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焦磷酸测序中PCR引物与测序引物的设计 被引量:8
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作者 叶卉 刘云龙 +2 位作者 邹秉杰 武海萍 周国华 《分析化学》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2013年第5期744-748,共5页
利用焦磷酸测序技术进行核酸序列测定时,测序信号过低或非特异性信号过高均会导致测序失败。因此,PCR引物与测序引物的设计十分重要。本研究以rs8175347为例,通过设计具有不同多聚酶亲和指数(PPI)的PCR引物,并运用焦磷酸测序测定其扩增... 利用焦磷酸测序技术进行核酸序列测定时,测序信号过低或非特异性信号过高均会导致测序失败。因此,PCR引物与测序引物的设计十分重要。本研究以rs8175347为例,通过设计具有不同多聚酶亲和指数(PPI)的PCR引物,并运用焦磷酸测序测定其扩增产物,考察了PPI值对扩增效率以及测序信号的影响;以rs914232、rs671位点为例,对比不同测序方向以及dNTP的推注顺序,考察了两者对测序结果的影响。结果表明,提高PCR引物的PPI值有助于增强扩增效率与测序结果的信号峰强度,测序方向和dNTP推注顺序的不合理选择会严重干扰部分SNP测序结果的判断。因此,在设计PCR引物时,应将多聚酶亲和指数理论与传统基于解链温度值的引物设计思路相结合,为焦磷酸测序提供高质量的测序模板;在进行定量测序时,还要综合考虑待测位点(SNP)两侧的序列,选择合适的测序方向以及dNTP的推注顺序,使测序结果更加准确。 展开更多
关键词 焦磷酸 PCR引物 测序引物
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双歧杆菌属特异性测序引物筛选及优化 被引量:8
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作者 郑慧娟 白晓晔 +2 位作者 高旭 孙志宏 张和平 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1736-1747,共12页
【背景】目前双歧杆菌的益生功能被普遍认可,越来越多的研究开始关注肠道中双歧杆菌的生物多样性。然而双歧杆菌是肠道中的低丰度物种,现有技术尚难以深入研究其多样性。【目的】基于双歧杆菌16SrRNA基因序列筛选一对适用于分析粪便样... 【背景】目前双歧杆菌的益生功能被普遍认可,越来越多的研究开始关注肠道中双歧杆菌的生物多样性。然而双歧杆菌是肠道中的低丰度物种,现有技术尚难以深入研究其多样性。【目的】基于双歧杆菌16SrRNA基因序列筛选一对适用于分析粪便样品中低丰度双歧杆菌属多样性的特异性引物。【方法】依据已有引物的相对位置及其与双歧杆菌属16S rRNA基因序列的匹配率,将引物重组优化得到扩增片段>800 bp的双歧杆菌属特异性引物;通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳对引物进行实验筛选和特异性验证;以细菌通用引物(27f/1492r)为参照,通过单分子实时(Single-molecule real-time,SMRT)测序技术对不同引物的3份粪便样品中细菌的DNA扩增子进行测序,在种水平上分析比较不同引物的优劣。【结果】对文献中已有的9对双歧杆菌特异性引物进行重组并优化,其中2对引物的理论特异性较好且扩增产物大于800 bp,它们分别为Bif164-f/Pbi R2和Pbi F1/Pbi R2。PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验发现,Bif164-f/Pbi R2的扩增条带明亮且无拖尾。此外,利用SMRT测序平台对引物27f/1492r和Bif164-f/Pbi R2的3份粪便样品中细菌的DNA扩增子进行测序并分析。27f/1492r扩增子的分析结果显示,3份样品依次分别含1、3、4个双歧杆菌种且双歧杆菌的平均相对含量为0.34%;而Bif164-f/Pbi R2扩增子的分析结果显示,3份样品依次分别含2、6和8个双歧杆菌种且双歧杆菌的平均相对含量为98.72%。上述结果表明,Bif164-f/Pbi R2可在种水平上特异地检出粪便中低丰度的双歧杆菌,进而实现样品中双歧杆菌的多样性分析。【结论】筛选出一对双歧杆菌特异性引物Bif164-f/PbiR2,可在种水平上分析粪便样品中低丰度双歧杆菌的生物多样性,同时也验证了理论结合实验进行引物筛选这种方法的可行性。 展开更多
关键词 双歧杆菌 特异性 测序引物 单分子实时
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一管式多引物焦磷酸测序技术在HPV分型检测中的应用
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作者 钟丹 薛群 王淑一 《检验医学与临床》 CAS 2014年第3期334-336,共3页
目的探讨一管式多引物焦磷酸测序技术在人类乳头瘤病毒(HPV)分型检测中的临床应用价值。方法设计针对7个不同HPV亚型的高度特异性测序引物,采用一管式多引物测序法,通过半巢式聚合酶链反应(PCR)扩增获得HPV基因片段,并进行焦磷酸测序分... 目的探讨一管式多引物焦磷酸测序技术在人类乳头瘤病毒(HPV)分型检测中的临床应用价值。方法设计针对7个不同HPV亚型的高度特异性测序引物,采用一管式多引物测序法,通过半巢式聚合酶链反应(PCR)扩增获得HPV基因片段,并进行焦磷酸测序分析。结果通过半巢式PCR扩增和一管式多引物焦磷酸测序,成功区分了7种不同的HPV亚型,且测序结果与PCR-反向点杂交法检测结果的符合率是100%。结论一管式多引物焦磷酸测序技术是一种简便、高效、高通量、高灵敏度、高准确度的HPV分型检测方法,值得推广应用。 展开更多
关键词 基因分型 人类乳头瘤病毒 一管式多引物 焦磷酸
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直接测序法用于四川骨髓库汉族人群HLA-C等位基因分布的研究 被引量:16
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作者 夏玲 王珏 +4 位作者 罗玫 纪欣 杨刘 陈雪黎 陈强 《中国输血杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期596-601,共6页
目的建立HLA-C等位基因通用引物直接测序法,研究中华骨髓库四川分库(简称四川骨髓库)中川籍汉族人群HLA-C等位基因分布。方法在四川骨髓库已获HLA-A/B/DRB1高分辨分型结果的600余份川籍汉族街头无关自愿捐献者标本中,随机选择244份标本... 目的建立HLA-C等位基因通用引物直接测序法,研究中华骨髓库四川分库(简称四川骨髓库)中川籍汉族人群HLA-C等位基因分布。方法在四川骨髓库已获HLA-A/B/DRB1高分辨分型结果的600余份川籍汉族街头无关自愿捐献者标本中,随机选择244份标本,采用PCR-SBT对HLA-C位点测序分型,通用引物测序后产生的模棱两可分型结果,分别采用加测相应外显子和组特异性测序方法确认;获得所有标本确切的高分结果后,计算HLA-C各等位基因分布频率,并与其他人群比较。结果 244份标本中直接出HLA-C位点高分辨结果的比例为27.87%(68/244),须加测外显子1、5、6和7的为61.07%(149/244),须组特异性测序的为47.54%(116/244);共检出HLA-C等位基因25个,其中等位基因频率>10%的3个:C*01∶02、C*07∶02和C*03∶04,等位基因频率>1%的12个,累计频率95.69%;四川汉族人群HLA-C等位基因的分布与中国南方人群最为接近,与美国高加索人群和黑人的差异最大。另外,发现了1例新等位基因C*06∶45,它与同源性最高的C*06∶02在第187位碱基存在1个点突变:G>T,使密码子39由GAC>TAC,导致编码的氨基酸由天门冬氨酸(Asp)>酪氨酸(Tyr);此位点在此之前尚未发现过碱基突变。结论建立了针对HLA-C基因第2—4外显子的通用引物直接测序法,并提出了模棱两可结果的解决策略,所测标本均获得确切高分结果;四川汉族人群中HLA-C等位基因呈现多样性并存在自身特点。 展开更多
关键词 HLA-C等位基因 四川汉族 中华骨髓库 直接 通用引物 组特异性 C^*06∶45 新等位基因
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应用三引物荧光PCR-Sanger测序法检测FMR1全突变者和前突变携带者 被引量:8
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作者 沙莎 贺学 +2 位作者 袁东亚 张建芳 康龙丽 《中华医学遗传学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期844-848,共5页
目的检测脆性X综合征患者或携带者FMR1基因5′非编码区CGG序列的重复数。方法应用三引物荧光PCR-Sanger测序法检测一例男性脆性X综合征疑似患者和一名外表正常孕妇及胎儿羊水样本,并选择阳性对照和阴性对照进行可靠性验证。结果三引物... 目的检测脆性X综合征患者或携带者FMR1基因5′非编码区CGG序列的重复数。方法应用三引物荧光PCR-Sanger测序法检测一例男性脆性X综合征疑似患者和一名外表正常孕妇及胎儿羊水样本,并选择阳性对照和阴性对照进行可靠性验证。结果三引物荧光PCR-Sanger测序法可准确检出阴性及阳性对照的FMR1基因CGG的重复数。男性受检者CGG的重复数大于200,判断为全突变患者;孕妇CGG重复数为35和115,判断为杂合型前突变携带者;胎儿羊水CGG的重复数大于200,判断为男性全突变胎儿。经家属知情同意,对流产胎儿进行检测,证实了上述产前诊断结果。结论三引物荧光PCR-Sanger测序法可作为基层常规临床检测脆性x综合征患者/前突变携带者FMR1基因CGG重复数的快捷有效可靠方法,同时也适合在基层实验室用于大规模筛查前突变携带者候选人群。 展开更多
关键词 脆性X综合征 引物荧光PCR-Sanger FMR1基因 前突变 全突变
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DNA测序新策略——引物岛测序
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作者 冯雪松 《临床检验信息导报》 1997年第3期80-80,83,共2页
关键词 DNA 引物
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人类白细胞抗原A、B和DRB1测序分型模棱两可结果的分布及解决 被引量:2
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作者 李恒聪 裴永峰 +1 位作者 黄惠妮 吴国光 《重庆医学》 CAS 北大核心 2017年第13期1759-1761,共3页
目的调查广西人群HLA-A、B、DRB1基因测序分型中模棱两可结果的分布状况,提出解决方案。方法采用聚合酶链反应-直接测序分型方法对1 000名中华骨髓库广西分库供者的HLA-A、B、DRB1基因进行测序分型,分析3个基因座模棱两可分型结果的分... 目的调查广西人群HLA-A、B、DRB1基因测序分型中模棱两可结果的分布状况,提出解决方案。方法采用聚合酶链反应-直接测序分型方法对1 000名中华骨髓库广西分库供者的HLA-A、B、DRB1基因进行测序分型,分析3个基因座模棱两可分型结果的分布情况,并分别采用高分辨聚合酶链反应-序列特异性引物法和组特异性测序引物法进行解决。结果 1 000份标本中,96.7%的标本HLA-A、B、DRB1基因至少有1个位点出现模棱两可结果,其中HLA-A、B、DRB1各位点出现模棱两可结果的比例分别为65.7%、58.8%、77.2%。对于检出的模棱两可结果标本,单独采用组特异性测序引物法可以解决87.37%HLA-A、93.54%HLA-B和60.49%的HLA-DRB1基因模棱两可分型结果,使用高分辨聚合酶链反应-序列特异性引物法解决12.63%HLA-A、4.76%HLA-B和15.29%HLA-DRB1基因模棱两可分型结果,剩余1.70%HLA-B和24.22%的HLA-DRB1基因模棱两可分型结果联合使用组特异性测序引物法和高分辨聚合酶链反应-序列特异性引物法解决。结论组特异性测序引物法和高分辨聚合酶链反应-序列特异性引物法分别对位于HLA-A、B和HLA-DRB1基因检测区内、外的模棱两可分型结果具有较高的解决能力,二者互为补充,可有效解决HLA高分辨基因分型结果模棱两可问题。 展开更多
关键词 人类白细胞抗原 模棱两可 高分辨聚合酶链反应-列特异性引物 组特异性测序引物
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Detecting Factor Ⅺ Deficiency in Holstein Cattle Using PCR Analysis
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作者 张科 王占彬 王清义 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2010年第5期109-111,共3页
[Objective] This study established a method to detect Factor Ⅺ by polymerase chain reaction analysis.[Method]A pair of primers was designed and synthesized according to sequences of FⅪ gene in Holstein calves,publis... [Objective] This study established a method to detect Factor Ⅺ by polymerase chain reaction analysis.[Method]A pair of primers was designed and synthesized according to sequences of FⅪ gene in Holstein calves,published in Genbank. Polymerase chain reaction was used to analyze FⅪ deficiency of 576 Holstein calves in Henan,and the result was verified by DNA sequencing. [Result] We detect 576 cows,which include two carriers and one F Ⅺ deficiency,and the result was consistent with the DNA sequencing. The frequency of the FⅪ mutant allele was 0.3%,the carrier was 0.3%,the prevalence was 0.2%.[Conclusion]A method detecting FⅪ by polymerase chain reaction analysis was established. This method is not only simple and convenient,but also has a high accuracy and low cost,which is more suitable for large-scale FⅪ investigation. 展开更多
关键词 Holstein cattle Factor deficiency PCR detection
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基于SHAPE-seq技术解析大肠杆菌典型5′mRNA结构特征及其对基因表达的影响
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作者 张金鹏 任家卫 +6 位作者 梅子轮 张晓梅 徐国强 李会 史劲松 许正宏 张晓娟 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期4440-4454,共15页
【目的】在原核生物基因表达过程中,由于转录本mRNA半衰期较短,其抗降解能力和招募核糖体启动翻译反应的能力对基因表达的影响显著。然而mRNA在其5′端存在多个功能区域,可以影响其半衰期的长短进而影响目的基因的表达,其中主要包括:Shi... 【目的】在原核生物基因表达过程中,由于转录本mRNA半衰期较短,其抗降解能力和招募核糖体启动翻译反应的能力对基因表达的影响显著。然而mRNA在其5′端存在多个功能区域,可以影响其半衰期的长短进而影响目的基因的表达,其中主要包括:Shine-Dalgarno(SD)序列以及其上下游的核糖体“等候”位点(translational standby site, TSS)、N端部分编码序列(N-terminal coding sequence, NCS)。各区域由于其自身和跨区域的结构差异会影响基因表达,因此解析各功能区域的构效关系至关重要。【方法】采用引物延伸测序(SHAPE-seq)技术,以大肠杆菌为宿主解析了7种结构不同的5′mRNA胞内的结构特点,采集了其调控下mRNA丰度以及蛋白表达量。【结果】发现非结构化的NCS调控下mRNA丰度和蛋白量分别提高了10倍、19倍;形成二级结构茎长为10nt的TSS有利于提高mRNA丰度;SD序列被包裹形成二级结构时会影响其介导的翻译起始效率(蛋白表达下降10%);上述较优的TSS和NCS的组合调控下,mRNA丰度和蛋白量显著提高(11倍、60倍)。【结论】本研究解析了5′mRNA各区域有利于原核生物基因表达的结构特征,初步建立了各功能区域的构效关系,为工业微生物目标基因表达提供了新型调控元件。 展开更多
关键词 核糖体等候位点 N端编码 SD 引物延伸 构效关系
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