应对高致病性禽流感病毒H5N1抗原漂移的通用疫苗策略

高致病性禽流感病毒(HPAIV)H5N1不仅能造成严重的病理损伤,而且能够跨越种间隔离从禽类直接传播给人类,对人类健康造成巨大的威胁。疫苗免疫是应对HPAIV H5N1最常用的防控手段。但由于流感病毒具有抗原漂移和抗原转变的能力,只针对特定流行株的常规疫苗不能够有效的应对毒株的不断变异。研制能够激发广泛保护作用的通用疫苗是应对HPAIV H5N1抗原漂移的一种有力措施,该类疫苗以流感病毒中高度保守的蛋白结构域,如M2蛋白胞外域(M2e)、HA蛋白的茎部结构域以及其他的保守抗原表位为免疫原,激发机体产生广泛的保护以应对不断变异的流感病毒。论文主要对现阶段通用疫苗的研究思路及进展做一梳理,以期能够为禽流感疫苗的研制提供有益的帮助。

禽流感病毒H5N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在真核酵母菌中的表达

目的克隆、表达和鉴定禽流感病毒H5N1血凝素基因(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶基因(neuramidinase,NA)序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法在成功克隆禽流感病毒H5N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMET A上,构建了重组表达质粒pMET A/HA(49～1 587 bp)、pMET A/NA(121～1 200 bp),电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示蛋白表达后形成了二聚体,蛋白纯度占总蛋白的95%以上,ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 HA、NA基因序列,为禽流感病毒H5N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供了依据。

不同免疫状态的小鼠对禽流感病毒H5N1感染的敏感性及其机制探讨

目的比较不同免疫状态的小鼠对禽流感病毒的易感性,并探讨可能的原因。方法四种免疫状态的小鼠,无菌BALB/c小鼠,SPF级BALB/c小鼠,SCID小鼠和nude小鼠,以10 TCID50的禽流感病毒50μL感染小鼠,观察小鼠的体重变化,存活率,各组织脏器的病毒分布,肺组织的细胞因子变化和肺组织病理病变。结果四种小鼠均能感染禽流感病毒,其中,无菌小鼠对禽流感病毒H5N1的易感性最低,存活率最高。并且病毒在无菌鼠体内病毒的复制水平最低,细胞因子TNF-α,IL-12,MIP2,GATA3,IFN-a/β在感染后表达水平最低,其中第7天最低。结论无菌小鼠能感染禽流感病毒,但是相比较SPF级BALB/c小鼠,SCID小鼠和nude小鼠,其易感性最低,可能与病毒在组织内的低复制和细胞因子的低表达均有关。

金银花抗流感病毒H5N1的分子机理研究

目的:探索金银花中有效成分绿原酸抗流感病毒的分子机理。方法:应用生物信息学软件surflex-DOCK将绿原酸与流感病毒神经氨酸酶进行模拟对接并打分。结果:通过与奥司他韦及扎那米韦的对比分析发现,绿原酸与神经酰胺酶的结合作用力介于二者之间。同时,绿原酸与神经酰胺酶的两个活性腔均有作用力发生。结论:为以绿原酸为先导化合物开发新型抗流感药物提供理论依据。

我国部分禽流感病毒H5N1之HA序列变异演化分析

从GenBank上获得我国人(Homo sapiens)、家禽和野鸟42株H5N1亚型禽流感病毒的HA基因核酸序列,利用DNAStar分析HA蛋白关键位点氨基酸残基的变化,比较HA基因核苷酸序列同源性,构建遗传进化树。探讨我国部分人、家禽和野鸟H5N1病毒基因的遗传进化关系。序列分析结果表明:禽流感病毒H5N1亚型的HA基因持续地发生着变异,但并非以均一速度进行,时间间隔愈长,核苷酸同源性愈低;我国同一地区或临近地区,当年或前后两年发生的人及家禽感染的禽流感病毒高度同源。推测我国部分人发生的禽流感可能是通过家禽感染的;候鸟的迁徙在传播病毒过程中所起的作用有待深入探讨。

禽流感病毒H5N1亚型NS1蛋白的研究进展

NS1蛋白(non-structural protein 1)是A型流感病毒重要的非结构蛋白,作为流感病毒的致病因子,NS1通过多种方式增强病毒的致病性和毒力。就H5N1禽流感病毒NS1蛋白的结构与功能进行了综述。

禽流感病毒H5N1亚型HA基因表达及其产物的应用

根据GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因(HA)(GenBank:DQ023145)序列设计一对引物P1、P2,以重组质粒pUC-HA为模板扩增去除信号肽的HA成熟蛋白。PCR产物克隆入pMD18-T载体,经测序发现在967位A突变为T,形成一个终止密码子TAA。在突变位点附近设计两条有21个碱基配对的突变引物P3、P4,采用重叠延伸剪切法(SOE)用A定点替换T碱基,然后将正确的基因片段定向插入到表达载体pET-32a(+)中,诱导表达获得正确的表达产物。Western-blot分析表明,表达的重组蛋白能与经BL21(DE3)大肠杆菌菌体裂解液处理的H5亚型禽流感病毒阳性抗血清发生特异性反应。利用纯化的重组HA蛋白初步建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体的间接ELISA方法,该方法可以代替传统的血凝与血凝抑制方法用于区分禽流感病毒的血清亚型。本研究为禽流感病毒亚单位疫苗及新型诊断试剂盒的研究奠定了基础。

东南亚禽流感病毒H5N1的HA基因特征分析

目的分析东南亚禽流感病毒HA基因和蛋白序列的特点,比较与我国人禽流感病毒的异同,为人禽流感防控工作提供参考。方法从GenBank获得东南亚和我国H5N1禽流感病毒HA核酸序列,ClustalX1.83和MEGA4.0对HA核酸和蛋白分析,构建遗传进化树。结果东南亚各国H5N1病毒受体位点氨基酸为QSG;越南、泰国、柬埔寨HA蛋白关键位点氨基酸基本没有变化;印尼多个样本发生改变,进化树中聚于一个分支内;中国人与老挝、马来西亚样本关键位点氨基酸相同,进化树中处于同一分支中。结论越南、柬埔寨和泰国H5N1病毒流行株HA蛋白未影响病毒毒力,印尼为一独立的病毒体系,中国与老挝和马来西亚样本来源于同一毒株,中国、老挝和马来西亚之间存在着病毒扩散现象。

禽流感病毒H5N1亚型NS1蛋白的真核表达及其在细胞中的分布

为构建禽流感病毒(AIV)H5N1亚型非结构蛋白NS1的真核表达载体,并鉴定其在哺乳动物细胞中的表达与分布,本研究采用RT-PCR技术,从甲型流感病毒的总RNA中扩增NS1全长基因,并将其克隆于pXJ40中,构建真核表达载体pXJ40-HA-NS1。将该重组质粒转染293T细胞,通过western blot方法鉴定表达的NS1蛋白;并以免疫荧光技术观察NS1在H1299细胞中的分布与定位。Western blot结果显示NS1基因编码蛋白获得表达,免疫荧光检测显示NS1蛋白主要存在于细胞核中。本研究为NS1蛋白功能和H5N1亚型AIV致病机制的研究奠定了基础。

我国2006-2007年人禽流感病毒H5N1亚型HA特征分析

目的分析H5N1禽流感病毒HA基因核酸和蛋白变异、分子流行病特征及病毒溯源,为制备相应病毒疫苗提供信息。方法获取GenBank上2006-2008年我国及邻国人及禽类H5N1病毒HA核酸序列,Clust-alX1.83和MEGA4.0对HA核酸和蛋白关键位点氨基酸残基分析,比较同源性,构建HA核苷酸遗传进化树。结果本文人源样本基因变异率为4.1%-4.6%,高于该病毒平均变异率;我国人和家禽样本高度相似,2007年越南和马来西亚与中国样本核苷酸和氨基酸高度相似。结论病毒适应人类这个新宿主时为避免强大的免疫压力进行了适应性变异,可能更易于感染人类,但病毒抗原性尚未改变;毒株在邻近国家之间存在扩散现象。

东南亚禽流感病毒H5N1亚型神经氨酸酶变异特征及进化分析

目的分析东南亚H5N1禽流感病毒NA蛋白特点,比较各国病毒NA核酸进化特点,为人禽流感防控工作提供参考。方法从GenBank获得东南亚和我国H5N1禽流感病毒NA核酸序列,ClustalX1.83和MEGA4.0对NA核酸和蛋白分析,构建遗传进化树。结果2004年以后东南亚各国H5N1病毒NA茎部均有20个氨基酸残基缺失;越南、泰国和柬埔寨及印尼样本分别在NA多个位点氨基酸残基替换相同,上述国家样本在进化树中各聚一分支内;2005年中国与2006年后老挝样本聚于一分支。结论2004年以后病毒可能能更好的适应人体内环境;越南、泰国、印尼H5N1病毒NA具有地域性;2006年以后老挝毒株可能由2005年中国毒株扩散到老挝。

禽流感病毒H5N1血凝素基因适应性进化过程中的关键位点突变规律研究

目的:寻找导致禽流感病毒H5N1血凝素(HA)适应性进化的关键突变,建立氨基酸突变评价体系,对突变作用进行评估,印证它们与病毒适应性进化的关联性。方法:计算株频率和枝频率,寻找标记分枝,向根结点回溯寻找HA进化路径上的氨基酸突变。计算各突变位点氨基酸的频率变化、有效变换及高频次突变,基于以上几个因素建立突变评价体系。结果:建立了大规模自动化寻找突变的方法,计算得到HA进化过程中的氨基酸突变435个,通过氨基酸频率图表分析这些突变可以很好地反映病毒适应性进化过程,其中79个突变是有效变换,发生的位点为正选择位点,且多数位点落在HA抗原表位上;29个突变是高频次突变,其中多数也为有效变换,因而与病毒适应性进化密切相关。结论:大规模自动化寻找突变的方法可靠,建立的突变评价体系准确性高,找到的关键突变及位点对实验有很好的指导意义。

流感病毒H5N1对野生动物的威胁

20世纪爆发的几次A型流感大流行曾经造成巨大的损失。进入21世纪以来A型流感病毒H5N1又在最近几年爆发,不仅给养禽业和人类造成巨大打击,也对野生动物产生了极大的威胁。本文通过分析H5N1型流感的疫情,提出了针对保护野生动物特别是圈养种群的措施。

H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化法导入根癌农杆菌EHA105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,HA基因已插入到水稻基因组中,重组HA基因大小为4660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组HA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组HA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组HA蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组HA蛋白。

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及原核表达

克隆、表达和纯化禽流感病毒H5N1 NS1基因序列,为筛选与NS1相互作用的宿主蛋白以及深入研究NS1蛋白的功能打下基础.根据GenBank中收录的H5N1亚型禽流感病毒NS1基因序列,设计并合成一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增AIV NS1基因,将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-28a载体上,经酶切分析及序列测定正确后,鉴定出NS1基因的阳性重组子.阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用1 mmol/L IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE检测,获得预期蛋白的表达,通过Ni-NTA树脂蛋白纯化系统对NS1蛋白进行纯化.结果成功克隆H5N1亚型AIV的NSl基因,其核苷酸序列长度为678 bp,重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,表达产物在上清及包涵体中均有表达.经纯化,目的蛋白纯度高达90%,成功表达纯化出28KD的NS1融合蛋白并鉴定其免疫学活性.成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 NS1基因序列,为进一步研究NS1蛋白的生物学功能奠定了坚实基础.

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因截短体的克隆与原核表达

禽流感病毒H5N1 NS1蛋白是一种非结构蛋白,在病毒感染过程中发挥着重要的作用。构建基因截短的重组蛋白,可为进一步研究NS1不同结构域与宿主蛋白间的相互作用奠定基础。在成功克隆禽流感病毒H5N1全长NS1基因并测序的基础上,将部分截短基因序列克隆到表达载体pET28a(+)上,构建基因截短的重组表达质粒pET28a-NS1-RBD和pET28a-NS1-ED,转化大肠埃希菌BL21(DE3),阳性重组质粒经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测,获得预期蛋白的表达,然后利用Ni-NTA树脂蛋白纯化系统对重组蛋白进行纯化,并通过Western Blotting进一步确认NS1及截短体蛋白的表达。结果表明,实验成功构建禽流感病毒H5N1亚型的NS1蛋白截短体,并在大肠埃希菌中高效表达,这为进一步研究NS1蛋白不同结构域与宿主蛋白的相互作用提供了实验材料,为深入研究NS1蛋白的生物学功能奠定了坚实基础。

含H5N1禽流感病毒核酸序列的病毒样颗粒的制备及应用

目的构建耐RNase酶的内含禽流感病毒H5N1亚型部分核酸序列的病毒样颗粒。方法构建中间载体pET32a-MS2,将禽流感病毒H5N1亚型的HA、NA和M基因片断连接到中间载体上,构建原核表达载体pET32a-MS2-HA,pET32a-MS2-NA和pET32a-MS2-M,分别转化宿主菌,诱导表达制备病毒样颗粒。结果表达载体经PCR、酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。电镜观察到了病毒样颗粒,荧光定量RT-PCR试验表明颗粒稳定性良好。结论成功构建了含禽流感病毒H5N1部分核酸序列的病毒样颗粒且稳定性良好,可作为禽流感H5N1亚型RNA检测的标准品和质控品。

抗禽流感病毒H5N1分泌型IgA在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

分泌型IgA(SIgA)在机体的粘膜免疫中具有重要作用,在外分泌道中比单体IgA和IgG抗体具有更好的抗感染活性。为了表达抗禽流感病毒H5N1人-鼠嵌合分泌型IgA抗体,首先以本室先前构建的稳定表达IgA的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞系为基础,共转染分泌片和J链表达质粒,然后用抗生素Zeocin选择阳性克隆细胞,利用倍比稀释的方法筛选分泌SIgA的单克隆细胞,通过Western blotting分析培养上清中SIgA的表达情况。结果表明,在CHO细胞中成功表达了SIgA抗体,上述研究为研制分泌型IgA抗体制剂奠定了良好的基础。

H5N1亚型禽流感病毒RNA聚合酶PB1_P亚基片段的表达、纯化和结晶

根据GenBank中H5N1亚型禽流感病毒RNA聚合酶PB1基因序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增H5N1亚型禽流感病毒的PB1_P基因,克隆到原核表达载体pET-28a载体中,经PCR、酶切和测序分析后,鉴定出阳性重组子。将阳性质粒pET-28a/PB1_P转化大肠杆菌BL21(DE3),用0.5mol/L IPTG,在37℃诱导表达4h,经SDS-PAGE和Western-blot检测,获得重组蛋白PB1_P表达。并经Ni-NTA柱亲和层析与柱层析纯化表达蛋白,采用悬滴气相扩散法对纯化蛋白进行结晶。结果成功构建pET-28a/PB1_P重组质粒,SDS-PAGE结果显示重组蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,Western-blot证明表达的融合蛋白具有良好的免疫原性,经蛋白纯化、初筛结晶,得到PB1_P重组蛋白初筛晶体,为深入研究流感病毒聚合酶的生物学功能、开发新型H5N1亚型禽流感病毒检测试剂盒奠定了良好的基础。

中国南方地区3株H5N1亚型人禽流感病毒血凝素基因特性

目的研究中国南方地区H5N1亚型人禽流感病毒血凝素基因分子特征。方法从Genebank中下载中国南方地区3株H5N1亚型人禽流感病毒和其他国家或地区的16株代表性H5N1亚型人禽流感病毒血凝素基因序列,利用生物信息学软件DNASTAR 5.0进行核酸同源性分析,用MEGA 3.1进行核酸和氨基酸序列比对和进化树分析。结果中国南方3株H5N1亚型人禽流感病毒HA蛋白的重链区和轻链区连接肽的序列为LRERRR-KR,与动物分离的高致病性H5N1亚型禽流感病毒和东南亚地区人禽流感病毒的连接肽相比,减少1个碱性氨基酸;共有8个潜在的糖基化位点,抗原决定簇位点有其独特的特征。基因进化树表明中国南方3株H5N1亚型人禽流感病毒HA基因位于单一的进化簇,与动物来源的高致病性禽流感病毒HA基因同源性高。结论中国南方3株H5N1亚型人禽流感病毒HA基因分子特征一致,有其显著的独有特点。提示候鸟或其他扩散因素在高致病性H5N1亚型流感病毒HA基因的重配方面扮演了重要的作用。