海栖热袍菌耐高温β-半乳糖苷酶基因的克隆和表达

本文主要研究了在大肠杆菌中克隆和表达海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8的一个β-半乳糖苷酶基因(TM_0310)。以海栖热袍菌基因组DNA(GenBank登录号AE000512)为模板,设计特异性引物带有NcoI-HindIII酶切位点,克隆得到的该基因全序列为2019bp,编码672个氨基酸,分子量为78.972kD。该基因编码的蛋白质属于42族,根据氨基酸同源性分析,该β-半乳糖苷酶与Thermotoga petrophila RKU-1来源的假想的β-半乳糖苷酶(GenBank登录号ABQ46628.1)以及Thermotoga sp.RQ2来源的β-半乳糖苷酶(GenBank登录号EDQ29256.1)同源性最高,均为95%。重组转化子经诱导酶比活可达2.08U/mg蛋白。粗酶液经过80℃热处理10min,酶活残留70%以上,表明该酶有很好的耐热性,在高温工业环境中有良好应用前景。

海栖热袍菌内切葡聚糖酶Cel12B与木聚糖酶XynA CBD结构域融合基因的构建、表达及融合酶性质分析

海栖热袍菌内切葡聚糖酶Cel12B是极耐热胞外酶，氨基酸序列分析表明不含有纤维素结合结构域（CBD），对结晶纤维素无活性，但同样菌种来源的木聚糖酶XynA有催化结构域和纤维素结合结构城。用同样极耐热酶CBD区域和Cel12B融合构建重组质粒pET-20b—Cel12B—CBD，经诱导表达后，对结晶纤维素有活性，酶学特性研究表明：最适反应温度为100℃、最适pH为5．8、在pH4．5—7．0时酶活力稳定，90℃保温2h仍有87％的酶活。

极端嗜热菌海栖热袍菌α-葡萄糖醛酸酶的高效表达和重组酶的纯化

α 葡萄糖醛酸酶作为木聚糖降解的限速酶之一 ,在木聚糖类半纤维素的生物转化中起着重要的作用。海栖热袍菌Thermotogamaritima是一个嗜极端高温的厌氧细菌 ,其产生的极耐热性酶类具有非常可观的工业应用前景。但热袍菌属Thermotoga的基因在大肠杆菌中的表达一般较困难。研究了T .maritima中的极耐热性α 葡萄糖醛酸酶基因在大肠杆菌不同菌株中的表达水平及纯化技术。结果表明 ,稀有密码子AGA、AGG和AUA限制了该基因在大肠杆菌中的表达 ,在大肠杆菌BL2 1 CodonPlus(DE3) RIL可得到高效表达 ,重组蛋白表达量达 2 0 % ,比酶活比野生菌株提高 5倍 ;重组蛋白经热处理和金属Ni2 + 的亲和层析提纯后 ,达到了电泳纯 ,提纯倍数为 5 1倍 ,收率为5 5 1 %。对重组菌诱导表达条件的研究表明 ,营养丰富的TB培养基有助于重组菌的生长 ,重组菌生长至OD6 0 0 为0 7～ 0 8时添加IPTG诱导

极端嗜热菌海栖热袍菌木聚糖酶B的克隆和表达

极端嗜热菌海栖热袍菌MSB8(ThermotogamaritimaMSB8)能够利用木聚糖代谢 ,并具有两个产木聚糖酶的基因 .本研究首次克隆和在大肠杆菌中表达海栖热袍菌MSB8的第 2个木聚糖酶基因即xynB基因 .以基因组DNA为模板 ,根据xynB基因的全序列设计了两对引物 ,在合适的PCR反应条件下有效地扩增出了xynB基因片段 .选用pET2 8a(+)表达载体 ,NcoI-HindⅢ酶切位点并编码了羧基端 6×His标签的阳性克隆表达成可溶且具有生物活性的蛋白质 .xynB结构基因由 10 4 4对碱基组成 ,编码 347个氨基酸 .根据已知木聚糖酶蛋白质氨基酸的同源性分析 ,XynB与T .sp.strainFjSS3-B .1的XynA的同源性最大 ,为 85 % ,与T .neapolitana的XynB同源性次之 ,为 82 % ,与其它木聚糖酶的同源性小于 4 3% .另外 ,XynB属于F/ 10族木聚糖酶 ,且含有单一功能区 .表 3图 3参

海栖热袍菌极端耐热木聚糖酶B的提纯

克隆并在大肠杆菌中表达的海栖热袍菌的 xyn B基因 ,其表达产物木聚糖酶 B的 C 末端带有 6×His标签 ,研究了这种基因重组酶的提纯方法。通过对粗酶提取液的热变性处理 ,Ni NTA亲和柱层析和离子柱层析 ,最终得到了电泳纯的木聚糖酶 B,提纯倍数 4 4.4 ,得率 11。SDS PAGE法测定木聚糖酶 B的相对分子质量为 4 2 ku,与理论推算值 4 2

海栖热袍菌耐高温β-甘露糖苷酶基因的克隆及表达

以海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8基因组DNA为模板,克隆得到β-甘露糖苷酶基因(man2).测序分析表明,该基因全序列为2358bp,编码785个氨基酸,分子量约为92×103.根据蛋白质氨基酸的同源性分析,该β-甘露糖苷酶与新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)Man2(accession No.AAK52304.1)的同源性最大,达到80%.将此基因连接至表达载体pET-28a(+)并转化到大肠杆菌BL21细胞中,经IPTG诱导,β-甘露糖苷酶活力达5.96U/mL.粗酶的温度稳定性分析表明,该酶的热稳定性好,90℃处理10min,活力回收率65%,具有重要的工业应用前景.

重组海栖热袍菌极耐热甘露聚糖酶的纯化和性质研究

研究了海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8甘露聚糖酶基因(TM_1227)的克隆、重组酶的纯化和性质。该基因全序列2010bp,编码669个氨基酸,分子量为76.827kD。根据氨基酸同源性分析,该β-甘露聚糖酶与Thermotogasp.RQ2来源的β-甘露聚糖酶(GenBank登录号ACB09927.1)同源性最高,为99%。重组转化子经IPTG诱导酶比活可达39.7U/mg蛋白。粗酶液经金属亲和层析,得到电泳纯甘露聚糖酶。以槐豆胶为底物时,该酶的最适反应温度和pH分别为95°C和pH8.0,85°C处理30min酶活保存50%以上,很有潜力用于高温、偏碱性的造纸工业。对椰子甘露聚糖和槐豆胶的主要水解产物是不同聚合度的甘露寡糖,几乎没有单糖生成,适合生产低聚甘露糖。

需氧恶性杆菌和海栖热袍菌基因组中第一ATG规则的检验

将第一ATG规则用于需氧恶性杆菌(A.pernix)和海栖热袍菌(T.maritima)两类细菌基因组中,用已知的ORF(包含已知基因编码区)进行检验,其结果对以ATG起始的ORF序列,正确率分别为100%,89.9%;并对两种细菌基因组中L-Ter到第一ATG之间的距离作了相应的统计分析,结果表明:非ATG起始的ORF中,L-Ter到第一ATG之间的平均距离是以ATG起始的4至5倍,很可能是非ATG起始的ORF的一个重要序列特征;分析了两种细菌终止密码子在L-Ter和Ter中的使用频率,发现在Ter中终止密码子使用的偏置程度比在L-Ter中大.

海栖热袍菌电转化技术的研究

[目的]对海栖热袍菌电转化技术进行研究。[方法]采用不同参数即不同的方型电脉冲参数、指数衰退型电脉冲参数和高电压电击参数对海栖热袍菌感受态细胞进行电转化,得到的转化子进行PCR验证。[结果]试验中发现以150 V的低压方形电脉冲,室温厌氧条件下电击25 ms、1次,有利于T.maritima MS8的转化,但这种以整合质粒进行的转化效率极低。[结论]为提高T.maritima MS8的基因转化效率奠定了基础。

海栖热袍菌极耐高温木聚糖酶B的化学修饰和活性中心

分别用NBS、DTNB、Phenylgloxal、PMSF、WRK等对海栖热袍菌极耐高温木聚糖酶B进行化学修饰 .结果表明 ,酶蛋白分子上的色氨酸和谷氨酸 (或天冬氨酸 )残基是维持酶活性的必需基团 .半胱氨酸、精氨酸、丝氨酸及组氨酸残基均不处于酶活性中心 .而修饰酶热稳定性测定结果是 ,羧基对稳定性起重要作用 .通过测定修饰酶的假一级常数 ,得到一个色氨酸残基和一个谷氨酸 (或天冬氨酸 )残基为极耐高温木聚糖酶B所必需 .在加入少量底物后 ,极耐高温木聚糖酶B的最大荧光发射峰从天然状态下的 336nm处红移至 345nm ,且峰强度下降 .这表明色氨酸残基位于酶蛋白表面 .图 7表 2参

海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E·coli中的高效表达

为解决密码子偏好性差异造成的表达水平低下问题,采取了3种手段提高海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E.coli中的表达水平。用PCR方法从海栖热袍菌(Therm otoga maritima)基因组DNA中扩增出胞外α-淀粉酶A的完整基因amyA,插入表达载体pET-20(b)中构建成质粒pET-amyA;运用基因工程手段将amyA基因富含稀有密码子的信号肽进行切除,将不含信号肽的amyAⅠ基因插入pET-20(b)中构建成质粒pET-amyAⅠ;用PCR法从大肠杆菌基因组中扩增出argU基因,插入pET-amyAⅠ中构建成质粒pET-amyAⅡ。将重组质粒分别转化到E.coliJM109(DE3),并将重组质粒pET-amyAⅠ转化E.coliBL21-CodonP lus(DE3)-R IL。通过IPTG诱导测酶活性:在E.coliJM109(DE3)中表达的重组酶(pET-amyA)、(pET-amyAⅠ)、(pET-amyAⅡ)的酶活分别是1658.0 U/mL、6721.7 U/mL、8904.5 U/mL,在E.coliBL21-CodonP lus(DE3)-R IL中表达的重组酶(pET-amyAⅠ)的酶活是13867.7 U/mL。表明通过这些手段能大幅提高T.maritima胞外α-淀粉酶在E.coli中的表达水平。

海栖热袍菌木聚糖酶B的分子改造、高效表达及其在啤酒中的应用

研究海栖热袍菌木聚糖酶B(TmXynB)的定向进化、高效表达和应用。构建突变文库后经两轮筛选,获得一个在酸性高温下具有高比活力的突变体(mTmXynB)。突变体mTmXynB的最适pH值和最适温度为5.5和90℃,较野生型的最适pH值和最适温度分别下降了0.5和10℃,对小麦阿拉伯木聚糖的比活力由529 U/mg提高至1565 U/mg。序列比对表明,mTmXynB中3个氨基酸发生突变,分别为Asn91Ser、Trp129Arg和Arg143Glu。经定点突变实验,Arg143Glu通过改变局部蛋白表面的电荷分布提高了其耐酸性,Trp129Arg通过打破疏水平台降低了酶的最适温度,而Asn91Ser可能通过改变底物结合位点Trp89的构象提高该酶的催化活力。进一步将mTmXynB表达至毕赤酵母,经高密度发酵酶活力达18000 U/mL。突变体mTmXynB和野生型TmXynB分别添加至麦芽糖化过程中,结果表明mTmXynB在150 U/g麦芽添加量时效果最好,可降低45%的过滤时间和8.7%的料液黏度。而TmXynB在600 U/g麦芽添加量时效果最好,分别降低39%和8.1%的过滤速度和料液黏度。因此,突变体mTmXynB在啤酒工业中具有很好的应用前景。

海栖热袍菌葡萄糖异构酶基因xylA的克隆、表达及酶学性质

海栖热袍菌（Thermotoga maritima）是嗜极端高温的厌氧细菌，其产生的葡萄糖异构酶由于其出色的耐热性有着潜在的工业应用价值。由于海栖热袍菌苛刻的培养条件导致其葡萄糖异构酶产量较低。通过PCR方法克隆编码zmaritimaMSB8葡萄糖异构酶基因xylA，构建重组质粒pHsh—xylA，转入EscherichiacoliJMl09，通过热激诱导表达。通过热处理和离子交换层析纯化两步得到电泳纯的酶制品，纯化倍数和回收率分别为8．02和49．02。对酶学性质研究表明，该重组酶为金属离子激活性酶，Mg^2＋，Co^2＋对相对酶活有很强的激活作用，其最适pH为7．0，最适反应温度为95℃，且在pH6-8之间有着较好的稳定性，在95℃下半衰期长达5h以上。以葡萄糖为底物时的表观Km和Kmax、分别为105mmol／L和45．2mol／min·mg。

海栖热袍菌耐热葡聚糖内切酶EG12B基因的克隆表达及酶学特性分析

为了促进家畜对纤维素饲料的消化吸收,提高饲料利用率,改善畜产品品质,本研究基于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的基因组信息,通过筛选获得一段具有潜在耐热特性的葡聚糖内切酶基因(EG12B)序列。经删除预测信号肽和优化密码子偏好性,运用基因工程手段将成熟肽EG12B基因克隆至原核表达载体pET-28a中,成功构建了重组表达质粒pET28-EG12B。转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经重组菌发酵培养及IPTG诱导表达,实现了EG12B在大肠杆菌系统中的胞内高效表达,表达量约占全细胞总蛋白的36%。通过细胞超声破碎、镍离子亲和层析以及热处理分离纯化,获得了电泳纯重组酶EG12B。酶学特性分析表明,该重组酶的最适反应温度为90℃,最适反应pH为5.2,在70℃下保温1 h,酶活力基本维持不变。表明葡聚糖内切酶EG12B具有优越的耐热性和良好的热稳定性,为进一步作为饲料添加剂用于纤维素饲料关键技术的开发和畜产品品质的提升奠定了理论基础。

海栖热袍菌磷酸戊糖变位酶基因克隆表达及发酵条件优化

目的从嗜热微生物海栖热袍菌中克隆磷酸戊糖变位酶基因,实现其在大肠杆菌中的表达。方法以海栖热袍菌基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增获得编码磷酸戊糖变位酶蛋白基因(ppm),连接到具有T7强启动子的p ET-32a质粒中,构建重组工程菌E.coli BL 21(DE3){p ET-32a-Tmppm}。通过Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验和Box-Behnken试验方法优化工程菌发酵条件,构建回归方程。结果双酶切鉴定、测序分析和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证实海栖热袍菌磷酸戊糖变位酶基因可在工程菌中表达。最佳发酵条件为诱导种龄0.6,诱导温度22.5℃,诱导时间13 h,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.45 mmol/L,培养基初始p H 7.6,接种量2.25%。结论发酵条件优化后磷酸戊糖变位酶表达量大幅提高。实验结果为该酶的性质研究和应用提供了支撑。

海栖热袍菌α-葡萄糖苷酶基因aglA的克隆、表达及酶学性质

主要研究了在大肠杆菌中克隆和表达海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的一个α-葡萄糖苷酶(TM1834)。通过PCR方法克隆编码T.maritima的一个α-葡萄糖苷酶基因aglA,构建重组质粒pHsh-AglA,电击转化Escherichia coli JM109,通过热激诱导高效表达。SDS-PAGE检测出蛋白相对分子质量约55 000,经热处理,阴离子交换层析和疏水层析纯化后的α-葡萄糖苷酶最适反应温度为90℃,最适反应pH为7.5,在pH 6.5～8.5,温度65～100℃之间酶活仍达到50%以上。在辅助因子NAD+,Mn2+和还原剂DTT的存在条件下达到最高酶活。

海栖热袍菌鞘的提纯及其成分和敏感性

海栖热袍菌(Thermotoga maritima MS8)是一种极端嗜热厌氧菌,细胞始终被一种鞘结构所包围,并且鞘在细胞两端呈现气囊状.通过膜截留法、透析法和等密度梯度离心法对鞘进行提纯,其中密度梯度离心法提纯的效果较理想.通过TLC分析,鞘由糖、蛋白、脂类组成,偏向膜的性质.通过对鞘的敏感性研究,发现蛋白酶K可以帮助鞘形成孔洞,并且仍可保留细胞的完整性,这可能有助于进一步促进T.maritima MS8基因转化工作的发展.

枯草芽孢杆菌分泌表达极耐热木聚糖酶及其酶学性质

为将海栖热袍菌极耐热木聚糖酶基因xyn B（Gen Bank登录号AY340789）在枯草芽孢杆菌Bs916中进行异源分泌表达,并阐明工程菌分泌重组木聚糖酶的酶学性质。克隆极耐热木聚糖酶基因xynB,将其与罗克霉素启动子融合,构建融合质粒载体pXYNB2,将其转化到枯草芽孢杆菌Bs916中,获得重组枯草芽孢杆菌（Bs916/p XYNB2）,并对重组芽孢杆菌分泌表达的极耐热木聚糖酶的酶学性质进行了研究。SDS-PAGE法测定重组枯草芽孢杆菌分泌的蛋白在相对分子质量43 000处有明显的蛋白表达条带。重组木聚糖酶的最适反应p H值为5.0-5.8,重组木聚糖酶的最适反应温度大于或等于100℃,重组极耐热木聚糖酶在pH值4.6-7.8比较稳定,重组木聚糖酶的温度稳定性在90℃下保温2 h后残存酶活83%。可见,生防枯草芽孢杆菌Bs916能有效分泌表达极耐热木聚糖酶,为以后构建多种纤维素和半纤维素在其中的协同表达,拓宽其碳源利用范围奠定基础。

极耐热性阿拉伯糖苷酶基因的表达、纯化及酶学性质研究

采用PCR从海栖热袍菌 (Thermotogamaritima)克隆出编码极耐热稳定性阿拉伯糖苷酶基因 ,以pET 2 0b为表达质粒 ,与其C末端 6个组氨酸标签序列融合 ,在大肠杆菌中得到高效表达。基因表达产物通过热处理和亲和层析柱纯化后 ,酶纯度达电泳均一。纯化重组酶稳定性检测表明 ,阿拉伯糖苷酶活性最适作用温度和最适作用pH分别为 90～ 95℃和pH 5 .0～ 5 .5 ,在pH 4 .2～ 8.2之间酶活力稳定 ,95℃的半衰期为 4h ;SDS PAGE测得酶的分子量为 5 6 .5 7kD ,与理论推算值相吻合。在所测定的底物中 ,阿拉伯糖苷酶仅对对硝基苯 阿拉伯呋喃糖苷 (pNPAF)有专一性水解作用 ,其动力学参数Km 值为 0 18mmol L ,Vmax为 139μmol min·mg。

嗜热真菌纤维素酶的CBD与海栖热袍菌的纤维素酶融合表达

将嗜热真菌毛壳菌纤维素酶Cel7A的纤维素结合结构域编码区与极端嗜热厌氧菌海栖热袍菌的纤维素酶CelB基因进行融合,构建重组质粒pHsh-CBD-CelB,并在大肠杆菌中表达。对融合蛋白进行纯化,通过热处理和离子交换层析,纯化到的融合蛋白SDS-PAGE电泳图谱显示为单一条带。对融合蛋白的特性研究,结果表明融合蛋白降解CMC的最适反应温度为90°C,结晶纤维素吸附实验表明该融合蛋白具有结合结晶纤维素的能力,并且融合蛋白降解CMC与结晶纤维素的能力得到提高。