流行性乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒和寨卡病毒四重LuminexxTAG检测方法的建立与应用

【目的】黄病毒科虫媒病毒引起的人畜共患传染病对我国畜牧业及公共卫生造成严重影响。虫媒病毒种类多且感染症状相似,临床监测工作繁重,建立4种危害严重的黄病毒科虫媒病毒快速、高通量检测技术为其诊断和流行病学监测提供技术支撑。【方法】利用Luminex xTAG技术,针对流行性乙型脑炎病毒(JEV)5'UTR、西尼罗病毒(WNV)5'UTR及部分C基因、黄热病毒(YFV)5'UTR和寨卡病毒(ZIKV)NS5基因保守区,设计4对特异性引物并对引物进行TAG和Biotin修饰,以标准毒株为模板,进行多重PCR扩增;将扩增产物与带有反向TAG序列的不同编号荧光MagTAG磁珠、链霉亲和素R-藻红蛋白进行核酸杂交反应,利用Luminex 200系统检测磁珠荧光信号和藻红蛋白荧光信号,对病原进行分类和定量检测。【结果】建立了能特异性检测JEV、WNV、YFV和ZIKV的四重Luminex xTAG方法,其最优引物工作浓度为0.5、0.5、0.75、0.5µmol/L;杂交工作体系为磁珠工作液20μL、PCR扩增产物5μL、SAPE报告缓冲液75μL;杂交温度为37℃,杂交时间为30 min,pH值为8.0;该检测方法特异性好且不与登革病毒等其他虫媒病毒发生交叉反应。重复性试验结果表明,Luminex xTAG方法的批内变异系数为2.50%~5.63%,批间变异系数为3.61%~12.50%。四重Luminex xTAG方法对JEV和ZIKV的检测限为1×10^(4) copies/μL,对WNV和YFV的检测限为1×10^(3)copies/μL,其检测WNV、YFV和ZIKV的灵敏度较常规PCR高10~100倍。用Luminex xTAG方法和RT-qPCR方法检测209份临床样品和模拟样品,JEV、WNV、YFV、ZIKV符合率为100%。【结论】建立的四重Luminex xTAG方法具有高通量、高特异性和灵敏度、成本效益高的优点,可为虫媒病毒临床诊断和流行病学监测提供一种高通量技术手段。

中国流行性乙型脑炎病毒分子生物学特性研究

为了从分子水平了解中国流行性乙型脑炎(乙脑)病毒与国外分离株的差异,对1949年以来在中国乙脑主要流行地区分离的19株乙脑病毒的PrM C区及E蛋白基因区的核苷酸序列进行了对比研究,以期了解不同时间不同地区在中国流行的乙脑病毒的分子差异。结果显示:病毒生物学初步鉴定显示,病毒感染BHK细胞后56h所有细胞均发生病变,约50%以上细胞脱落(CPE );3日龄乳鼠接种病毒72h之内死亡;所有病毒均与乙脑病毒(A2株)抗血清发生阳性反应,但反应强度不同,提示所有病毒均为乙脑病毒。病毒PrM C(456～695)区核苷酸序列与各个国家及地区、各个基因型以及各个年代的73株乙脑病毒相应序列,用Woan RuChen建立的方法进行基因分型分析,结果显示,所有19株中国分离的病毒均属于基因型Ⅲ型,与国外相关文献所报道的乙型脑炎病毒中国分离株的基因型相符。以乙型脑炎病毒疫苗株P3株为标准,对各病毒E蛋白500个氨基酸序列进行分析。各毒株核苷酸差异在0和4 2%之间,氨基酸差异在0和4 0%之间。所有核苷酸差异均为碱基的替换,无论核苷酸或氨基酸均无插入或丢失。大多数核苷酸变异在氨基酸编码的第三位,属于沉默突变,不引起氨基酸变化。18株病毒E蛋白活性结构域与疫苗株P3株相比共有247个氨基酸的差异,平均每株病毒有12 35个氨基酸的差异,?

流行性乙型脑炎病毒(JEV)全长感染性克隆的制备及恢复病毒的获得

根据JEV病毒减毒株SA14-14-2基因组序列,设计覆盖全长的4对重叠引物,以提取的活疫苗病毒RNA为模板,RT-PCR扩增出4个片段,并克隆到质粒载体中,进一步构建两个半端分子克隆,然后将全长cDNA序列克隆到一个新改造的低拷贝质粒载体pBR-kpn中,构建我国流行性乙型脑炎病毒(JEV)基因组全长cDNA克隆。经过体外转录后得到的转录子转染BHK-21细胞,重新获得JEV的恢复病毒,通过生物学特性、分子生物学水平、蛋白水平等几个方面对恢复病毒进行鉴定。结果获得了稳定的全长cDNA克隆,转录子转染BHK-21细胞后,第4天开始出现细胞病变(CPE),第6～7天时CPE为 ,经过Vero细胞进一步放大培养后,间接免疫荧光实验和RT-PCR实验均为阳性。证实了构建的JEV的全长cDNA克隆有感染性,为进一步的研究奠定了基础。

抗流行性乙型脑炎病毒药物的研究进展

流行性乙型脑炎(Japanese Encephalitis,JE)是由黄病毒科(Flaviridae)黄病毒属(Flavivirus)流行性乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)引起的,在自然界中主要以猪为宿主,经蚊传播的一种蚊媒性人兽共患传染病。该病主要流行于亚洲及西太平洋地区,严重威胁着人类健康,已成为人类脑炎疾病最主要的病因之一,并影响养猪业的发展,引起了世界性的广泛关注,因此,流行性乙型脑炎的防治研究有着重要的实际应用意义。到目前为止,尚无治疗流行性乙型脑炎特效药面市,但对抗流行性乙型脑炎病毒药物的研究已有一定的进展,而我国在这方面的系统介绍较少,本文就近10年来抗流行性乙型脑炎药物及其作用机制的研究进展做一综述,旨在为流行性乙型脑炎的预防和治疗提供参考。

猪伪狂犬病、猪细小病毒病和猪流行性乙型脑炎检测基因芯片的制备及检测方法研究

对猪伪狂犬病(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒病(Porcine parvovirus,PPV)和猪流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis virus,JEV)检测基因芯片的制备及该芯片的检测方法进行了研究。试验克隆和鉴定了16个芯片靶基因,经筛选,取其中13个靶基因PRV gB、gG、TK和gE;PPV NS2、NS3、VP1和VP2以及JEV C、PrM/M、E、NS1和NS5制备PRV、PPV和JEV检测基因芯片,基因芯片点样系统SpotArrayTM 24将靶基因点样于氨基化玻片表面,靶基因最佳点样浓度为200 ng/μL,探针扩增标记反应体系中,Cy3-dCTP使用终浓度为2.5μmol/L,芯片杂交温度可在44℃～60℃之间任意选择。以PRRSV、CSFV、PCV1、PCV2、TGEV、HPS、PAP、E.coli和S.pp菌毒株DNA或CDNA为模板标记制备的探针均不与PRV、PPV、和JEV检测基因芯片杂交,芯片检测的灵敏度为3 pg/μL,芯片批间重复性好,同一张芯片可进行至少10次的重复杂交。该方法对8株PRV、5株PPV和JEV SA14-14-2单独或混合样品检测均为阳性,可区分伪狂犬病病毒野毒和基因缺失疫苗毒,对20份临床样品单独或混合感染的检出率分别为:单独感染PRV检出率15%(3/20),PPV 5%(1/20),JEV 0%(0/20);PRV和PPV混合感染检出率15%(3/20),PRV和JEV混合感染检出率5%(1/20),JEV和PPV混合感染检出率5%(1/20),三者混合感染的检出率5%(1/20)。与PRV、PPV和JEV多重PCR检测方法比较,芯片检测的灵敏度大大提高,同时可区分PRV野毒和基因缺失疫苗毒,对20份临床样品的检出率一致。

蝙蝠作为流行性乙型脑炎病毒宿主的研究

于 1 98 6、1 988、1 990和 1 997年的 7-8月 ,在云南省共捕获 653只蝙蝠 ,其中棕果蝠( Rousettus leschenaulti) 593只 ,金管鼻蝠( Murina aurata) 60只 ,采集血清及剖取脑组织作病毒分离和抗体检查。用细胞法和乳鼠法分离到 6株病毒 ,带毒率为 0 .96% ,其中从捕自景洪的棕果蝠脑组织中分离到 3株 ,从河口的棕果蝠血清中分离到 2株 ,从捕自耿马的金管鼻蝠脑组织中分离出 1株。棕果蝠和金管鼻蝠的带毒率分别为 0 .84%和 1 .67%。这 6株病毒能引起 C6/ 3 6和 BHK2 1细胞病变和导致乳小白鼠或 3～ 4周龄小白鼠发病和死亡 ,并具有典型的嗜神经病毒感染症状。经血凝抑制、补体结合、免疫荧光和中和试验鉴定 ,新分离的 6株病毒均为乙脑病毒 ( JE virus)。同期用血凝抑制试验对采获的 42 5份棕果蝠血清作乙脑病毒抗体检查 ,阳性 1 53份 ,阳性率为 3 6% ,具有较高的感染率。本次从棕果蝠和金管鼻蝠体内分离出乙脑病毒属具有重要流行病学意义。

开江县2002-2006年猪流行性乙型脑炎病毒感染监测

目的探讨开江县猪流行性乙型脑炎（乙脑）病毒感染强度和感染时间分布，为乙脑防制提供科学依据。方法2002-2006年6—7月上、中、下旬在开江县新宁镇肉联厂采集本地8月龄的屠宰猪血清，采用酶联免疫法（ELISA）进行乙脑抗体IgG检测，阳性计为感染猪。结果5年共采集猪血清592份，乙脑抗体阳性194份，阳性率为32．77％。2002-2006年抗体阳性率分别为43．41％、24．17％、26．89％、4．62％及75．53％，之间差异有统计学意义（X^2=137．32，P〈0．01），感染高峰时间2002-2005年在7月中、下旬，2006年在6月中旬，比前4年早30-40d。结论根据2002-2006年猪乙脑病毒感染率和感染高峰时间，可以预测人间乙脑流行强度和发病高峰时间。由此，可早期做好乙脑防制措施，控制其发病和流行。

猪流行性乙型脑炎病毒种猪精液分离株的鉴定及进化分析

利用RT-PCR技术对河南省某规模化猪场乙脑疑似病例的种猪精液进行分析,从部分样本中扩增出与流行性乙型脑炎病毒(JEV)M基因和E基因具有高度同源性的预期产物。在3日龄乳鼠脑内接种种猪精液上清,10 d左右即出现典型神经症状,并且病死鼠脑组织RT-PCR结果均为阳性。用病死鼠脑组织研磨上清接种BHK-21细胞,感染60 h后用JEV单抗进行间接免疫荧光鉴定均为阳性,这表明分离毒株均为JEV流行毒株,分别命名为BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3。对新分离毒株进行体外细胞培养,BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3连续传代3次后病毒量均获得明显增加,最高分别可达104.5±0.1TCID50/mL和104.2±0.2TCID50/mL。用生物学软件MEGA 4.0分别构建JEV基因的系统进化树,发现BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3处于同一进化分支,均属于基因Ⅲ型。

三种ELISA试剂盒检测猪流行性乙型脑炎病毒血清IgG抗体比较

目的比较国内常用商品化ELISA试剂盒检测猪流行性乙型脑炎病毒血清IgG抗体的诊断效果。方法选用3种猪乙脑病毒血清IgG抗体ELISA检测试剂盒(Keqian,Lvshiyuan,Tianchen),以微量中和试验为金标准,对90份猪血清进行检测分析。结果中和试验的阳性检出率为34.4%(31/90),Keqian,Lvshiyuan和Tianchen阳性检出率分别为50.0%(45/90),47.8%(43/90)和38.9%(35/90)。灵敏度最高的是Keqian,为90.32%,但其特异度只有71.19%;Tianchen的灵敏度和特异度分别为83.87%和79.66%;Lvshiyuan的灵敏度和特异度分别仅为41.94%和16.95%。与中和试验比较,Tianchen试剂盒的κ系数最高为0.63,其次是Keqian为0.57,Lvshiyuan仅为0.04。显示3种试剂盒具稳定性。结论目前国内商品化猪乙脑病毒血清IgG抗体ELISA检测试剂盒诊断结果差异较大,与中和试验相比存在较高的假阴性,质量有待提高。

伪狂犬病病毒、猪细小病毒和流行性乙型脑炎病毒检测基因芯片的制备

对伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和流行性乙型脑炎病毒(JEV)检测基因芯片的制备及该芯片的检测技术进行了研究。选定靶基因最佳点样质量浓度为200 mg/L,用基因芯片点样仪将其点制在氨基化基片上,经干燥、水合、紫外线交联和洗涤后,成功制备了PRV-PPV-JEV检测基因芯片。以CY3荧光素标记的dCTP经PCR扩增制备探针,对芯片的质量进行了评价。结果表明,制备的芯片质量好,探针最佳使用质量浓度为3 000μg/L,芯片系统检测灵敏度可达3μg/L。该芯片可同时检测PRV、PPV和JEV,其灵敏度高、特异性强,芯片可重复使用,室温下至少可保存4个月。

中国首次分离的二株基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒全基因组序列分析（英文）

目的分析中国首次分离的基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒(JEV)全基因组的基因组特征。方法设计JEV全基因组扩增引物,RT-PCR扩增片断,PCR产物直接测序,拼接后获得全基因组序列。采用生物学软件进行同源性和系统进化分析。结果 1977和1982年分离自云南蚊虫的M28和BN82215病毒株基因组全长分别为10 969bp和10 970bp,5′非编码区均含有96个核苷酸,3′非编码区含有573和574个核苷酸。它们的开放阅读框(ORF)都从97到10 396位,共10 299个核苷酸,编码3 433个氨基酸。M28和BN82215株与来自GenBank的5个基因型JEV株的全基因组核苷酸和氨基酸同源性分别为78.4%~96.3%和91.4%~99.6%,与近几年国内外基因Ⅰ型流行株的同源性最高,进化关系最接近,都属于基因Ⅰ型。这两株病毒与JEV疫苗株SA14-14-2相比,有56个氨基酸差异,其中E基因有11个氨基酸差异,但都不属抗原关键位点。结论本研究阐明了中国首次分离的基因Ⅰ型JEV的全基因组分子特征,决定病毒抗原和毒力的E蛋白关键位点无明显变化。证实20世纪70和80年代云南省就有基因Ⅰ型JEV流行。

干扰素对流行性乙型脑炎病毒的抑制作用

目的：研究干扰素对流行性乙型脑炎病毒的抑制作用，为临床应用提供理论依据。方法：运用病毒滴定法，在培养病毒增殖系中投入干扰素（IFN），观察其对病毒增殖的影响。结果：用IEN300IU·ml-1处理后病毒产生量在人肝癌细胞HepG2和人神经母细胞瘤细胞株IMR-32中分别为对照的14％和1．6％。结论：IFN对乙脑病毒的增殖有显著阻碍作用。

广东和广西部分地区蝙蝠携带登革病毒及流行性乙型脑炎病毒的调查研究

目的了解广东及广西蝙蝠携带登革病毒和流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的情况。方法2004年9月至2005年11月期间11次收集广东及广西部分地区的蝙蝠。收集的蝙蝠取脑组织标本和血清标本,采用两对登革病毒和乙脑病毒通用引物,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和细胞培养分离方法检测所采集蝙蝠标本中的登革病毒(denguevirus,DV)和乙脑病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV)。结果收集了4个科9个种共905只蝙蝠,其中棕果蝠154只、犬蝠395只、普通长翼蝠5只、小黄蝠52只、中菊头蝠228只、中华菊头蝠15只、小菊头蝠41只、双色蹄蝠8只、普氏蹄蝠7只。蝙蝠来源于粤中、粤西和桂东的7个县市。905只蝙蝠标本中未检测、分离到登革病毒和乙型脑炎病毒。结论未发现所调查的蝙蝠携带登革病毒和乙型脑炎病毒。

珠海地区蚊媒携带流行性乙型脑炎病毒的研究

目的了解珠海地区蚊媒携带流行性乙型脑炎(乙脑)病毒情况,为控制乙脑在人群中的流行提供依据。方法采集成蚊进行鉴定,并对蚊悬液采用细胞培养、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及荧光定量PCR技术进行病毒鉴定,并进行克隆与序列测定。结果2005年全年在养猪场共捕获成蚊876只,经鉴定隶属4属8种,其中以三带喙库蚊(35.73%)、致倦库蚊(32.54%)和海滨库蚊(21.35%)为主。在珠海各口岸捕获的542只蚊样本中,则以白纹伊蚊为主,占82.47%,其次为致倦库蚊,占16.25%。应用荧光定量PCR技术,在珠海地区注册养猪场和口岸的蚊媒中检出1份乙脑病毒阳性样本,但强度较弱,这与珠海地区是乙脑低发地区相一致。结论珠海地区存在乙脑的主要传播媒介,并且在蚊媒中携带有乙脑病毒,提示不能放松对乙脑的防控工作。

流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白基因在原核细胞中的高效表达及其表达产物的抗原性分析

目的 获得JEVE蛋白基因并使其在E coli中高效表达 ,以研究其抗原活性 ,为进一步研制ELISA早期诊断试剂盒奠定基础。方法 根据已发表的JEVSA - 14 - 14 - 2减毒株序列 ,设计一对特异性引物 ,通过RT -PCR扩增出E蛋白基因的cDNA片段 ,并将其克隆入 pET - 32a(+)表达载体中 ,构建重组融合表达载体pET -E ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)后 ,利用IPTG诱导获得高效表达。结果 扩增的E蛋白基因片段长 1113bp ,编码 371个氨基酸残基 ,该基因片段与国内发表的减毒株SA14 - 14 - 2碱基序列同源性为 10 0 %。表达产物分子量约为 6 2kD ,经Westernblotting分析表明表达产物具有较好的抗原性。结论 通过序列分析表明 ,我国的JEVSA - 14 - 14 - 2减毒株未发生基因突变。表达产物的稳定高效表达及其抗原特异性分析为今后ELISA早期诊断试剂盒的研制提供了依据。

流行性乙型脑炎病毒研究进展

流行性乙型脑炎病死率较高,后遗症严重,在亚洲地区危害较大。本文就乙脑病毒的分类、抗原特性、对细胞和动物敏感性、基因组的结构特征、毒力基因、基因分型和疫苗等方面的研究进展作一综述。

流行性乙型脑炎病毒一步法RT-LAMP检测方法的建立

为建立一种简便、快速、灵敏、特异的乙型脑炎病毒(JEV)检测方法,本研究根据GenBank中登录的25株流行性JEV基因组序列,设计3对特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,优化反应体系,建立了一步法反转录-LAMP(RT-LAMP)检测方法。该方法检测时间短,灵敏度比常规RT-PCR方法高,可检测出103TCID50/0.2mL JEV;特异性强,对猪细小病毒、猪圆环病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒等常见猪病毒均无交叉反应。结果判定时只需要在扩增产物中加入SYBR GreenⅠ染料,就可以直接在可见光或紫外光下观察颜色变化。该方法简便快捷,省时省力,是一种适用于基层实验室快速、准确检测流行性JEV的方法。

流行性乙型脑炎病毒E蛋白多表位肽在毕赤酵母中分泌表达及其免疫原性研究

为构建流行性乙型脑炎病毒（JEV） E蛋白多表位疫苗，本研究将人工合成的优化后E蛋白多表位肽（MP）序列克隆于酵母表达载体pPICZα-A中，构建分泌型重组酵母表达质粒pPICZ-MP后电转化导于毕赤酵母X-33中，重组酵母菌组子经甲醇诱导表达重组蛋白（rMP）。将其免疫小鼠后，通过测定rMP免疫小鼠的抗体水平、抗体亚型、中和抗体和CTL，以评价该多表位疫苗在小鼠模型的免疫原性。结果显示正确构建了表达JEV E蛋白多表位抗原的重组酵母菌株X33 （pPICZ -MP），并分泌表达多表位肽rMP ；纯化后的rMP免疫小鼠产生了较强的体液免疫和细胞免疫反应，其中和抗体水平、CTL活性均与活病毒疫苗组无显著差异（p〉0.05），而且能保护小鼠免受致死量JEV的攻击。上述结果表明本研究以酵母菌表达的JEV E蛋白多表位疫苗具有良好的的免疫原性，能够刺激小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答反应，为流行性乙型脑炎多表位疫苗研制提供了新的思路。

流行性乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原域的原核表达与间接ELISA检测方法的初步建立

重组质粒pET-E转化宿主菌BL21,经1.0mmol/LIPTG诱导,外源基因以包含体的形式获得高效表达。通过Westernblotting检测证明表达产物具有良好的抗原性。以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测JEV抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原的最佳稀释度为1:2000,血清的最佳稀释度为1:200,待检血清阳性标准初步定为:OD490nm>1.2,且待检血清与阴性血清的OD490nm比值大于2。

流行性乙型脑炎病毒GI型毒株SD12在C57BL/6小鼠体内的动态分布研究

为了解流行性乙型脑炎病毒基因I型毒株SD12在感染C57BL/6小鼠体内的病毒分布,应用qRT-PCR方法检测该毒株在小鼠体内各组织的动态分布情况。结果显示腹腔感染组中2 dpi仅能在心脏和脾脏检测出病毒核酸,5~7 dpi能够在心脏、肝脏、脑部、盲肠和扁桃体检测到病毒核酸。血脑屏障受损的腹腔感染组中最早2 dpi在肠系膜淋巴结中检测到病毒核酸,3 dpi基本能在各组织中检测到病毒核酸,5~7 dpi在大脑中检测到大量病毒核酸。所有对照组没有检测到病毒阳性核酸。本研究表明基因I型流行性乙型脑炎病毒感染血脑屏障受损的C57BL/6小鼠后能迅速入侵各组织脏器,主要浸染肝脏、肺脏、肾脏、盲肠和大脑。拥有完整血脑屏障的小鼠对病毒具有一定抵抗能力,病毒在各组织中的含量相对比较低。