细菌Flavobacteriaceae sp. CZ1127产海参岩藻聚糖硫酸酯酶的发酵条件优化

以从海洋中分离筛选得到的细菌Flavobacteriaceae sp.CZ1127为研究对象,通过单因素实验和正交试验对其产海参岩藻聚糖硫酸酯酶的培养基成分进行优化,提高其产酶量。得出其最佳培养基组成为(w/v):海参岩藻聚糖硫酸酯0.25%、酵母粉0.15%、MgSO4.7H2O 0.05%、CaCl2 0.02%、KCl 0.01%、Na2HPO4 0.22%、NaH2PO4 0.06%、NaCl 2.5%;确定了该菌株的最佳培养条件为:500 mL的三角瓶装液150 mL、温度为25℃、转速150 r/min、发酵时间为48 h。优化后,海参岩藻聚糖硫酸酯酶活力为22.88 U/mL,比优化前提高了3.01倍。

基于人工神经网络的海参岩藻聚糖硫酸酯酶解模型建立及抗氧化活性研究

本文以海地瓜岩藻聚糖硫酸酯为原料,用自主筛选的海洋细菌Flavobacteriaceae sp. CZ1127产生的FUCase酶解制备低分子质量产物(Am-LMF),随机选取80组酶解数据作为训练样本用于构建误差反向传播神经网络(BP网络),剩余10组作为预测样本检验网络的性能。建立起网络输入为酶浓度和酶解时间,输出为酶解产物分子质量的对数的单隐层BP网络模型(BP-ANNs),通过优化设计,确定BP网络隐层节点数为7,隐层传递函数为logsig,输出层传递函数为purelin,训练函数为trainlm,并固定最优网络权值,使BP-ANNs经74次训练后,均方误差达到0.01以下,经测试网络预测值和实测值的相对误差控制在1.06%以内。经测定,不同分子质量的Am-LMF对超氧阴离子的清除能力具有显著差异。结果表明,本文成功建立了用于分子质量预测的海参岩藻聚糖硫酸酯酶解的人工神经网络,可为今后试验和实际生产中制取不同分子质量的SC-FUC及其构效关系的研究提供依据。

岩藻聚糖硫酸酯酶提取方法比较研究及响应面优化

为了研究海洋细菌Flavobacteriaceae sp.CZ1127产胞内岩藻聚糖硫酸酯酶的高效提取方法,本研究比较了超声破碎、化学试剂法、溶菌酶法、渗透压作用、反复冻融等几种方法对Flavobacteriaceae sp.CZ1127胞内岩藻聚糖硫酸酯酶的提取效果,确定超声破碎法为最优方法。进一步通过单因素实验及响应面实验考察了超声破碎各因素对提取效果的影响,建立了预测超声破碎法提取岩藻聚糖硫酸酯酶酶活的数学模型,并对各因素条件进行了优化。最终确立的超声破碎提取最佳条件为:破碎功率600 W,菌悬液浓度20 mg/m L,破碎总时长9 min,单次破碎时长为6 s,间歇时长4 s。利用优化方法可从单位质量(g)菌体中获得岩藻聚糖硫酸酯酶酶活(1640.47±84.81)m U/g,提取效果较优化前提高了56.80%。

岩藻聚糖硫酸酯酶及其降解产物的研究进展

岩藻聚糖硫酸酯酶多用于制备低分子质量岩藻寡糖,主要为α-L-岩藻糖苷酶、岩藻多糖酶和硫酸酯酶。它主要来源于软体动物及海洋微生物中,其中大部分属于黄杆菌科。该文从岩藻聚糖硫酸酯酶的分类、来源、酶的基因鉴定、酶活力的影响因素、酶解产物的结构及生物活性等方面进行了综述,以期为岩藻聚糖硫酸酯酶的应用与岩藻寡糖的生产提供理论参考。

海参岩藻聚糖硫酸酯抑制小鼠肿瘤生长和转移及其作用机制的研究

目的探讨海参岩藻聚糖硫酸酯(sea cucumber fu-coidan,SC-FUC)对小鼠肿瘤生长和转移的抑制作用及其机制。方法建立C57 BL/6J小鼠Lewis肺癌自发性肺转移模型,连续腹腔注射给药21 d,剥离原位肿瘤和双侧肺,分别称瘤重和计数肺表面转移灶结节数;采用RT-PCR法检测肿瘤组织中缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、乙酰肝素酶(heparanase,HPA)和基质金属蛋白酶-2/9(matrix metalloproteinase-2/9,MMP-2/9)mRNA的表达。结果 SC-FUC可以抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,其平均抑制率为45.5%,并可以减少肺表面转移灶结节数(P<0.01),平均抑制率为66.0%。SC-FUC可以降低荷瘤小鼠肿瘤组织中HIF-1α、VEGF、HPA、MMP-2/9 mRNA的表达(P<0.05,P<0.01)。结论 SC-FUC能抑制肿瘤细胞在小鼠体内的生长和转移,其机制可能与抑制肿瘤血管新生,降低肿瘤细胞的迁移能力有关。

海地瓜和冰岛刺参海参岩藻聚糖硫酸酯抗肿瘤作用的比较研究

目的:采用离子交换层析法分别从海地瓜和冰岛刺参中,分离纯化两种海参岩藻聚糖硫酸酯(SC-FUC),通过建立小鼠Lewis肺癌自发性肺转移模型,比较分析两种SC-FUC对小鼠肿瘤生长和转移的抑制作用。方法:采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生高效液相色谱法(HPLC)测定其单糖组成,采用离子色谱法测定其硫酸基含量。通过连续腹腔注射两种SC-FUC 21d,剥离原位肿瘤和双侧肺,分别称瘤质量和计数肺表面转移灶结节数。采用RT-PCR法检测肿瘤组织中缺氧诱导因子(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达。结果:海地瓜SC-FUC和冰岛刺参SC-FUC均由岩藻糖组成,硫酸基含量分别为26.3%和29.31%;两者均能显著抑制荷瘤小鼠原位肿瘤的生长,抑瘤率分别为19.24%和28.69%;显著减少肺表面转移灶结节数(P<0.01),转移抑制率分别为31.4%和57.1%;显著降低荷瘤小鼠肿瘤组织中HIF-1α和VEGF mRNA的表达(P<0.05,P<0.01)。冰岛刺参SC-FUC的效果要优于海地瓜SC-FUC。结论:两种SC-FUC均能显著抑制肿瘤的生长和转移,其作用机制与其高硫酸化程度有关。

海参岩藻聚糖硫酸酯对巨噬细胞的调节作用及信号通路研究

目的研究海参岩藻聚糖硫酸酯(SC-FUC)对巨噬细胞的调节作用及相关信号通路,探究其调节机体免疫的作用机制。方法噻唑蓝(MTT)比色法检测巨噬细胞的增殖情况;中性红法检测吞噬活性;Griess试剂法测定培养上清液中NO含量;RT-PCR检测巨噬细胞下游细胞因子IL-6、IL-10、Toll样受体和相关信号分子My D88、TRIF、NF-κB的mRNA表达量。结果 SC-FUC对巨噬细胞增殖、吞噬能力和NO分泌均有促进作用,在作用前期(6h和12h)效果更为明显。SC-FUC能上调细胞因子IL-6和IL-10的mRNA表达量,上调TLR4、TLR5、TLR9的表达量,促进信号分子My D88、TRIF和NF-κB的mRNA表达量。结论 SC-FUC能够激活巨噬细胞,促进其分泌NO、IL-6、IL-10等细胞因子,从而发挥免疫调节作用。SC-FUC激活巨噬细胞的信号通路与细胞表面TLR4、TLR5、TLR9及NF-κB通路相关。

硫酸酯化剂和溶剂对海参岩藻聚糖硫酸酯化修饰的影响

比较了以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和吡啶(Py)两种溶剂,氯磺酸-吡啶(CA-Py)和三氧化硫-吡啶(SO3-Py)两种硫酸酯化剂对海参岩藻聚糖硫酸酯化的影响。结果表明:以CA-Py为酯化剂可使硫酸基的含量高达50%以上,以SO3-Py为酯化剂,硫酸基的含量仅达到20%左右;DMF为溶剂时可低温反应,Py为溶剂时反应温度必须90℃以上,但产品得率较高。红外光谱分析显示:硫酸酯化后,四种产品硫酸酯的特征吸收峰均显著增强。抗氧化活性实验结果表明:四种硫酸酯化产品对1,1-二苯基-苦肼基自由基的清除效果最好,对羟基自由基的清除效果次之,对超氧阴离子自由基的清除效果最小;以SO3-Py为酯化剂所得产品的抗氧化活性优于CA-Py为酯化剂的产品,DMF为溶剂的产品优于Py为溶剂的产品。因此,操作简便的SO3-Py法更适于海参岩藻聚糖的硫酸酯化。

海参岩藻聚糖硫酸酯的超滤纯化工艺研究

采用超滤膜分离技术对海参岩藻聚糖硫酸酯提取液进行纯化,研究膜截留分子量、跨膜压力等对膜通量及纯化效果的影响,并测定了膜污染后的清洗效果。结果发现:截留分子量200 k Da的UV200膜最适于海参岩藻聚糖硫酸酯的分离纯化,所得固形物产品中总糖含量高达56.12%,蛋白质含量仅为6.37%,岩藻糖含量为36.34%,硫酸根含量为10.75%;超滤工艺优化结果显示,跨膜压强以0.2 MPa为宜,蛋白质脱除率高达91.09%,色素脱除率可达65.30%;膜污染后,采用含酶强碱性清洗剂可有效去除膜面污染物。

氯磺酸-吡啶法酯化修饰海参岩藻聚糖硫酸酯的研究

用氯磺酸-吡啶法对海参岩藻聚糖硫酸酯进行酯化修饰,考察了硫酸酯化剂比例、反应温度及反应时间对酯化效果的影响.通过正交实验,优选出最佳酯化工艺条件:吡啶与氯磺酸体积比为1:1,反应温度为50℃,反应时间为2h;硫酸基的含量由10.75%可提高至59.53%;红外光谱分析结果显示,酯化后硫酸酯的特征吸收峰显著增强.抗氧化活性测定显示,硫酸酯化海参岩藻聚糖硫酸酯对DPPH自由基和羟基自由基的清除率均显著提高.

不同高级结构墨西哥海参岩藻聚糖硫酸酯调控脂肪细胞分化的构效关系

海参岩藻聚糖硫酸酯(sea cucumber fucoidan,SC-FUC)是海参体壁中的重要活性成分之一。研究表明多糖的生物活性与其高级结构密切相关。本实验旨在研究体外水平下不同高级结构墨西哥海参岩藻聚糖硫酸酯(fucoidan from Holothuria mexicana,Hm-FUC)对脂肪细胞分化活性的影响,以期为SC-FUC的更高效利用及深入开发提供理论依据。本实验以3T3-L1前脂肪细胞为研究对象,采用"传统鸡尾酒法"建立脂肪细胞分化模型,通过四甲基偶氮唑盐法、油红O染色法和逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应法系统研究不同高级结构Hm-FUC对3T3-L1前脂肪细胞分化过程的调控作用及其分子机制。结果表明:4种Hm-FUC均可显著抑制3T3-L1细胞的增殖和分化,减少成熟脂肪细胞数目,降低细胞内甘油三酯含量;显著下调脂肪细胞分化关键转录调控因子SREBP1c、PPARγ、C/EBPα的mRNA表达(P<0.05);显著上调Wnt/β-catenin信号通路关键基因LRP5、LRP6、Frz、β-catenin、cmyc、Cyclin D1的mRNA表达(P<0.05),显著下调负调控因子GSK3β的mRNA表达(P<0.05),其中Hm3(210 kDa,无规卷曲短链构象)效果最为显著,但对Wnt10b mRNA表达无显著影响。综上所述,Hm-FUC是通过激活Wnt/β-catenin信号通路,下调脂肪细胞分化关键转录因子的表达从而抑制成脂,其中当分子质量为210 kDa,链构象为无规卷曲短链状时,其抑制脂肪细胞分化活性最强。

三氧化硫吡啶法酯化修饰海参岩藻聚糖硫酸酯的研究

该文对海参岩藻聚糖硫酸酯进行硫酸酯化修饰,并比较其酯化修饰前后的结构特征及抗氧化活性。分别采用三氧化硫-DMF法和三氧化硫-吡啶法制备硫酸酯化海参岩藻聚糖硫酸酯,以取代度为考察指标,研究了反应温度、酯化剂用量、反应时间对酯化效果的影响。结果表明,三氧化硫-DMF法的最佳修饰条件为:反应温度为40℃、酯化剂用量1.2 g、反应时间为3 h,产品取代度可达15.63;三氧化硫-吡啶法的最佳修饰条件为:反应温度为90℃、酯化剂用量1.2 g、反应时间为3 h,产品取代度可达13.31。抗氧化活性测定结果显示,硫酸酯化海参岩藻聚糖硫酸酯对DPPH·和·OH的清除率均显著提高,且三氧化硫-DMF法所得产品的抗氧化活性略高。

北大西洋瓜参岩藻聚糖硫酸酯分离纯化及结构分析

目的:从北大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)体壁中提取纯化得到一种北大西洋瓜参岩藻聚糖硫酸酯(CF-FUC),并对其结构特征进行研究。方法:利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化出CF-FUC组分,以高效凝胶过滤色谱法测定分子质量,以离子色谱法测定硫酸根含量,以柱前衍生高效液相色谱法测定单糖组成,并通过核磁共振技术推测其精细结构。结果:CF-FUC的分子质量为360kD,硫酸根含量为(29.8±3.2)%,单糖组成为岩藻糖、半乳糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖物质的量比为1:0.22:0.07:0.07,岩藻糖存在两位硫酸酯化α型吡喃岩藻糖及非硫酸酯化α型吡喃岩藻糖两种形式。结论:CF-FUC结构有别于其他海参岩藻聚糖硫酸酯(SC-FUC)。

海参多糖硫酸根含量的离子色谱法测定及其差异分析

经过三氟乙酸水解后,利用Dionex ICS-2000离子色谱仪对不同海参粗多糖、海参硫酸软骨素(SC-CHS)和海参岩藻聚糖硫酸酯(SC-FUC)中的硫酸根(SO42-)进行了分离和测定。平均加标回收率为100.90%,相对标准偏差为2.12%,检测限达到3.9×10-2μg/mL。较之传统的多糖硫酸根的测定方法,本方法重复性好,测定更为简便、准确,可应用于其它硫酸多糖硫酸根的定量测定。测定结果显示,所有种类海参SC-CHS的硫酸根含量高于SC-FUC,不同种类海参的多糖硫酸根含量存在特征性差异。

3种低值海参中海参多糖的提取分离及化学组成研究

海参是我国重要的经济水产品,具有多种营养及生理调节功能。海参多糖是海参的主要功效成分之一。文中以3种低值海参-黄玉参(Stichopus naso)、沙参(Holothuria floridana)及土耳其参(Holothuria tubulosa)为实验原料,在利用分子生物学方法确认其种属的基础上,提取其中的海参多糖,并利用阴离子交换层析分离纯化出海参硫酸软骨素及海参岩藻聚糖硫酸酯2种组分。分别采用柱前衍生-HPLC法、离子色谱法及高效凝胶排阻色谱法分析各样品的单糖组成、硫酸根含量及分子质量。结果表明:海参多糖及其组分的化学组成随海参来源的不同而存在差异。

基于pHBH法的岩藻聚糖硫酸酯酶酶活测定方法

采用对羟基苯甲酰肼(pHBH)对岩藻糖进行显色,建立测定岩藻糖还原端含量的pHBH法。该方法操作简便,灵敏度高,检测限为0.26μg/mL,定量限0.85μg/mL。在此基础上,以Flavobacteriaceae sp.CZ1127产生的岩藻聚糖硫酸酯酶为试验材料,对岩藻聚糖硫酸酯酶活测定方法中的几个关键影响因素进行研究,建立一套快速、可靠的岩藻聚糖硫酸酯酶酶活测定方法。采用该方法,酶活检测限达到0.048 mU。

产岩藻聚糖硫酸酯酶微生物的筛选及产酶条件优化

利用岩藻聚糖硫酸酯酶对岩藻聚糖硫酸酯进行降解,是获得低分子质量岩藻聚糖硫酸酯的最佳途径,这对岩藻聚糖硫酸酯的结构研究和活性低聚糖的开发具有重要意义。本文通过次甲基蓝法从麦岛海域海水中筛选出1株岩藻聚糖硫酸酯酶的高产菌株MD3,经高效排阻色谱验证其具有降解岩藻聚糖硫酸酯的能力。优化的发酵产酶条件:发酵温度25℃,发酵初始pH8.0,250mL三角瓶装液50mL,摇床转速200r/min,发酵时间72h。优化后MD3产酶能力由2.1U/mL提高到4.0U/mL,为岩藻聚糖硫酸酯酶的生产及活性低聚糖的开发奠定基础。

海参岩藻聚糖硫酸酯对长期饮酒小鼠肝脏保护作用的研究

目的研究海参岩藻聚糖硫酸酯(SC-FUC)对长期饮酒导致的小鼠肝脏功能损伤的改善作用。方法从海地瓜(Acaudina molpadioides)中制备SC-FUC。将ICR小鼠随机分为4组:正常组、模型组以及SC-FUC低、高剂量组,每组12只。各组小鼠按0.08 ml/g bw灌胃受试物,1h后再灌胃白酒,每天一次,连续8w。实验结束后分别检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性,肝脏乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)含量以及肝脏中CYP2e1mRNA的表达量。结果 SC-FUC能显著降低小鼠血清ALT和AST活力(P<0.05),提高肝脏ADH、ALDH、GSH-Px活力(P<0.05)和GSH含量(P<0.05),降低MDA含量(P<0.05);降低肝脏中CYP2e1mRNA的表达量(P<0.05)。结论 SC-FUC对长期饮酒小鼠肝脏具有显著的保护作用。

不同分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备及消化吸收特性的初步研究

目的比较分子量大小对海参岩藻聚糖硫酸酯（SC-FUC）消化吸收特性的影响。方法采用酶解法制备不同分子量的海参岩藻聚糖硫酸酯。SD大鼠随机分为4组,每组6只,分别灌胃不同分子量的海参岩藻聚糖硫酸酯（1 000 mg.kg-1）后,于0、0.5、2、6、15、24、36和48 h尾静脉取血,采用柱前衍生高效液相色谱法测定血清岩藻糖含量。结果制备得到分子量为700、437.8、52.7和20.5 kD的海参岩藻聚糖硫酸酯,硫酸根含量在21.4%~22.4%。大鼠灌胃海参岩藻聚糖硫酸酯后,血清岩藻糖水平均有升高。其中,低分子量组在12~15 h内血清岩藻糖浓度升至最高值53~55μg.mL-1,而高分子量组在36 h才达到峰值45μg.mL-1。灌胃48 h后,血清岩藻糖浓度基本恢复至初始水平。结论 SD大鼠可以消化吸收海参岩藻聚糖硫酸酯,吸收效率因分子量大小而异,分子量越大吸收效率越低。该研究为海洋酸性多糖药物的开发提供了试验依据。

冰岛刺参岩藻聚糖硫酸酯对胰岛素抵抗小鼠炎症改善作用的研究

目的研究冰岛刺参岩藻聚糖硫酸酯(fucoidan from the sea cucumber Cucumaria frondosa,Cf-FUC)对胰岛素抵抗小鼠炎症反应的改善作用。方法以高脂高糖饲料饲喂法建立胰岛素抵抗小鼠模型。雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组、Cf-FUC组。正常对照组饲喂标准饲料,其它组饲喂高脂饲料。阳性对照组、Cf-FUC组分别在饲料中添加罗格列酮(rosiglitazone,RSG,1mg·kg^(-1)·d^(-1))、Cf-FUC(80mg·kg^(-1)·d^(-1))。各组小鼠自由摄食摄水19周。实验结束后,检测血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、MIP-1、IL-1β、IL-6和IL-10表达水平,荧光定量PCR方法检测小鼠脂肪组织炎症细胞因子基因mRNA表达水平,Western方法检测JNK1、IKKβ磷酸化蛋白水平及细胞核和细胞质中NFκB蛋白表达量。结果 Cf-FUC可显著降低胰岛素抵抗小鼠血清TNF-α、MIP-1、IL-1β和IL-6浓度,增加IL-10浓度;抑制小鼠脂肪组织TNF-α、MIP-1、IL-1β和IL-6基因mRNA表达,促进IL-10基因mRNA表达;抑制JNK1和IKKβ的磷酸化,增加细胞质中NFκB蛋白表达量,减少细胞核中NFκB蛋白表达量。结论Cf-FUC能通过抑制JNK和IKKβ/NFκB信号通路抑制促炎症因子分泌,增加抑炎症因子分泌,改善胰岛素抵抗小鼠的炎症反应。