该引起重视。

272例B型流感病毒感染住院患儿的临床特点及实验室检查结果

目的：分析2012广东中山地区感染B型流感病毒的住院儿童的流行病学特点、临床特点及实验室检查结果。方法以直接免疫荧光的方法对2012年住院部急性呼吸道感染患儿的8649份咽拭子标本进行检测。对B型流感病毒抗原阳性的患儿的临床资料及实验室结果进行回顾性的总结分析。结果3.14%（272/8649）的患儿B型流感病毒抗原阳性，高峰出现在2012年1~3月份。发热是最常见症状，合并症包括肌炎（11例，4.0%）、急性喉炎（13例，4.8%）、毛细支气管炎、支气管炎、肺炎（其中2例合并急性呼吸窘迫综合征）、急性胃肠炎（其中3例合并上消化道出血）、高热惊厥、病毒性脑炎等。26.8%（73/272）的患儿出现白细胞减少症，白细胞增多症，血小板减少症发病率均为0.7%（2/272），0.7%（2/272），血小板增多症为1.1%（3/272）。88（35.1%）例患儿的CK水平升高（〉160 U/L）。结论 B型流感病毒感染的住院儿童症状无特异性，发热是最常见的症状，可出现多种合并症，白细胞减少症较常见，血小板减少症是罕见的。在B型流感病毒感染的儿童中，与CK水平升高和肌痛有一个显著的关联。

冷适应减毒B型流感病毒疫苗候选株的制备及鉴定(英文)

以冷适应、温度敏感、减毒的B/Ann Arbor/1/66流感病毒株作为重配病毒骨架,对其6个内部基因片段进行了全基因合成,同时人工引入9个氨基酸突变.构建了8个基因的拯救载体,经测序获得序列准确的拯救质粒,命名为:pAB121-PB1,pAB122-PB2,pAB123-PA,pAB124-HA,pAB125-NP,pAB126-NA,pAB127-M和pAB128-NS.在成功拯救冷适应A型流感病毒的基础上,利用反向遗传学技术成功获救了具有感染性的重配B型流感病毒株,命名为rMDV-B.该重配病毒株以B/Ann Arbor/1/66为病毒骨架,其中HA和NA来源于2006～2007年当年流行株B/Malaysia/2506/2004.rMDV-B在鸡胚尿囊液和MDCK细胞中的HA效价可达1∶64～1∶512.实验结果暗示:从单一供体病毒株可以产生有效的减毒活B型流感病毒疫苗候选株,能够为将来人用流感疫苗的设计提供可借鉴的模型.

2016年福建省B型流感病毒基因特征分析

目的分析2016年福建省B型流感病毒(Influenza Virus)血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuramidinase,NA)的基因变异。方法从中国疾病预防控制信息系统采集日期2016.1.1至2016.12.31的福建省流感监测数据。毒株来源2016年福建省流感网络监测流感样病例,提取病毒(犬肾传代细胞或鸡胚培养分离)核酸进行RT-PCR扩增HA和NA基因片段并测序,MEGA5.0分析基因特征。结果测序51株B型流感病毒HA、NA片段,与疫苗株核苷酸同源性在97.8%~100%。研究发现2株重配株(BY-NA/BV-NA)、耐药株1株、Victoria系HA片段新增一个糖基化位点(197),酶活性中心和周围的相关位点氨基酸仍保持高度保守。结论2016年福建省B型流感毒株少数发生变异与疫苗株不匹配。

昆明市2009～2013年B型流感病毒血凝素及耐药基因分析

目的研究B型流感病毒HA、NA全基因序列,为流感防控提供支持。方法从云南省疾病预防控制中心流感实验室分离毒株中挑选代表株进行HA和NA全基因序列分析。结果发现Bv型毒株和标准株比有K129N、K80R、K48E的变异,其中K129N在120环区域,除2009年分离株外,其他Bv株均有75位点的变异。By毒株HA基因相同突变位点比较多,如N116K、S150I、N165Y、S229D、D196N等,云南分离株都有D196N的变异位点,增加了糖基化位点的可能性。研究发现所有的NA基因没有发生耐药性基因的突变,同源性相对比较高,但有基因重组毒株生成。结论云南分离株B型流感病毒突变位点多,并且有重组毒株生成,说明加强监测耐药株的重要性。

蛋氨酸脑啡肽(MEK)抗B型流感病毒感染作用的研究

研究MEK抗B型流感病毒感染的作用。采用MDCK细胞和9～10日龄鸡胚,按不同的顺序加入不同剂量MEK和B型流感病毒,共培养72 h后做血凝实验。所有加入B型流感病毒的MDCK细胞均培养出病毒,HA滴度为1：64。在鸡胚尿囊腔中,先注入MEK孵育24 h后,再注入B型流感病毒的鸡胚也培养出病毒,HA滴度为1：6.8,与病毒对照组比较P〈0.01,有统计学意义。实验结果未见MEK直接抗B型流感病毒感染MDCK细胞株的作用,但可见MEK抗B型流感病毒感染鸡胚的作用。

p16蛋白对B型流感病毒诱导HeLa细胞凋亡的影响

以流感病毒 B/沪防 93- 1株感染 He L a细胞 ,通过 Hoechst332 5 8荧光染色、琼脂糖凝胶电泳分析检测细胞凋亡 ,并用免疫组化技术测定 p16蛋白的表达 ,探讨 p16蛋白表达对 He L a细胞凋亡的影响 .结果表明 ,B型流感病毒感染 He L a细胞可诱导其凋亡 ,感染 2 4h后 ,细胞凋亡数达 84.5 % ;He L a细胞凋亡伴随 p16蛋白的表达 ,2 4h达高峰 ,阳性率为 49.2 3± 1.70 .研究结果提示 ,B型流感病毒感染诱导 He L a细胞凋亡过程与 p16基因激活相关 ,p16蛋白可能是介导流感病毒诱导细胞凋亡的另一重要途径 .