海洋低温碱性蛋白酶的急性毒性研究

应用酶工程技术 ,得到在室温下有较高酶活力的海洋低温碱性蛋白酶。为对海洋低温碱性蛋白酶进行安全性评价 ,作者应用小鼠和大鼠急性毒性试验及最大耐受量 ( MTD)测定 ,观察海洋低温碱性蛋白酶对小鼠 1次口服后产生的急性毒性反应和大鼠完整皮肤短期内接触海洋低温碱性蛋白酶所产生的毒性反应。结果表明 ,小鼠 1次口服海洋低温碱性蛋白酶的 MTD>2 0 g/kg为实际无毒物 ,其中毒的靶器官是肝脏 ,未见大鼠经皮的急性毒性反应。

海洋低温碱性蛋白酶的刺激性研究

探究海洋低温碱性蛋白酶的刺激性 ,并为其应用提供实验依据。作者应用新西兰大耳白兔 ,以 4 0 %、2 0 %和 5‰浓度的海洋低温碱性蛋白酶进行皮肤急性刺激试验 ,5‰海洋低温碱性蛋白酶的皮肤多次刺激性试验 ,1‰的海洋低温碱性蛋白酶的兔角膜刺激性试验 ,评价其安全性。结果表明 ,5‰和 2 0 %海洋碱性蛋白酶单次应用实验皮肤未出现红斑和水肿 ,对皮肤无刺激性。 4 0 %海洋低温碱性蛋白酶液对皮肤有中度刺激性。皮肤病理学显示 5‰的海洋低温碱性蛋白酶液未见皮肤的慢性刺激反应 ,皮肤结构完整、层次清晰。

海洋低温碱性蛋白酶的皮肤变态反应研究

利用酶工程技术制得的海洋低温碱性蛋白酶 ,主要用于加酶的洗涤剂 ,在室温下有较高的酶活力。为确保海洋低温碱性蛋白酶使用的安全性 ,并为其应用提供实验依据 ,本文以豚鼠为受试动物 ,进行皮肤致敏反应试验。结果表明 ,经致敏接触和激发接触 ,2 ,4 -二硝基氯苯组 ( DNCB)皮肤最大平均反应值为 3.3,致敏率为 10 0 %。海洋低温碱性蛋白酶组皮肤最大平均反应值为 0 .0 5,致敏率为5%。

海洋低温碱性蛋白酶亚慢性毒理学研究

应用大鼠经口、经皮肤亚慢性毒性试验 ,对海洋低温碱性蛋白酶毒理学进行研究。 12 0只Wistar大鼠 ,随机分为 6组 :对照组 ,海洋低温碱性蛋白酶 1.2 g/ kg(经口 ) ,1.2 g/ kg、0 .135g/ kg、0 .0 15g/ kg(经皮 )和 1.2 g/ kg(经皮追踪组 ) ,用药周期 90 d,追踪组增加 2 8d观察。记录和检测大鼠的一般状况和体质量增长、脏器系数、血常规、凝血时间、肝肾功、部分血液生化和离子浓度及病理检查。结果表明 ,海洋低温碱性蛋白酶各组 (经皮、经口 )大鼠的各项指标与对照组比较均未见明显异常 ( P均 >0 .0 5) ,提示大鼠能耐受长期给予 1.2 g/ kg(经皮、经口 )

壳聚糖固定化海洋低温碱性蛋白酶YS-80-122的研究

以壳聚糖为固定化载体,采用吸附交联法,以戊二醛为交联剂,对海洋低温碱性蛋白酶YS-80-122进行固定化。通过单因素和正交试验优化得到最佳固定化条件为pH7·0,戊二醛终浓度0·2%,吸附时间50min,酶载体比例40mg/g,交联时间16h,交联温度10℃,固定化酶酶活回收可达47·52%。固定化酶和游离酶的最适作用温度均为30℃,最适作用pH分别为9·0和10·0,相比游离酶,固定化酶可在更宽的温度和pH范围内发挥高活性,且其温度和pH稳定性得到显著提高。室温下经冷冻干燥的固定化酶贮存90d后活性基本保持不变,贮藏半衰期约为190d。以酪蛋白为底物,重复使用7次后酶活仍保留有79·2%,操作半衰期约为21次使用率。

海洋低温碱性蛋白酶的遗传毒理学研究

应用 NIH纯系小鼠骨髓细胞微核试验和染色体畸变试验 ,探究海洋低温碱性蛋白酶的遗传毒性作用及对人类的潜在危害。观察并计数嗜多染红细胞 ( PCE)与正红细胞 ( NRBC)的比值、微核率 ;染色体的畸变类型和畸变率 ,检测海洋低温碱性蛋白酶的诱变作用。结果表明 ,皮下注射环磷酰胺的小鼠 ,P/ N比值 <1,微核率为 2 2 .97‰ ,染色体畸变率为 18.32 % ,与生理盐水 ( NS)对照组比较差异极显著 ( P<0 .0 1) ,而海洋低温碱性蛋白酶各组小鼠微核率均 <4‰ ,染色体畸变率为 0 .19%～0 .2 5% ,与 NS组比较无显著性差异 ( P>0 .0 5)。未见海洋低温碱性蛋白酶各组对小鼠骨髓细胞的遗传毒性。

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶性质鉴定

对黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130菌株产低温碱性蛋白酶的理化性质研究表明 ,该酶由 2 56个氨基酸组成 ,分子量为 330 0 0 Dar,等电点 p I为 9.4 5,米氏常数 Km为 5× 10 -3 m mol/ L;酶的最适作用p H范围为 9.5～ 10 .5,最适作用温度 30℃ ,具有一定的抗氧化稳定性。Ca2 +、Mn2 对酶有激活作用 ,而 Hg2 +、Ag+对酶有抑制作用。 DFP、NBS严重抑制酶的活性 ,而同时该酶也能被 EDTA抑制。结果表明该低温碱性蛋白酶为一新型的丝氨酸蛋白酶。

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶的制备工艺研究

对黄海黄杆菌所产低温碱性蛋白酶的工业生产技术和电泳纯级试剂酶的分离纯化工艺进行了实验。按照设计的中试生产技术 ,每吨发酵液可得酶粉 2 0 kg,粗酶比活大于 2 0× 10 4 U/ g;同时运用一系列纯化手段和条件 ,制备出电泳纯级试剂酶 ,纯化过程蛋白回收率在 7%左右 ,活性回收率在60 %以上 ,比活性也稳定在 1.9× 10 3U/ mg以上 ,激光灰度扫描结果试剂酶纯度大于 99% ,可以作为试剂酶满足进一步生物学研究和实际应用。其产品质量和制造工艺均达到了中试放大规模的要求。

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶发酵过程动力学研究

应用自动控制发酵设备 ,对黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130碱性蛋白酶发酵动力学和工艺条件进行了研究。从基本的动力学概念和方程出发 ,通过分批发酵试验摸索了黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130生长与代谢的基本规律 ,证明了发酵过程中低温碱性蛋白酶的形成为生长部分关联型。采用补料分批培养方法限制生长基质浓度 ,确定其一系列参数值 。

海洋低温酶酶解贻贝的动力学研究

用海洋低温碱性蛋白酶在温度30℃、pH为10.00条件下,对贻贝肉蛋白进行酶解。用相关的动力学模型推导公式与实验相结合,研究其酶解机制。结果表明:在反应过程中存在着酶失活现象,以及底物存在着促进反应进行和抑制酶活性的双重作用;得到的水解度动力学方程及水解速率方程,结果表明酶催化水解速率随水解进程呈指数递减;失活常数k_d=13.989 min^(-1);动力学模型计算值与实验值平均相对偏差为5.80%,此结果说明该动力学模型与实验测量结果有很高的吻合性。

22种海水鱼中ACEI的制备及其化学修饰

以取自中国黄海的22种鱼类为研究对象,测定其鱼肉组织上清液的酶解物对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制作用。从6种商业用酶和1种新型海洋低温碱性蛋白酶(MLAP)中,筛选出MLAP作为酶解制备ACEI的理想水解酶。以该酶水解上述22种海水鱼鱼肉组织上清液,并将水解液经Sephadex G-25凝胶层析和DEAE Sepharose阴离子交换层析,得到ACEI纯品。测定各类ACEI体外抑制ACE的活性发现,这22种海水鱼中以鱼(Engraulis japonicus)所产A-CEI活性最高,其余鱼类无显著差异。以鱼制备血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI-22),并对ACEI-22作进一步研究,结果发现,ACEI-22对自发性高血压大鼠(SHR)有降压效果,但不显著;ACEI-22经聚乙二醇化学修饰后,修饰率为68%,且给药SHR后,大鼠收缩压显著降低,与相同条件下同剂量的卡托普利的降压效果相当。故聚乙二醇修饰的A-CEI-22可有效地降低SHR的血压。[中国水产科学,2006,13(1):100-105]