结构光照明显微镜的实验教学设计

结构光照明显微成像技术具有超高分辨率、对样品光损伤小、拍摄速度快等优点,被广泛用于细胞内精细结构、蛋白精确定位、活细胞动态观测等科学研究中。在实验教学中加入大型精密仪器结构光照明显微镜DeltaVision OMX SR的内容将增强教学的实用性和应用性。在实验教学设计中重视理论课程教学,通过小组教学、开放性实验等方式培养学生动手和独立思考的能力,培养学生的创新意识,帮助学生提升综合实验能力。

结构光照明显微镜照明系统的设计与仿真

结构光照明显微镜是一种结合结构照明技术与宽场成像原理实现表面形貌测量的新工具。为方便调节物面光强和照明视场大小,并保证结构光条纹的均匀性,基于科勒照明原理提出利用成品透镜与无限远物镜,并结合数字微镜阵列(DMD)设计结构光照明显微镜照明系统的方法。通过Zemax软件建立设计模型进行仿真分析,验证了该方法设计的结构光照明系统投射到物面光照的均匀性。

结构光照明显微镜重建算法研究进展

作为现代超分辨成像技术的早期组成部分,结构照明显微镜(SIM)已经发展了近20年。其近期在活细胞中实现了高达60 nm和564 Hz的最佳时空分辨率组合,但也存在一些源于内在重建过程的缺点。本文综述了SIM技术的最新进展,包括超分辨率(SR)重建算法、性能评估及SIM与其他成像技术的集成,以便为生物学家提供实用指导。

结构光照明超分辨光学显微成像技术与展望

结构光照明显微镜(Structured Illumination Microscopy,SIM)通过结构化照明在频率域以空间混频的方式将物体高频信息载入光学系统的探测通带内实现突破衍射极限的超分辨光学显微成像。SIM凭借其较低的激发光强、对荧光染料的非特异性需求以及快速的宽场成像优势已成为活细胞超分辨光学显微成像方面应用最多的技术。本文系统回顾了SIM的技术进展,对SIM的基本原理与实现方法进了详细的分析,重点介绍了本课题组研发的基于光谱分辨的单光子激发超分辨显微镜和结合自适应光学的双光子激发超分辨显微镜这两种最新的SIM技术,最后简要讨论了SIM技术在生物成像中的应用及未来发展方向。

结构光照明光切片显微图像的高保真重构方法

光切片图像的质量与使用的重构算法直接相关,传统的均方根算法虽然简洁,但在原始图像信噪比和条纹对比度不高时重构效果不佳,得到的三维重建结果并不理想。针对该问题,提出一种去背景和去卷积相结合的光切片方法。与传统均方根算法相比,该方法能有效减少残留条纹,提高微小细节的可见性。实验搭建了一套基于数字微镜器件的结构照明显微系统,以小鼠肾脏细胞、牛肺动脉内皮细胞等为样品进行了光切片实验。实验结果表明,该方法能获得更好的光切片和三维成像效果。

结构光照明显微空间域超分辨图像重建研究

以π/2相移间隔的结构光照明显微图像为输入,通过图像差分、数学推导及简化构建一个数学模型,在空间域直接解析得到超分辨图像。理论验证该模型可将传统显微的横向分辨率提高1倍,并可减少离焦背景干扰。在基于数字微镜器件的结构光照明显微系统中,对荧光微球及牛肺动脉内皮细胞进行空间域超分辨重建实验,验证了算法的有效性。获得的超分辨效果与频域重建法相近,但图像重建速度快约5倍。该研究有助于扩展结构光照明显微的应用范围,对活细胞和组织的长时间在体监测具有良好的应用潜力。

结构光照明层析多样性表面形貌测量

围绕散射表面和复杂微结构表面形貌高精度测量需求,对基于结构光照明的表面形貌测量技术与系统进行了研究,设计了基于科勒照明结合数字微镜器件调制的具有良好结构光对比度和均匀性的结构光照明光学系统,提出了基于高斯曲线插值的虚拟狭缝SlitMask结构照明共焦层析算法与基于迭代高斯拟合的峰值提取重建算法,建立了结构光照明表面形貌测量系统,利用单刻线对系统进行准确性与重复性测试,结果表明相对示值误差为1.87%,重复测量结果的标准差为0.0014μm。对玻璃多刻线样板和车削表面进行测试,验证了本系统不仅可用于反射表面的测量,还对散射表面具有较好的测量能力。

结构光照明超分辨荧光与旋转相干散射双模态成像

超分辨荧光成像方法可以对不同亚细胞器进行纳米尺度的结构观测,其特异性来源于荧光标记,无标记成像方法避免了染色过程对样品本身带来的可能影响,但是丧失了特异性,因此二者具有互补性,各自有其独特的优势和应用范围。在同一仪器集成两种不同的成像技术可拓宽其应用场景。结合结构光照明超分辨显微技术(SIM)和旋转相干散射显微成像技术(ROCS),搭建了一套可以在两种模式之间任意切换的双模态显微成像系统。使用荧光微球标准样品和PANC-1胰腺癌细胞样品对系统进行测试,在SIM和ROCS通道分别得到了111 nm和145 nm的空间分辨率,并且可以达到100 Hz左右的成像速度。该系统具备高时空分辨率的荧光和无标记成像功能,为细胞生物学的研究提供了更多的便捷与可能。

基于激光干涉的结构光照明超分辨荧光显微镜系统

结构光照明荧光显微术(SIM)是一种可突破阿贝衍射极限的宽场显微成像技术,因其非侵入、成像速度快及光损伤小等优点在生物医学研究中具有广泛的应用前景。从结构光照明显微成像系统基本原理出发,分析了超分辨图像重构算法原理、重构图像中伪影来源及优化方法;结合研制的线性/非线性结构光照明显微镜,详细讨论了基于激光干涉的SIM成像系统光机结构。重点讨论了系统的同步时序设计和光路中的几个关键技术问题。设计对比实验验证了自主开发的SIM重构算法的可靠性,并基于研制的线性SIM系统开展细胞骨架的成像实验。最后,对SIM技术在生物上的发展和应用提出展望。

用于细胞脂滴超分辨荧光成像的有机荧光探针研究进展

脂滴是真核细胞中必不可少的一种球形细胞器,与很多细胞生理学过程息息相关。荧光成像技术是观察研究脂滴最有力的工具之一。受光学衍射极限的限制,传统的宽场以及共聚焦显微镜所能达到的成像分辨率约为250 nm左右,这对于观测小脂滴,尤其是新生脂滴(尺寸约30~60 nm)来说是远远不够的。在这种情况下,近年来新兴的各种能够打破衍射极限的超分辨荧光显微镜(如受激发射损耗显微镜、结构光照明显微镜以及光激活定位显微镜等)逐渐吸引了科研人员的兴趣。为了得到高分辨率脂滴荧光图像,除了上述超分辨显微镜之外,还需要具有与之相匹配的高性能荧光探针。本文将简要介绍这几种超分辨显微镜的工作原理,讨论其对荧光探针光物理性质的特殊要求,并进一步系统总结脂滴超分辨成像荧光探针的研究进展。与此同时,本文将分析对比不同超分辨显微镜在脂滴荧光成像方面的优势与不足,并对其发展趋势进行展望。

活细胞超灵敏结构光超高分辨率显微镜

由于超分辨率显微镜需要额外的照明来换取更高的空间分辨率,导致了现在的超分辨率显微镜存在时间分辨率低和记录时间短两个问题。虽然结构光照明显微镜在获得超分辨率图像和所需要光子数方面有一个更好的平衡,相比其他超分辨率技术更有优势,但是传统的结构光照明显微镜的重构方式在信噪比比较低的时候会明显存在伪影。在本文中,我们利用生物样本在xyt三维空间的连续性作为先验知识,发展出了基于海森范数的正则化方式,并用来重构出伪影更少的结构光照明显微镜的超分辨率图像。与维纳反卷积这个经典的重构算法相比,海森反卷积只需要在成像时百分之十的光子数就可以达到同样的超分辨图像的重建效果。在激光强度为8—250W/cm2的情况下,海森结构光照明显微镜在活细胞中对快速分泌的囊泡、内质网等进行空间分辨率达到88nm,时间分辨率达到188Hz的超分辨率图像重建。全新的时间分辨率和空间分辨率使得我们可以在囊泡分泌过程中观测到新的中间态,观察到了囊泡靠近细胞膜的过程,以及之后的分泌小孔进一步扩大的过程这两个囊泡分泌过程中中间状态。使用基于海森正则项的结构光照明显微镜,我们可以在活细胞中观测到清晰的线粒体嵴。以及嵴结构在线粒体融合,线粒体分裂过程中的动态活动,甚至是单个没有发生融合或者分裂的线粒体内的嵴的融合的过程。

共聚焦超分辨率成像与SIM超分辨率成像在蒿草生物组织样本荧光成像中的使用价值分析

目的研究分析共聚焦超分辨率成像与SIM超分辨率成像在蒿草生物组织样本荧光成像中的使用价值。方法使用激光扫描共聚焦显微镜对蒿草生物组织样本进行荧光成像和使用结构光照明显微镜对蒿草生物组织样本进行SIM超分辨率荧光成像。实验分为三组。(1)使用激光扫描共聚焦显微镜对蒿草组织样本共聚焦普通成像;(2)使用激光扫描共聚焦显微镜的超分辨率成像模块对蒿草组织样本超分辨率成像;(3)使用结构光照明显微镜对蒿草组织样本SIM超分辨率成像。结果激光扫描共聚焦显微镜不仅可获取蒿草组织样本的不同倍数共聚焦普通图像,而且可获取蒿草组织样本的共聚焦超分辨率图像;结构光照明显微镜可获取蒿草组织样本的SIM超分辨率荧光图像。结论激光扫描共聚焦显微镜和结构光照明显微镜均可对生物组织样本进行超分辨率成像。共聚焦超分辨率成像图像清晰度较高,色彩对比度明显,而SIM超分辨率成像具有显示组织样本局部的超微结构细节更加突出的特点。

高速超分辨结构光照明显微的关键技术及应用

光学显微成像技术无论是在临床诊疗还是在基础科学研究上都发挥着重要的作用。伴随着新型荧光探针、光学控制、探测器件的不断发展,超分辨光学显微技术突破了传统光学衍射极限的限制,为现代生物医学研究提供了新的工具。在超分辨显微成像技术中,结构光照明显微镜(SIM)通过空间编码的结构光照明样品,将样品部分超出衍射极限的高频信息调制到低频中,从而通过光学系统实现超分辨成像。SIM具有成像速度快,光漂白和光毒性弱以及对荧光染料的非特异性需求等优点,被广泛应用于活细胞超分辨光学显微成像。本文回顾了SIM技术的重要原理与技术进步,重点介绍了SIM硬件设计与图像重构算法中关键的实验要点与技术难点,列举了现阶段SIM在生物成像中的部分应用,探讨了SIM未来的发展方向。期望本文能为SIM的设计和使用者提供一定的指导。

结构光照明超分辨成像图像重建算法研究进展

结构光照明超分辨显微镜(SIM)已成为分子细胞生物领域进行活细胞动态过程实时观测的重要工具。SIM作为一种计算成像方法,其成像质量很大程度依赖于超分辨图像重建算法的优劣。近5年来,陆续报道了近10种针对不同条件下的SIM超分辨成像开源算法,基于深度学习的SIM重建算法也层出不穷。理解各算法的原理及异同从而在实际成像实验中选择合适的成像算法,成为了SIM成像技术应用的重要环节。首先介绍了SIM成像的原理;然后分别从结构光参数估计、频谱优化的重建算法、基于深度学习的重建算法三方面介绍了SIM重建算法的最新进展,为SIM研究者及用户提供参考;最后总结了高质量SIM超分辨图像重建仍需解决的问题。

“光学显微成像技术”专题前言

显微成像技术从第一台复式光学显微镜诞生以来就已成为人类探索复杂微观世界的重要手段,是一个拥有悠久历史而又充满无限活力的研究方向。经过四个多世纪的长期发展,已先后发明了一系列具有不同光学对比度机制的常规光学显微镜(如明场显微镜、暗视显微镜、偏光显微镜、相衬显微镜、微分干涉相衬显微镜、荧光显微镜等);具有层析功能的显微镜(如激光扫描共聚焦显微镜、光学相干层析显微镜、光片照明荧光显微镜、衍射层析显微镜等);利用非线性光学效应的显微镜(如双光子显微镜、二次谐波显微镜、拉曼散射显微镜等);突破理论衍射极限的超分辨显微镜(如单分子定位显微镜、受激辐射损耗显微镜、结构光照明显微镜、近场显微镜等)。

可逆饱和光转移过程的荧光超分辨显微术

基于可逆饱和光转移过程的荧光超分辨显微技术,从原理上打破了原有的光学远场衍射极限对光学系统极限分辨率的限制,在生物、化学、医学等多个学科拥有广泛的应用前景。回顾了近年来超分辨显微研究的历史,综述了目前常见的几种基于可逆饱和光转移过程的荧光超分辨显微方法,详细描述了各自的技术特点并对比了其优缺点,阐述了相关领域内最新的研究工作进展。

快速宽场三维显微技术研究进展

激光扫描显微镜通过扫描高度汇聚的激光焦点可以获得样品的三维图像,而激光扫描显微镜时间分辨率低、光毒性大的缺点限制了其在活体快速三维成像等领域中的应用。近年来具有三维成像能力的宽场显微镜技术逐渐成为三维成像领域的研究热点。聚焦形貌恢复技术、结构光照明显微技术以及深度学习辅助三维成像是三种基于宽场成像的快速三维成像技术,通过硬件提升和软件辅助的方式,提高了宽场显微镜的三维成像能力。分别介绍了它们的原理、优缺点、最新的研究进展与应用,最后对宽场三维显微技术的未来发展进行了总结与展望。