鹿流行性出血病毒分子生物学研究进展

鹿流行性出血病毒是一种在全世界野生及驯养的有蹄动物中广泛存在的重要病原体。该病毒属呼肠病毒科环状病毒属,有12个血清型,是一种有10个节段(L1-L3、M4-M6、S7-S10)的双链RNA病毒,编码10个蛋白(VP1-7和NS1、NS2、NS3/NS3A)。VP7蛋白具有很强的抗原性且保守性最高。VP2与病毒型特异性有关,可诱导产生中和抗体。VP3为群特异性抗原,高度保守,具有亲水性保守区域。非结构蛋白NS1、NS2和NS3/NS3A及其编码序列均相当保守。该病毒的分子生物学诊断技术主要有PCR和核酸探针杂交技术。

小盾纤恙螨自然感染流行性出血热病毒经期传播及其体内增殖的初步观察

为探讨小盾纤恙螨在ＥＨＦＶ传播中的媒介意义，观察了在该螨中ＥＨＦＶ经期传播的直接证据和能否在螨体内增殖。方法是将螨幼虫、若虫分批进行ＥＨＦＶ分离，测定病毒的ＴＣＩＤ（５０）／ｍｌ滴度。结果在该螨幼虫期和若虫期均分离到ＥＨＦＶ，但在幼虫演变到若虫前４０天左右，ＥＨＦＶ可在其体内消失，以后再度出现；病毒滴度在幼虫期逐渐下降，随后再度上升。结果证明ＥＨＦＶ可经期传播，并在螨体内有增殖的现象。

广东一株牛源流行性出血病病毒的分离鉴定

为了解广东反刍动物流行性出血病(EHD)的感染情况,本研究对采集的牛血液样品进行EHD病毒(EHDV)的RT-PCR检测,对核酸检测为阳性的样品进行病毒分离鉴定。将阳性样品接种BHK-21细胞连续传3代时出现细胞病变,扩增出了VP7基因,进行BLAST序列比对,结果表明该分离株与国内外EHDV分离株的同源性达98%~100%,TCID_(50)为10^(-6.5)/50μL,不能凝集鸡红细胞,表明该分离株为EHDV,命名为GD-N133。根据VP2基因序列的分析和微量中和试验结果,确定该病毒株为EHDV-1型。

广西首例牛源鹿流行性出血热病毒的分离鉴定

为了解广西反刍动物鹿流行性出血热病毒(EHDV)的感染情况,本研究在广西马山县设立牛羊虫媒病监控点,筛选EHDV抗体阴性的10头牛和5只羊作为哨兵动物,分别混养在EHDV抗体阳性的牛群及羊群中,采取白天放牧,夜间赶回栏舍的方式饲养。采用竞争性ELISA全年监测其抗体转阳情况,取抗体阳转动物的红细胞,接种BHK-21细胞分离EHDV。以RT-PCR、病毒中和试验等对分离株进行鉴定,结果在3头哨兵牛EHDV抗体转阳前后的7份抗凝血中分离到3株病毒,TCID50分别为102.5/0.1 m L、102.83/0.1 m L和102.5/0.1 m L,血清型均为EHDV-5型。该结果为首次在广西牛群中分离到EHDV,表明广西反刍动物存在EHDV感染。本研究为国家监测反刍动物重要虫媒病毒病流行情况和疫病风险分析提供了有价值的参考资料。

流行性出血病病毒(EHDV)血清7型毒株在中国的首次分离与鉴定

流行性出血病(EHD)是由流行性出血病病毒(EHDV)感染反刍动物引起的一种虫媒病毒病,为了解中国云南EHDV的感染情况和病毒遗传特征,笔者课题组在云南省师宗县以EHDV血清学和核酸阴性的牛、羊为哨兵动物,拟对流行于云南省的EHDV进行分离与鉴定。将采集于哨兵动物的EHDV核酸阳性血液接种BHK-21细胞进行病毒分离;通过血清中和试验与病毒Seg-2、Seg-3 ORF区的序列分析,确定病毒的血清型与遗传特征;采用C-ELISA和qRT-PCR方法对EHDV感染动物血液中的抗体水平与病毒核酸进行监测。结果如下:从2013年8月采集自云南师宗县哨兵牛的血样中分离出一株EHDV(毒株号YNSZ/V269/2013),血清中和试验结果表明分离的病毒为血清型7型(EHDV-7);Seg-2、Seg-3序列分析表明分离的病毒属EHDV-7 Eastern型,与日本毒株和澳大利亚EHDV-7型毒株具有最近的亲缘关系。哨兵动物病毒核酸转阳后,血清抗体迅速上升,3周后达最高点并能在该水平持续较长时间,而病毒核酸含量却迅速下降,7周后已经检测不到。本研究首次报道了EHDV-7型毒株在中国的分离、毒株序列特征以及在动物上的感染特性。研究结果可为进一步开展中国EHDV-7型病毒的全基因组测序、流行病学调查、诊断方法的建立和致病性等相关研究提供基础。

血清6型流行性出血病病毒在我国云南的首次分离与鉴定

为对流行于我国云南省的流行性出血病病毒(EHDV)进行分离与鉴定,以掌握我国流行EHDV的遗传特征与感染特性,本研究将2012年8月采集于哨兵牛的EHDV核酸阳性血液接种BHK-21细胞以分离病毒;通过血清中和试验与分离病毒的Seg-2、Seg-3基因测序分析,确定病毒的血清型与遗传特征;采用C-ELISA和荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法对EHDV感染哨兵牛血清中的抗体水平与血液中病毒核酸进行动态监测。结果显示,经BHK-21细胞分离出一株EHDV(YNSZ/V003/2012),血清中和试验显示分离病毒属于EHDV-6型。病毒Seg-2、Seg-3基因序列分析显示YNSZ/V003/2012血清型为EHDV-6型,地域型为东方型,与日本EHDV-6亲缘关系最近。哨兵牛感染该病毒后,血清中的特异性抗体迅速上升,感染3周后抗体达最高点并能够在该水平维持较长时间,而血液中病毒核酸含量则呈迅速下降趋势,感染7周后已经检测不到病毒核酸。本研究首次报道了EHDV-6型病毒株在我国云南的分离、序列特征以及在动物中的感染特性,为进一步开展EHDV-6型的流行病学调查和致病性等相关研究奠定了基础。

流行性出血病病毒血清分型RT-PCR方法的建立及应用

以决定流行性出血病病毒(EHDV)血清型的第二基因节段(Seg-2)为检测靶基因,设计7对特异性引物,建立用于鉴定EHDV血清型的RT-PCR检测方法,并通过对扩增产物的测序,进一步了解病毒Seg-2的遗传特性。特异性试验结果显示,该检测方法可准确鉴定不同血清型的EHDV毒株,与蓝舌病病毒、中山病病毒、阿卡斑病毒均无交叉反应;灵敏度试验结果显示,对不同血清型EHDV核酸的检测下限均可达102拷贝;对我国不同时间与不同地域分离的EHDV毒株进行血清型RT-PCR鉴定,结果显示分离的31株EHDV分属EHDV-1、-5、-6、-7与-10型等5种血清型,与血清中和试验的鉴定结果完全吻合。以上结果表明,该方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,可快速准确地鉴定EHDV毒株的血清型。

鹿流行性出血病病毒VP7基因的克隆及原核表达

根据已经扩增的鹿流行性出血病病毒(EHDV)VP7基因序列,设计一对扩增VP7基因特异性引物,用RT-PCR从血清I型EHDV(EHDV-1)总RNA中扩增VP7基因,并将其克隆到原核表达载体pBAD/Thio中,构建了重组原核表达质粒pBAD/Thio-EHDV VP7。将表达载体转入大肠埃希菌(E.coliLMG194),用L-阿拉伯糖诱导表达。SDS-PAGE和Western blot试验结果表明,EHDV VP7基因在LMG194中得到了表达,其表达产物可以与EHDV阳性血清特异性反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性。

流行性出血热病毒经人体胎盘传播及其在人胎部份脏器定位的研究

应用 Vero—E6细胞,从一例患流行性出血热（EHF）孕妇流产胎儿的肝、肾、肺三种脏器中分离出病毒,经鉴定证实为 EHF 病毒,同时发现相应脏器有明显的病理改变。以上表明 EHF 病毒可经胎盘感染胎儿,定位于胎儿的肝、肾、肺脏,并可直接造成病理损害。

流行性出血热病毒抗体IgM对流行性出血热的诊断意义

目的探讨流行性出血热病毒IgM抗体对流行性出血热确诊的临床意义。方法收集临床疑似流行性出血热(epidemic hemorrhagic fever,EHF)患者血清185例,正常人血清30例,进行流行性出血热病毒抗体IgM(EHF-IgM)酶联免疫吸附试验,并对该试验进行灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值和诊断有效率分析。结果(1)185例样本共检出36例EHF-IgM抗体阳性,其中35例最后确诊为流行性出血热,1例确诊为登革热;检出149例EHF-IgM抗体阴性,其中8例临床确诊为流行性出血热,其余141例经临床观察,排除流行性出血热。30例正常人血清EHF-IgM抗体均为阴性。(2)EHF-IgM抗体灵敏度为81.40%、特异性为99.30%、阳性预测值为97.22%、阴性预测值为94.63%诊断有效率为95.14%。结论酶联免疫吸附试验检测流行性出血热IgM抗体,操作简便快速,灵敏度较高,特异性强,可为临床早期诊断提供依据。

鹿流行性出血病病毒高通量液相芯片检测方法的建立

为建立可检测鹿流行性出血病病毒(EHDV)的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中EHDV的VP7基因进行序列分析,设计EHDV特异性探针并用生物素标记,与荧光编码微球偶联后与病毒VP7基因的PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪(Liquichip200)检测荧光信号建立了EHDV快速高通量液相芯片检测方法。检测结果显示,该法具有较好的特异性,不与其他虫媒病病毒反应;检测灵敏度为100个TCID50。建立了快速检测EHDV的液相芯片技术,为进一步搭建EHDV快速高通量检测平台奠定了基础。

鹿流行性出血病病毒VP7-ELISA抗体检测方法的建立

以原核表达的鹿流行性出血病病毒(epizootic hemorrhagic disease virus of deer,EHDV)VP7蛋白为包被抗原,用HRP标记的兔抗羊IgG作为二抗,建立了检测EHDV群特异性抗体的间接ELISA方法(VP7-ELISA)。用VP7-ELISA方法检测EHDV阳性血清、其他病毒阳性血清及健康羊血清,结果表明,VP7-ELISA方法具有良好的特异性;用VP7-ELISA和琼脂扩散试验(AGID)检测EHDV阳性血清抗体效价,结果表明,VP7-ELISA的敏感性相当于AGID的8～16倍。用VP7-ELISA和AGID同时检测临床样品188份,VP7-ELISA的特异性和敏感性分别为95.9%和100%,两种方法的符合率为96.3%。表明VP7-ELISA可以代替AGID用于EHDV抗体检测。

鹿流行性出血病病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为了更好的研究鹿流行性出血病病毒(EHDV)的生物学特性和建立EHDV免疫学检测方法,本研究用纯化的EHDV免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选,有限稀释法克隆,获得了2株(1A5和8H6)能够稳定分泌抗EHDV单抗的杂交瘤细胞株。其细胞培养上清效价分别为1∶256和1∶512,腹水效价分别为1∶1024000和1∶2048000;McAb 1 A5和8H6的相对亲和力分别为0.9mg/L和0.7mg/L。间接ELISA结果显示,2株单抗仅与EHDV反应,不与蓝舌病病毒、赤羽病病毒、水疱性口炎病毒、小反刍兽疫病毒和BHK细胞反应,表明2株单抗特异性良好。这2株单抗的获得为研究EHDV生物学特性和建立EHDV检测方法奠定了基础。

流行性出血热病毒的细胞培养

用灭活的流行性出血热病毒 (EHFV) L99株感染传代培养的 Vero- E6细胞 ,第 4 d5 0 %的Vero- E6细胞胞浆内可查到对 EHFV鼠血清的特异性荧光 ,第 7～ 10 d阳性细胞数达到 10 0 %.用感染第 3d的细胞培养上清大批量盲种 ,第 7～ 10 d荧光强度均达到 + + + + .电镜下病毒呈圆形或卵圆形 ,外膜为电子致密层 ,界面清楚 ,包绕着比较疏松的内浆 ,内浆中有若干个颗粒丝状结构 .

应用逆转录酶链反应对我国流行性出血热病毒分型

针对我国流行性出血热病毒的S片段核蛋白 (NP)编码基因保守核苷酸序列 ,合成了一对引物 ,扩增出编码核蛋白的 5 90bp碱基。扩增的II型产物存在限制性内切酶PstI的酶切位点 ,而I型产物不存在。因此 ,用酶切扩增产物的方法达到病毒分型的目的。试验提取 8份鼠脑传代毒种 ,1份细胞培养物和 2 5份病人血清中的出血热病毒RNA ,同时做 6份正常人血清对照 ,经逆转录PCR酶切分型。试验结果同间接免疫荧光技术 (IFA)分型结果相一致 ,可特异地对我国流行性出血热病毒进行分型。

流行性出血热病毒在疫区黑线姬鼠中垂直传播的研究

从 EHF 疫区捕获黑线姬鼠的2只孕鼠及其4只胎鼠和2窝乳鼠体内,用 IF 法检出了 EHF 抗原及抗体,并从胎鼠的脑、肺、肝组织中分离出 EHFV,从而首次证实了垂直传播在疫区宿主动物间是存在的。且此种传播主要是通过胎盘感染所致,可能是疫源地延续的重要原因之一。

应用PCR技术检测鹿流行性出血病病毒

对PCR (包括PCR/化学发光杂交检测、抗体亲和捕获套式PCR检测、原位PCR检测、PCR/RFLP检测 )检测在最近几年鹿流行性出血病病毒 (EHDV ,包括EHDV 1 ,EHDV 2等 )临床诊断的应用和研究成果进行了论述 ,认为该技术为EHD的诊断、流行病学调查、疫情监控及防制等提供了一种更灵敏。

广西鹿流行性出血热病毒血清型调查及分布影响分析

2014年采集广西5市7县7个养殖场313份牛血清,经cELISA检测随机筛选出100份鹿流行性出血热病毒(EHDV)血清强阳性样品(cut-off值>70%)进行微量细胞中和试验,以调查广西EHDV血清型的存在情况,以及分析其地理分布的影响因素,为丰富EHDV流行病学数据,进一步做好EHDV的综合防制提供依据。

大理州流行性出血热病毒在啮齿动物中自然感染调查

目的：对大理州流行性出血热病毒在啮齿动物中自然感染现状进行调查，为制定防治措施提供依据。方法：用直接免疫荧光法查检鼠肺中的病毒抗原。结果：大理市、祥云县、剑川县及洱源县流行性出血热病毒在啮齿动物中总阳性率分别为：８．５１％（８／９４），２．７５％（６／２１８），ｌ．８２％（２／１１０）和３．０６％（３／９８）。结论：大理州可能存在着２型以上的汉坦病毒在鼠间循环，应采取相应的防治措施。

流行性出血热病毒结构蛋白的比较研究

EHFV标准株A9,R22和鲁宁-84刘、鲁宁-84肖、R-36的Vero E6细胞培养液经蔗糖密度梯度离心和免疫沉淀后进行SDS-PAGE,结果均存在NP、G_2和G_1 3种结构蛋白,但不同型别EHFV的结构蛋白分子量略有差异,经Western-blot分析发现5株EHFV的NP至少存在50,49和52kd 3种分子量,同时发现R-36株NP与抗姬鼠型和家鼠型EHFV-NP的McAb均有较强反应,证明属于混合型。