GST pull-down验证流感病毒PB1-F2蛋白与热休克蛋白40的相互作用

为体外验证流感病毒PB1-F2与热休克蛋白Hsp40相互作用,通过两个方向的GST pull-down试验验证PB1-F2与Hsp40的相互作用。构建GST-多肽融合蛋白原核表达载体pGEX-6P-1-PB1-F2和pGEX-6P-1-Hsp40,并在大肠杆菌(E.co-li)BL21中诱导表达;构建真核表达载体pLEGFP-Hsp40及pCAGGS-PB1-F2,并分别转染293T细胞使其表达Hsp40及PB1-F2融合蛋白,然后进行GST pull-down试验验证二者的相互作用。成功地构建了两种蛋白的各种表达载体,经表达、纯化获得了可溶性的GST-多肽融合蛋白,GST pull-down试验正反两方向都证实了PB1-F2与Hsp40的相互作用,初步证实了流感病毒PB1-F2在体外能与Hsp40发生相互作用。

甲型流感病毒PB1-F2蛋白功能的研究进展

PB1-F2蛋白是甲型流感病毒表达的第11类蛋白，含有87～90个氨基酸残基，主要定位在线粒体中，可以诱导宿主细胞线粒体途径的细胞凋亡。部分流感病毒毒株的PB1-F2蛋白可以提高流感病毒聚合酶活性，从而促进病毒在宿主细胞中复制。同时完整的PB1-F2蛋白上存在特异的抗原表位，能诱导宿主体内免疫T细胞的表达，引起其免疫水平的改变，这与二次细菌感染引发的肺损伤具有显著关联。甲型流感病毒有多种亚型，而且存在地区间差异。国内、外在关于PB1-F2蛋白的作用机制与功能方面的研究大多针对一个地区的一种亚型的流感病毒毒株，且很多都是建立在假设的基础上，因此，对于PB1-F2蛋白的作用机制及其对宿主的影响有待于开展进一步的研究。作者就甲型流感病毒PB1-F2蛋白的功能学研究进展作一综述。

新型甲型H7N9流感病毒PB1-F2蛋白基因进化和变异分析

目的：对新型甲型H7N9流感病毒PB1-F2蛋白基因的进化和变异进行分析，为进一步研究致病性禽流感的致病机制和毒力因子奠定基础。方法：从IRD数据库中下载2013年2月19日至2013年10月31日的H7N9流感病毒PBl基因序列63条，运用MEGA5．2．1软件进行序列分析，用邻接法构建基因进化树；通过氨基酸序列分析PB1基因95～367片段的PB1-F2蛋白氨基酸位点变化；应用Excel表格对氨基酸构成进行计算；运用Predictive Analytics Software（PASW）18．0软件对氨基酸构成改变进行统计分析。结果：63株甲型H7N9毒株中有17株毒株的PB1-F2蛋白在其氨基酸序列第25位后发生断裂。新型甲型H7N9的进化主要分为两个系别，系别I主要由完整型PB1-F2蛋白毒株构成，系别Ⅱ主要由52aa截短型PB1-F2蛋白毒株构成。完整型PB1-F2蛋白与截短型PB1-F2蛋白各类氨基酸构成存在差异。结论：H7N9流感毒株中存在着截短型PB1-F2蛋白毒株，并且H7N9流感病毒毒株PB1-F2蛋白断裂位点均在25位氨基酸后，这将成为H7N9流感毒株进化过程中重要的特征。完整型PB1-F2蛋白与截短型PB1-F2蛋白氨基酸构成的差异对于甲型H7N9流感病毒致病性的影响有待进一步研究。

A型流感病毒PB1-F2蛋白的原核表达、纯化及鉴定

对A型流感病毒PB1-F2蛋白进行了原核表达及纯化,获得了谷胱甘肽硫转移酶(GST)-PB1-F2融合蛋白,以用于研究流感病毒PB1-F2蛋白的功能及分子作用机制。以RT-PCR方法扩增PB1-F2基因,将其克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上。重组质粒pGEX-6P-1-PB1-F2转化大肠杆菌(Es-cherichia coli)菌株BL21,并诱导表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western blot试验鉴定。结果显示,大肠杆菌细胞经诱导,表达出了相对分子量约为36kDa的蛋白,与GST-PB1-F2融合蛋白大小相符;Western blot鉴定显示,该融合蛋白能够被抗GST的抗体特异性识别。试验在大肠杆菌表达系统中成功表达纯化了GST-PB1-F2融合蛋白,为深入研究PB1-F2蛋白的功能奠定了基础。

流感病毒PB1-F2蛋白通过激活ERK1/2激酶刺激AP-1转录因子的活化

为探索A型流感病毒PB1-F2蛋白对转录因子AP-1信号通路的调控机制,本研究通过荧光素酶报告基因试验检测PB1-F2蛋白的表达对AP-1转录活性的调控,利用荧光定量PCR和免疫印迹方法检测PB1-F2对c-Fos/AP-1的m RNA转录和ERK1/2磷酸化水平的影响,并以ERK通路特异性抑制剂U0126抑制ERK1/2的活性后,以验证PB1-F2调控AP-1是否通过ERK1/2激酶介导。结果显示:A549和293T细胞中表达PB1-F2蛋白后,AP-1的转录活性均显著升高,并且c-Fos/AP-1的m RNA转录水平呈现显著上调;过表达PB1-F2蛋白同样能够显著上调磷酸化ERK1/2水平;以U0126抑制ERK1/2激活后,PB1-F2上调AP-1转录活性的作用显著下降。本研究表明,流感病毒PB1-F2蛋白能够通过激活ERK1/2激酶诱导AP-1转录因子的活化,为进一步研究PB1-F2蛋白参与调控炎症反应的机制提供了实验依据。

A型流感病毒PB1-F2蛋白的结构与功能研究进展

PB1-F2蛋白是一种流感病毒蛋白,蛋白通过诱导巨噬细胞凋亡降低宿主的免疫反应。PB1-F2蛋白介导的细胞杀伤作用通过阻碍专职抗原递呈细胞对后天免疫的调节而增加继发细菌感染的可能性,从而使病毒的致病性增加。现就PB1-F2蛋白结构与功能方面的研究进展做一综述。

A型流感病毒PB1-F2蛋白与蛋白激酶R相互作用研究

为研究A型流感病毒的重要毒力因子PB1-F2对蛋白激酶R(PKR)的调控机制,通过纯化GST-PB1-F2融合蛋白,利用GST pull-down试验证实了PB1-F2与PKR发生相互作用;采用免疫荧光试验进一步验证了二者的相互关系;实时荧光定量PCR表明PB1-F2能负调控PKR及IL-6的mRNA水平;采用siRNA干扰PKR基因的表达后,PB1-F2抑制IL-6的mRNA转录作用更显著。进一步运用蛋白免疫印迹方法检测了PB1-F2对PKR及其底物eIF-2α蛋白磷酸化水平的影响,显示过表达PB1-F2后,PKR及eIF-2α的磷酸化表达水平明显下调。本研究表明PB1-F2与PKR相互作用而抑制PKR磷酸化活化,并通过PKR调控IL-6的表达,为探索PB1-F2的未知生物学功能提供了重要信息。

A型流感病毒PB2蛋白帽子结合结构域的原核表达与鉴定

A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,严重威胁全球公共卫生安全。PB2蛋白的帽子结合结构域(CBD)在流感病毒的转录过程中发挥重要功能,是抗流感病毒药物的重要靶点之一。为获得高纯度原核表达的A型流感病毒的CBD蛋白,本研究利用同源重组策略将8×His标签与一株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的CBD区基因序列克隆至原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-8×His-CBD,经PCR及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经不同浓度IPTG诱导不同时间后,经SDS-PAGE检测蛋白表达后使用镍柱纯化。结果显示,菌体裂解上清中在21 ku处可见目的条带,与8×His-CBD蛋白预期大小符合,且以0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导6 h时蛋白表达量最高,镍柱纯化后可获得纯度大于95%的8×His-CBD蛋白。为确定该蛋白是否具有生物学活性,本研究以帽子结构类似物m7GTP对其进行等温滴定量热试验,结果显示8×His-CBD蛋白和m~7GTP结合时存在明显热峰,表明8×His-CBD蛋白具有生物学活性;经计算,其Kd值为1.71×10^(-5)(±2.92×10^(-6))mol/L。本研究结果对流感病毒的基础研究和抗流感病毒药物的研发具有借鉴意义。

A型流感病毒新蛋白PB1-F2的研究进展

A型流感病毒主要引起人、禽、猪等的流感,PB1-F2蛋白是一种新发现的流感病毒蛋白,是由病毒基因片段2编码的非结构蛋白,可促进线粒体途径引起的细胞凋亡,其对A型流感病毒的复制和毒力等有重要影响。

H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因在昆虫细胞中的表达

为通过昆虫细胞表达出H9N2亚型禽流感病毒M1和NA蛋白,并鉴定其免疫活性,利用PCR技术扩增H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因,以pFastBacDual为转移载体构建重组转移载体pFastBacDual-M1和pFastBacDual-NA;将阳性重组转移载体分别转化至DH10Bac感受态细胞,得到重组杆粒rBacmid-M1和rBacmid-NA;将重组杆粒分别转染Sf9昆虫细胞,获得含M1和NA基因的重组杆状病毒rBV-M1和rBV-NA;运用IFA和Western-blot鉴定M1和NA蛋白的表达情况,同时以NA蛋白为包被抗原,运用间接ELISA方法鉴定NA蛋白的反应活性。结果显示,IFA鉴定均出现特异性绿色荧光,Western-blot检测M1和NA蛋白大小分别约为28和52 ku,ELISA检测NA蛋白对抗H9N2阳性血清有很高的反应值。结果表明,M1和NA蛋白可在昆虫细胞中特异性表达且具有反应原性。本试验为进一步研发H9N2亚型禽流感诊断技术和疫苗奠定了基础。

酵母双杂交筛选人白细胞文库中与A型流感病毒PB1-F2相互作用的蛋白

利用酵母双杂交技术筛选白细胞文库中与A型流感病毒PB1-F2相互作用的宿主蛋白,为研究PB1-F2蛋白的功能提供依据。构建pGBKT7-PB1-F2诱饵重组载体,在证实诱饵蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛选人白细胞文库中与PB1-F2相互作用的细胞蛋白。对阳性克隆进行测序和生物信息学分析,并在酵母细胞内验证蛋白的相互作用。Western blot结果表明,酵母表达载体pGBKT7-PB1-F2在酵母中成功表达PB1-F2融合蛋白。酵母双杂交筛选并验证,获得了8个与流感病毒PB1-F2蛋白相互作用的宿主蛋白。本研究有助于在分子水平上探索PB1-F2蛋白的新功能,为揭示流感病毒的致病机理奠定基础。

A型流感病毒PB1-F2蛋白与MOAP-1的相互作用

【目的】探讨A型流感病毒PB1-F2蛋白和人类凋亡调节因子1(MOAP-1)之间的相互作用。【方法】构建pACT2-MOAP-1重组质粒,与pGBKT7-PB1-F2质粒共转化酵母AH109,检测转化菌在四缺培养基的生长情况及β半乳糖苷酶报告基因的活性;利用GST pull-down和免疫共沉淀(Co-IP)技术进一步验证PB1-F2与宿主细胞蛋白MOAP-1的相互作用;通过过表达PB1-F2和MOAP-1,检测PB1-F2对MOAP-1蛋白表达水平的影响。【结果】酵母双杂交结果表明,PB1-F2和MOAP-1可以在酵母细胞内特异性结合。GST pull-down和Co-IP实验也进一步证实了这两种蛋白的相互作用,而且PB1-F2可上调外源MOAP-1的蛋白水平。【结论】流感病毒PB1-F2与MOAP-1存在相互作用,PB1-F2可能通过与MOAP-1的相互作用参与调控细胞生长及凋亡过程。

A型流感病毒中国分离株PB1-F2基因进化分析

【目的】明确国内鸡源H9N2禽流感病毒(AIV)的PB1-F2基因分子进化特征,并进一步全面了解国内A型流感病毒(IAV)流行株的PB1-F2的流行情况。【方法】对分离自北方发病鸡群中的14株H9N2亚型AIV进行了PB1-F2基因的克隆和序列测定,并从GenBank数据库下载了禽源、猪源和人源H5N1和H9N2亚型AIV、人源和猪源H1N1和H3N2IAV的PB1基因共计337个,系统的对国内不同宿主来源的IAV的PB1-F2基因进行了分子进化分析。【结果】上述IAV的PB1-F2基因形成了6个不同的进化分支。推导的PB1-F2蛋白表现出长度的多态性,因IAV的HA类型和宿主来源的不同,其表达功能性PB1-F2蛋白的比率也存在差异。【结论】本研究明确了国内IAV的PB1-F2基因的系统进化特征,为该基因功能的研究提供了分子流行病学资料。

H5N1禽流感病毒PB1-F2特异性单克隆抗体的制备与鉴定

以重组的H5N1亚型禽流感病毒(AIV)PB1-F2的C端蛋白(cPB1-F2)为免疫原制备单克隆抗体,并鉴定其特异性。构建cPB1-F2的pGEX-6p-1原核表达载体,进行蛋白表达与纯化;采用杂交瘤技术制备筛选抗重组cPB1-F2蛋白的杂交瘤细胞株,利用间接免疫荧光和酶联免疫吸附试验筛选鉴定阳性细胞株,并对单克隆抗体特异性进行鉴定。结果显示,纯化的重组cPB1-F2蛋白具有良好的免疫原性,筛选获得了3株稳定分泌抗cPB1-F2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为6F4、2C5和4D3,经鉴定抗体均为IgG1亚类,且3株单克隆抗体均能特异性识别重组PB1-F2蛋白。结果表明成功制备了cPB1-F2特异性单克隆抗体,为研制针对流感病毒的抗体药物奠定了基础。

PB1-F2长度改变对H3N2犬流感病毒影响的研究

H3N2犬流感病毒(H3N2 CIV)是流感病毒在进化过程中新形成的一个分支,在我国多地的犬中广泛流行。PB1-F2蛋白是甲型流感病毒的毒力因子,并可能与流感病毒的跨宿主传播相关。为探究PB1-F2长度的改变对H3N2 CIV的影响,本研究分别构建了包含H3N2 CIV各基因节段的重组质粒及携带M1R(PB1-F2的aa1由M突变为R)及S^(11)Stop(PB1-F2 aa11由S突变为终止氨基酸序列)突变的重组质粒pHW-PB1-F2-M1R和pHW-PB1-F2-S^(11)Stop,并均经测序鉴定。通过反向遗传操作技术,分别拯救了如下3株重组病毒:表达90个氨基酸PB1-F2的重组亲本病毒rH3N2;不表达PB1-F2的重组病毒rH3N2-M1R;仅表达11个氨基酸PB1-F2的重组病毒rH3N2-S^(11)Stop。将这3株重组病毒利用MDCK细胞传代后分别对其8个基因节段经PCR扩增及测序以鉴定其遗传稳定性。测序鉴定结果显示,3株重组病毒均正确构建,且不同代次之间各重组病毒的基因序列及各突变位点均相同,表明本研究构建的重组病毒具有较好的遗传稳定性。将表达PB1、PB1-F2-M1R及PB1-F2-S^(11)Stop的重组质粒分别与重组质粒PB2、PA和荧光素酶报告质粒pPolI-Luci-NP及海肾荧光素酶表达质粒共转染293T细胞,48 h后利用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性并比较3株重组病毒的聚合酶活性;测定3株重组病毒感染MDCK细胞后不同时间的TCID50以绘制病毒的生长曲线;将3株重组病毒均以106TCID50/50μL经鼻腔感染小鼠,分析各重组病毒对小鼠的致病性。用以评价PB1-F2长度改变对H3N2 CIV的影响。结果显示,rH3N2-S^(11)Stop的聚合酶活性与rH3N2相比无明显变化,而rH3N2-M1R的聚合酶活性则显著高于rH3N2(P<0.05);rH3N2-M1R和rH3N2-S^(11)Stop在MDCK细胞中的复制效率显著高于rH3N2(P<0.05),且rH3N2-M1R的复制效率要高于rH3N2-S^(11)Stop。小鼠的致病性试验结果显示,感染重组病毒后的小鼠表现被毛粗乱、精神不振、食欲减退等症状;3株重组病毒均对小鼠体质量有轻微影响,并对小鼠肺脏均造成了轻微病理损伤,但三者对小鼠体质量及肺脏的影响差别不明显。本实验结果首次证实,PB1-F2的不表达能够提高H3N2 CIV的转录效果,且PB1-F2长度的改变能够提高H3N2 CIV在细胞中的复制效率,但对病毒在小鼠中致病性的影响较小。本研究初步探究了PB1-F2长度的改变对H3N2 CIV的影响,为该病毒致病机制及其感染防控技术的研究与制定提供了参考依据。

禽流感病毒NS1蛋白与ANXA2蛋白相互作用的研究

为鉴定与禽流感病毒(AIV)NS1蛋白相互作用的宿主蛋白,本研究以AIV GD1322株感染人肺泡上皮细胞(A549),利用NS1蛋白的单克隆抗体(MAb)进行免疫沉淀反应(IP)筛选与其结合的宿细胞蛋白,并经质谱鉴定确认膜联蛋白A2(ANXA2)与NS1蛋白之间可能存在相互作用关系。免疫共沉淀(Co-IP)试验结果显示ANXA2与NS1蛋白之间具有稳定的相互作用关系;而且,Pull-down试验证明ANXA2与NS1蛋白之间为直接的相互作用。此外,激光共聚焦试验表明NS1和ANXA2共定位于胞浆中。本研究首次鉴定AIV NS1蛋白与宿主蛋白ANXA2间存在相互作用,为进一步研究AIV NS1蛋白的功能奠定了基础。

猪流感病毒聚合酶PB1蛋白亚细胞定位的研究

猪流感病毒PB1蛋白在其复制中起着转录作用,是病毒复制所必需的蛋白。克隆了猪流感病毒的PB1基因,构建重组真核表达载体p3xFLAG-CMV-7.1-PB1,利用脂质体转染Vero细胞后,分别用Western blot和IFA检测重组蛋白FLAG-PB1蛋白的表达,结果表明重组蛋白能在真核细胞中得到表达,其亚细胞定位为细胞核表达,与其功能密切相关,为以后流感病毒的相关研究打下了基础。

甲型流感病毒PB1-PA蛋白作用位点的发现与分析

基于共进化理论,探究了甲型流感病毒PB1蛋白与PA蛋白上具有共同进化可能性的保守九聚片段(C9MP)。结构信息显示PB1蛋白的第1-15位氨基酸与PA蛋白的第239-716位氨基酸具有相互作用域;对该区域变异分布的分析发现,PA蛋白第670位氨基酸Q所在的C9MP与PB1蛋白的第9位氨基酸F、第12位氨基酸V和第13位氨基酸P所在的C9MP在PB1MP1相互作用面上具有最低的共进化值。结合DSSP程序的分析表明,由PA蛋白第670位氨基酸Q与PB1蛋白的第9位氨基酸F、第12位氨基酸V与第13位氨基酸P构成的区域可能成为潜在的相互作用位点。

禽流感病毒新疆株A/Duck/XJ/4(H5N1)的PB1、PB2和PA基因测序及进化分析

通过RT-PCR技术对禽流感病毒新疆株A/Duck/X J/4（H5N1）的PB1、PB2和PA基因分别进行了扩增及克隆，测序结果表明该毒株的PB2、PB1和PA基因全长核苷酸序列分别为2341 bp、2282 bp和2187 bp。同源性分析表明A/Duck/X J/4（H5N1）株与禽源、野生鸟类和猪源的禽流感毒株均有很高的同源性（86.3%-99.6%）。与人源毒株相比，PB2和PA与A/HK/156/97（H5N1）株的同源性较低（86.3%-88.7%）;与A/V ietnam/CL01/2004（H5N1）株和A/hum an/Zhejiang/16/2006（H5N1）株的同源性较高（93.0%-98.8%）;PB1与人源毒株A/HK/156/97（H5N1）、A/V ietnam/CL01/2004（H5N1）、A/hum an/Zhejiang/16/2006（H5N1）同源性为91.1%-93.2%。

H3N2流感病毒非结构蛋白-1真核表达载体的构建与表达及其对293T细胞增殖的影响

目的:构建甲型H3N2流感病毒非结构蛋白-1(nonstructal-1,NS1)真核表达载体并表达其编码蛋白;探讨NS1对细胞增殖的影响。方法 :从江苏省甲型H3N2流感病毒毒株提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T/NS1质粒,双酶切pMD18-T/NS1与pXJ40-HA后,构建真核表达载体pXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过免疫印迹法鉴定NS1蛋白的表达。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]法检测NS1转染细胞后对细胞增殖的影响。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功;免疫印迹法证实NS1蛋白的表达。MTT法证实转染NS1质粒后对细胞增殖有抑制作用。结论:成功克隆了NS1全长基因,构建了其真核表达载体,并初步验证了NS1蛋白过表达后能抑制细胞的增殖,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1的细胞模型和NS1蛋白对细胞增殖和凋亡作用机制的进一步研究提供了基础。