基于RNA测序的SHED体外连续扩增后差异表达基因的研究

目的:利用RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)技术研究人脱落乳牙干细胞(stem cells derived from human exfoliated deciduous teeth,SHED)体外长时期扩增至20代(P20)后基因表达的差异,初步探讨其体外扩增衰老相关的信号通路。方法:从健康儿童脱落的乳牙中分离牙髓干细胞,在常规条件下将其扩增培养至20代,利用RNA-seq筛选出差异表达的基因,并对其进行相关生物学信息分析,寻找SHED体外连续扩增衰老相关的信号通路。结果:RNA-seq结果显示,SHED第4代(P4)和P20代差异表达的基因共有1884个,其中上调表达的基因有575个,下调表达基因1309个,这些差异表达的基因分布在生物过程(biological progress,BP)、细胞组成(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)等生物学过程中。早、晚期代次的SHED差异基因及相关蛋白之间的作用主要富集在剪接体、核糖体、细胞周期、p53通路相关的信号通路上。结论:本研究揭示了SHED体外连续扩增培养至第20代后基因表达谱的改变,为后续进一步研究其细胞体外衰老机制指明了方向。

扩增区域对鲊广椒细菌MiSeq测序的影响

在使用引物27F/338R、338F/806R和515F/907R分别对细菌16S rRNA基因的V_1～V_2区、V_3～V_4区和V_4～V_5区进行扩增的基础上,采用MiSeq高通量测序评价扩增区域对鲊广椒细菌多样性分析结果的影响。结果发现,扩增16S rRNA基因V_4～V_5区的非特异性序列所占比例显著偏低(P<0.05),而扩增V_1～V_2区样品细菌的Chao 1指数显著偏高(P<0.05)。虽然扩增16S rRNA基因的V_3～V_4区会导致Cyanobacteria(蓝细菌门)和Pediococcus(小球菌)相对含量显著偏高(P<0.05),但不同扩增区域扩增出的同一样品其微生物群落结构无显著差异(P>0.05)。在对鲊广椒细菌多样性进行解析时,建议选择引物515F/907R扩增16S rRNA基因的V_4～V_5区。

人感染H7N9禽流感病毒全基因组扩增与测序方法的建立

目的为了解人感染H7N9禽流感病毒基因特征从而更有效地防控疫情,需建立获得人感染H7N9禽流感病毒全基因序列的扩增和测序方法。方法采用鸡胚分离H7N9禽流感病毒,提取标本和毒株病毒RNA,自行设计引物,通过一步法RT-PCR扩增其全基因组片段,纯化PCR产物后测定核苷酸序列,利用生物信息学软件拼接各节段序列并初步分析其特征。结果本研究中的引物能特异地扩增各基因的目的片段,通过序列拼接可以获得H7N9禽流感全基因组序列。经分析8个节段序列与近期国内流行的人感染H7N9禽流感病毒序列高度同源。结论该方法能有效地获得人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列,可为进一步分析其基因特征奠定基础。

基因扩增联合测序法对痰标本分离的60株真菌病原学鉴定

目的:应用PCR扩增真菌ITS2区基因,结合基因测序法对痰标本中分离的60株真菌进行病原学鉴别。方法:收集痰标本分离的真菌菌落60份及2种真菌标准菌株(白色念珠菌,烟曲霉菌)培养菌落,分别提取基因组DNA,半巢式PCR扩增ITS2区,扩增产物经测序后,结果与NCBI基因库中的核酸序列进行比对,确定致病菌的种属,并对其分布特征进行分析。结果 :2种真菌标准菌株的ITS2区基因序列比对结果与种属一致。痰标本中60株真菌测序鉴定结果为:曲霉菌属24株(其中烟曲霉菌17例、黑曲霉菌3例、黄曲霉菌2例、土曲霉菌1例、变色曲霉1例),青霉菌属3株(小刺青霉菌1株、娄地青霉菌1株、产黄青霉菌1株),念珠菌属29株(白色念珠菌20株、热带念珠菌3株、近平滑念珠菌2株、光滑念珠菌2株、鲁西坦念珠菌1株、季也蒙毕赤酵母菌1株),其它丝状菌还有暗孢节菱孢菌2株,淡紫拟青霉菌1株和串珠状赤霉菌1株。结论:基因测序法能快速、简便、准确地鉴别痰培养的真菌种属,为本地区呼吸道真菌性疾病病原菌流行病学调查及个性化治疗奠定基础。

猪瘟病毒石门株基因组cDNA片断的扩增与克隆测序

以猪瘟病毒（ＨＣＶ）中国石门株强毒的血毒、细胞毒及Ｃ系兔化弱毒的细胞毒中提取的总ＲＮＡ为模板，应用逆转录─聚合酶链式反应（ＲＴ一ＰＣＲ），在合成的两对ＨＣＶ特异引物引导下，扩增出与预计大小一致的４４１和３００ｂｐ两个核酸片断。寡核苷酸探针杂交证实确为ＨＣＶＰ_８０和ｇｐ４４／４８蛋白编码区特异性的ｃＤＮＡ片断。扩增片断克隆入ｐＵＣ_１９和ｐＢＳＫ（＋）中，并对ＨＣＶ石门株Ｐ_８０区ｃＤＮＡ片断进行测序分析，其与国外Ａｌｆｏｒｔ、Ｂｒｅｓｃｉａ株同源性分别为９０．６％和９４．６％。氨基酸水平上同源性高达９８．４％。为抗猪瘟病毒Ｐ_８０区核酶的设计和应用提供了依据。

全血直接扩增结合焦磷酸测序法测定亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性

亚甲基四氢叶酸还原酶基因677C>T和1298A>C两个位点的多态性与临床常用抗肿瘤药物甲氨喋呤及氟尿嘧啶的作用密切相关,对这两个位点多态性的检测能指导临床合理用药。为进一步缩短检测时间,降低检测成本,本研究建立了基于全血直接PCR的焦测序检测方法,采用"HpH Buffer"直接扩增全血模板,仅需1μL全血样本即可对两个位点进行高效扩增。扩增产物经碱变性法制备单链模板后进行焦磷酸测序,经过条件优化,仅需5μL扩增产物和1μL微球即可完成高灵敏的焦测序反应。为验证方法的准确性,检测了12例临床样本,均能正确检测两个位点的基因多态性。本研究为临床基因多态性检测提供了一种操作简便,耗时短,成本低,准确度高的方法,本方法可用于指导甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶的个体化用药。

卡氏住白细胞虫rDNAITS-2的PCR扩增与测序

运用PCR方法扩增了卡氏住白细胞虫rDNA的ITS 2及部分 5 .8S和 2 8S序列 (ITS2 +) ,并对该序列进行了克隆和测序。采用巨型裂殖体为材料 ,并根据SaccharomycescerevisiaerDNA中的 5 .8S、2 8S保守序列所设计的通用引物ITS3、ITS4 ,进行了虫体ITS2 +的PCR扩增 ,将所扩增片段纯化后成功地克隆于 pGEM Teasy和PMD18 T载体的T T窗口。经双向自动测序显示 ,该ITS2 +片段的大小为 2 70bp ;经NCBIBlast联机检索 ,结果显示 ,所扩片段中 5 .8S序列与S .cerevisiae的 5 .8S序列有部分相同 ,而ITS 2序列为虫体所特有 ;同时经wDNA SIS软件分析 ,显示该ITS 2序列与S .cerevisiae间同源性相对较远 ,而与柔嫩艾美耳球虫间同源性相对较近 ,故而本试验中所测序列为卡氏住白细胞虫的ITS 2特有序列。

精神分裂症患者BDV-p24基因的扩增及其产物的测序鉴定

目的 扩增精神分裂症患者PBMCs标本中博尔纳病病毒(Borna Disease Virus,BDV)p24基因,并对基因扩增产物进行测序鉴定,分析其与标准株之间的差异。方法 用巢式RT—PCR方检测黑龙江省精神分裂症患者及正常人PBMCs中BDV-p24基因片段,对2例BDV—p24基因阳性的巢式RT-PCR产物进行测序,并与标准株比较。结果 9例精神分裂症患者中有2例BDV-p24基因阳性,7例正常人标本中未发现BDV—p24基因阳性。测序结果进一步证实扩增产物为BDV—p24基因,其序列与标准株高度同源。结论 用巢式RT—PCR方法可以特异性扩增出BDV—p24基因,扩增产物序列与标准株高度同源,提示黑龙江省的精神分裂症的发生可能与BDV感染有关。

全外测序联合拷贝数变异检测在遗传性耳聋的应用

目的探讨全外显子测序(WES)联合拷贝数变异(CNV)检测在遗传性耳聋中的临床应用价值,并加深对CNV的认识。方法选取广州市红十字会医院耳鼻咽喉头颈外科就诊的双耳中度感音神经性聋患儿,无家族遗传史、用药史,完善内镜、影像学、主观和客观听力学等检查,采集外周血样本,行WES寻找致聋原因并验证。结果患儿无家族遗传史、耳毒性药物用药史等,听性脑干反应阈值、ASSR及纯音听阈测听提示双侧中度感音神经性聋。在该患儿全外显子组发现12个纯合变异,分别定位于1(CR1基因,剪接变异)、5(ZSWIM6基因、SMN1基因,同义突变)、6(ATXN1基因,框内缺失突变;TENT5A基因,框内插入突变)、7(CFTR基因,内含子)、8(TG,启动子)、9(PRDM12基因,框内缺失突变)、10(TUBGCP2基因,剪接变异)、11(TENM4基因,剪接变异)、15(STRC基因,缺失)、16(ABCC11基因,错义变异)号染色体。根据美国医学遗传学与基因组学学会指南、综合病史分析,只有STRC基因NM_153700.2:EX1-EX29E Del变异为致病变异,其余变异为良性或可能良性。多重链接探针扩增技术对靶序列进行验证,结果证实。结论本例患儿为DFNB16(OMIM:603720)的STRC基因变异导致双耳中度感音神经性聋。临床诊疗中,可根据病史,选择不同深度、广度的检测技术;加强耳科医师对CNV引起遗传性耳聋的认识。

母婴健康有关3种衣原体(Cps、Cpn、Ct)通用引物扩增和DNA序列测定方法的建立

目的 :建立鹦鹉热衣原体 (Cps)、肺炎衣原体 (Cpn)和沙眼衣原体 (Ct) 3种衣原体通用引物扩增和DNA序列测定技术。方法 :在衣原体 16SrRNA基因序列保守区设计外套引物内套引物 ,建立Cps、Cpn和Ct 3种衣原体通用引物的套式PCR(GnPCR)扩增体系和DNA测序体系。结果 :Cps、Cpn和Ct 3种衣原体菌体均能被GnPCR扩增出 ,其中Cps和Cpn的GnPCR产物经DNA测序与标准株序列完全相同。GnPCR灵敏度也较Cpn和Ct种特异传统PCR高。结论 :Cps、Cpn和Ct的GnPCR灵敏、特异 ,因不同的衣原体感染有着相同的疾病谱 ,因此本方法的建立能降低患者医疗费用的同时使患者在第一时间得到及时有效的治疗。

用于高通量测序未知病原体分析的样本预处理方法及扩增方案概述

2005年以来,二代测序平台和测序技术越来越普及,被广泛用于新病毒和未知病原体的发现,从未经培养的复杂样本中筛查病毒类病原体需要更多的前期处理措施。我们围绕高通量测序所涉及到的测序样本预处理方法和扩增方法做简要总结:样品类型分为无菌样本和开放样本;病原体类型包括病毒、细菌、真菌等;背景核酸去除的常用方法包括物理分离、核酸酶消化和几种r RNA去除的方法;常用的微量样本非特异性扩增方法包括随机引物PCR、SISPA技术、锚定随机引物PCR、RCA技术、MDA技术和NASBA技术。

自然流产和超声检查提示脏器结构异常胎儿的染色体高通量连接探针扩增技术检测分析

目的分析自然流产和超声检查提示脏器结构异常胎儿的染色体高通量连接探针扩增技术(HLPA)检测结果。方法1183例自然流产或超声检查提示胎儿心脏畸形、淋巴水囊瘤或多发畸形等结构异常的孕妇,孕早期孕妇留取胎儿绒毛组织标本,孕中晚期孕妇取胎儿肌肉组织标本。1183例份标本中372例份(HLPA组)采用HLPA检测染色体,811例份(对照组)采用低深度全基因组测序拷贝数变异(CNV-seq)技术检测染色体,对比分析两组胎儿染色体异常情况。结果HLPA组、对照组胎儿检测失败率分别为1.61%、1.48%(P>0.05)。HLPA组、对照组胎儿染色体异常检出率分别为60.11%、49.94%(P>0.05)。HLPA组中染色体数目异常204例、染色体结构异常16例,对照组中染色体数目异常369例、染色体结构异常30例,HLPA组、对照组染色体数目异常、染色体结构异常情况比较,P均>0.05。结论HLPA对自然流产或超声检查显示心脏、淋巴水囊瘤或多发畸形等结构异常胎儿染色体异常的诊断效能与CNV-seq技术相当,可用于胎儿的染色体诊断。

烟粉虱内共生菌groEL基因的PCR扩增与测序

烟粉虱内共生菌groEL基因编码一种 63KD的GroEL蛋白 ,属于分子伴侣cpn60家族成员 ,与烟粉虱传播植物病毒病关系密切。通过PCR对长期生活在甘蓝上的烟粉虱体内groEL基因进行了PCR扩增 ,序列测定表明其长度为 1 668bp ,编码 5 5 5个氨基酸 ,与Genebank中烟粉虱内共生菌groEL(AF1 30 4 2 1 )的核苷酸同源性为 99 82 % ,氨基酸同源性为 99 64%。

耐氧氟沙星鸡大肠杆菌gyrA基因QRDR的扩增与测序

取临床分离的 1 3株氧氟沙星 ( OFL)耐药菌 ,提取其质粒 DNA,经纯化后作为模板 ,用 PCR扩增 gyr A基因喹诺酮耐药决定区 ( QRDR) ;PCR阳性质粒的菌株 ,再扩增其染色体 gyr A基因 QRDR,直接测定质粒和染色体 DNA扩增产物序列并进行分析。只有 CE0 1菌株的质粒 DNA和染色体 DNA可扩增出长度为 668bp的 PCR产物片段 ,两者基因序列相同率为 98.1 7% ,相同位点突变相同的碱基有 5个 ,相同位点突变不同的碱基有 2个。与基因数据库中的大肠杆菌 gyr A基因相应序列比较 ,该菌质粒 DNA PCR产物同源率为97.80 % ,有 1 3个位点发生突变 ,3个氨基酸被替换 ;染色体 DNA PCR产物同源率 98.0 0 % ,有 1 2个位点发生突变 ,2个氨基酸被替换 ;都包括了国外资料报道的突变率较高的第 83位氨基酸的突变。结果表明 ,该菌株质粒和染色体上都存在喹诺酮耐药基因 ,对

用于病毒高通量测序样品前处理及核酸扩增方案概述

随着测序技术水平的改进,测序通量的不断提高,高通量测序技术得到迅猛的发展与普及,其在病毒学领域的应用也越来越广泛。通常,有效的降低宿主细胞和其他微生物基因的干扰并提高病毒核酸的丰度是鉴别病毒的重要前提,分离、扩增、获取目的基因的序列则是鉴别病毒的关键。然而,临床上获得的样品中病毒含量一般较低,从少量高度复杂的临床样品中发现目的序列如同＂大海捞针＂,因此,

人外周血IL-12 P35 cDNA的巢式PCR扩增、克隆与测序

目的 克隆中国汉族人IL -12P3 5cDNA序列 ,并进行序列测定。 方法 利用反转录巢式PCR从健康人外周血总RNA中扩增IL -12P3 5cDNA序列 ,插入T载体PMD -T中 ,重组质粒转化大肠杆菌JM10 9,所获克隆经PCR初筛后进行酶切鉴定 ,阳性克隆进行DNA测序。 结果 从健康人外周血总RNA中扩增出约 670bp条带 ,与预期大小相同 ,PCR与酶切鉴定证明得到PMD/P3 5阳性克隆 ,DNA测序证实了插入片段的正确性。 结论 在体外成功的扩增、克隆了中国汉族人IL -12P3 5cDNA序列。为继续开展IL -12的基础与应用研究奠定了基础。

糖尿病部分基因突变两步法扩增测序技术

本文建立了高盐沉淀提取人白细胞糖尿病基因模板 ,用PCR两步法扩增包括 32 4 3A→G和 3316G→A点突变片段 ,检测其碱基顺序排列技术。结果显示所检测的正常人基因片段与S .Ander son ,A .T .Bankier,B .C .Barrell等人报道的人糖尿病基因编排序列一致。本法与酚提取法、克隆序列检测等方法相比 ,时间缩短数 10个小时 ,成本降低 5 0 %以上。

二代测序探究晚期肺癌患者RICTOR扩增和PI3K基因改变

研究一：靶向治疗在肺癌中取得了重大进展，但仍有接近一半的肺腺癌患者未能确定常规治疗靶点的基因改变，有学者通过二代测序技术在一位年轻肺腺癌患者发现仅有RICTOR扩增。RICTOR是mTOR复合体2（mTORC2）的重要组成成分，mTORC2在多个癌种的调控肿瘤细胞迁移、浸润和转移中发挥了重要作用，但是RICTOR扩增在人群中的发生率、是否为致瘤基因以及对药物的敏感性等问题有待阐明。

单管扩增测序分型技术用于人类白细胞抗原-DRB1基因分型的研究

目的:用单管PCR扩增方法建立高效的人类白细胞抗原(HLA)-DRB1基因测序分型技术并探讨其应用价值。方法:合成7个5′端特异性扩增引物和一个3′端共用引物,将上述引物混合在一起组成单个PCR反应用于120个临床样本的HLA-DRB1的DNA测序分型。结果:本组样本都能成功分型,且结果准确,重复性好。结论:本法改进了测序分型技术,具有高分辨率、高特异性和高效率的特点,值得推广应用。