海枣曲霉产内切菊糖酶的发酵条件及菊糖酶解条件的研究

利用海枣曲霉发酵获得菊糖酶粗酶液,对粗酶液的发酵条件和酶解条件进行了研究。结果表明,菊糖酶的最适发酵条件为：菊糖2%,磷酸二氢铵0.5%,磷酸二氢钾0.25%,MgSO4.7H2O 0.05%,pH 6.0-7.0,接种量8%,温度28℃,时间60 h,按最优条件得到的菊糖酶粗酶液,酶活为18.39 U/mL,I/S值为45.71。菊糖酶的最适酶解条件：温度60℃,加酶量11.0 U/g菊糖,水解12 h,底物浓度10%,pH 6.0-7.0。菊糖酶解率最高达59.3%。运用超滤法纯化菊糖酶解产物得到低聚果糖,利用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定其相对分子质量为509,聚合度为2-3。

海枣曲霉β-葡萄糖苷酶的提纯与性质

通过聚乙二醇6000-磷酸钾缓冲液双相分离,Sephadex G-100凝胶过滤、DEAE-Sephadcx A-50及SE-Sephadex C-50离子交换柱层析等提纯步骤,从海枣曲霉(Aspergillus_phoenicis)麦麸培养物抽提液中提纯到凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶。该酶的最适pH5.0,最适温度60%,在pH 4.0—7.5之间及55℃以下稳定。Ag^+及Hg^(2+)对该酶有强烈的抑制作用。用SDS-凝胶电泳法及梯度凝胶电泳法测得该酶的分子量分别为118000及195000薄层凝胶等电聚焦法测得其等电点为pH 3.95。

海枣曲霉β-D-岩藻糖苷酶的研究

虽然β-D-岩藻糖苷酶(EC3.2.1.38)已从多种动植物中分离纯化,但因它们的专一性均不高而难以确证。我们从海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)培养物中提取,经过 PEG6000-磷酸缓冲液双水相分离,相继用 DEAE-sephadex A-50、羟基磷灰石、Sephadex G-100等柱层析分离,获得了凝胶电泳均一的β-D-岩藻糖苷酶,比活力提高500倍。酶反应的最适条件为40℃和 pH 6.0,在35℃以下和 pH5.5—6.5稳定。凝胶过滤法测分子量为50000—60000,用 SDS-PAGE 测出分子量为57000。酶的 K_m 值为2.4mmol/L,V_(max)为12.8μmol·min^(-1)·mg^(-1)。金属离子 Ag^+、Hg^(2+)对酶有强抑制作用,巯基乙醇和牛血清清蛋白以及甘油和多种糖能提高酶活力。化学修饰结果表明,-SH、—COOH 基团和组氨酸、色氨酸残基为酶活力所必需。该酶只能水解 pNP-β-D-岩藻糖苷,有严格的底物专一性,并能专一地受 D-岩藻糖和 D-岩藻糖酸-γ-内酯所抑制,为迄今为止最专一的β-D-岩藻糖苷酶,堪称该酶的典型代表。

海枣曲霉β-木糖苷酶的提纯和性质

从海枣曲霉麦麸培养物抽提液中，通过聚乙二醇６０００－磷酸钾缓冲液双水相分离，相继用Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００凝胶过滤、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－５０离子交换柱层析、羟基磷石吸附层析、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－５０离子交换层析、ＳＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ－５０离子交换层析以及最适温度为６５℃，在ｐＨ３．５－６．５之间稳定，酶保温３０分钟时的半失活温度（ｔ１／２）为６８℃。

海枣曲霉β-葡萄糖苷酶的催化性质

本文研究了海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)β-葡萄糖苷酶的底物特异性以及不同化学试剂对酶活力的影响。该酶水解对-硝基酚基-β-葡萄糖苷、纤维二糖和水杨素的相对活力分别为100、180和67.3。水解对-硝基酚基β-葡萄糖苷和纤维二糖的 K_m 值分别为0.97mmol/L和1.8mmol/L,V_(max)分别为576μmol·min^(-1)·mg^(-1)和595μmol·min^(-1)·mg^(-1)。Ag^+、D^-葡萄糖和纤维二糖对酶活力有强烈的抑制作用。Lineweaver-Burk 作图法及 Dixon 作图法表明D-葡萄糖对该酶显示竞争性抑制作用,其 K_i 值分别为3.0mmol/L 和3.4mmol/L。

海枣曲霉糖苷酶类的化学组成

本文测定的海枣曲霉糖苷酶均为糖蛋白,含糖量分别为:地衣多糖酶7.7%,木聚糖酶X-Ⅱ 5.8%,木聚糖酶X-Ⅲ 3.3%,β-半乳糖苷酶14.3%,β-葡萄糖苷酶16.1%,β-木糖苷酶15.5%。这几个酶的氨基酸组成有较大差异,但也有共同特点,即都含有较多酸性与羟基氨基酸,含His,Met较少。将这些酶的氨基酸组成作成星状图,结果这些酶的星状图互不相同,只有β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶的星状图之间有一定的相似性。比较海枣曲霉糖苷酶和其他来源的糖苷酶的氨基酸组成的星状图。发现不同来源的同一种酶都有不同程度的相似性,且相似程度与产生菌之间的亲缘关系有很大的相关性。

海枣曲霉木聚糖酶Ⅲ糖组成及糖肽结合键研究

海枣曲霉木聚糖酶Ⅲ经PAGE和SDS-PAGE后用Schiff’s试剂染色证明为糖蛋白。经硅胶薄层层析和毛细管气相色谱测定,每分子酶约含4个葡萄糖和1个甘露糖残基。 木聚糖酶Ⅲ经β-消除反应后在241nm处出现一个新的吸收峰。在N_2保护下用含NaBH_4的NaOH溶液处理后,其Ser和Thr减少,相对应丙氨酸增加,并出现α-氨基丁酸。估测酶分户中存在约3个O-糖苷键,糖残墓通过O-糖苷键连接于肽链中丝氨酸或苏氨酸上。

海枣曲霉β-D-岩藻糖苷酶的专一性

虽然β-D-岩藻糖苷酶(Fuc-ase)(β-D-Fucoside fucohydrolase EC 3·2·1·38)已经从多种动植物中分离出来,但专一性都不高,“酶学命名”所列的该酶均具有相当高的β-D-半乳糖苷酶(Gal-ase)和/或β-D-葡萄糖苷酶(Glc-ase)活力。