海洋假单胞菌碱性蛋白酶的纤溶和溶栓作用研究

目的:为进一步确认海洋假单胞菌碱性蛋白酶(MPAP)的纤溶性质,并观察其抗栓作用。方法:通过体外试凝块实验,观察MPAP对纤维蛋白和纤维蛋白原的降解作用;建立家兔肺动脉血栓模型,观察MPAP的溶栓作用以及对组织型纤溶酶原激活剂(t—PA)和组织型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI)纤溶功能的影响。结果:MPAP有直接降解纤维蛋白和纤维蛋白原的作用,而无纤溶激酶活性;MPAP能明显溶解肺动脉血栓,MPAP用药后t—PA/PAI明显升高。结论:MPAP具有明显的溶栓和提高纤溶系统活性的作用。

海洋假单胞菌碱性蛋白酶对实验性家兔股动脉血栓的溶解作用

目的研究海洋假单胞菌碱性蛋白酶(MPAP)对体内血栓的溶解作用及对凝血功能的影响。方法建立家兔股动脉血栓模型,股动脉造影观察用药后股动脉血栓的溶解情况,通过测定PT,TT,KPTT及Fbg含量,评估MPAP对家兔凝血和纤溶功能的影响。结果结果显示,MPAP能明显促进家兔股动脉血栓再通,用药后,TT,PT,KPTT显著延长,Fbg含量降低。结论MPAP对实验性家兔股动脉血栓有一定的溶解作用,并且有明显的抗凝功能。

海洋假单胞菌碱性蛋白酶的纤溶及抗血栓形成作用

①目的 探讨海洋假单胞菌碱性蛋白酶 (MPAP)的纤溶作用及对血栓形成和血小板聚集功能的影响。②方法 通过纤维蛋白平板实验 ,观测MPAP的纤溶活性 ;建立大鼠颈动脉血栓形成模型 ,观察静脉应用MPAP后血栓形成时间及血小板最大聚集率的变化。③结果 MPAP具有较强的直接溶解纤维蛋白的作用 ;MPAP(1 0 0、2 0 0mg/kg体质量 )静脉用药后 ,血栓形成时间明显延长 (F =4 .72 ,q =3.78、4 .97,P <0 .0 5 ) ,血小板的最大聚集率显著降低 (F =4 0 .5 6 ,q =8.4 2、1 3.85 ,P <0 .0 5 )。

海洋假单胞杆菌QD80低温碱性蛋白酶的化学修饰

海洋假单胞杆菌QD80低温碱性蛋白酶(QDAPr)具有良好的低温适应性,且与常见的增稠剂及表面活性剂有良好的配伍性.因此该蛋白酶在日用化学领域,尤其是低温洗涤领域,具有广泛的应用价值.为研究其结构与功能之间的关系,用EDC、PMSF、N-AI、2,3-丁二酮等8种化学修饰剂修饰该低温碱性蛋白酶,然后检测残余酶活力,借以研究酶分子中氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系.结果表明,羧基、丝氨酸、ε-氨基、巯基等残基与酶活性无关;而色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基侧链的化学修饰引起酶活性的大幅度下降,说明色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基是酶活力所必需的基团.精氨酸残基侧链的化学修饰引起酶活性的轻微下降,说明精氨酸对酶活性具有一定贡献,但不处于活性中心.

高产角蛋白酶弯曲假单胞菌的筛选鉴定、发酵条件优化及酶学性质

从海洋环境中筛选得到了1株高产角蛋白酶的菌株,经鉴定命名为弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)Gxun-15。经过单因素试验和正交优化,得到该菌最佳培养基组成及产酶条件为:初始pH 7.5,羽毛含量2.5%(m/V),酪蛋白1 g/L,蔗糖40 g/L。优化后酶活力可达674.39 U/mL,较优化前(202.35 U/mL)提高了3.3倍。酶学性质分析表明,该角蛋白酶最适作用温度和pH分别为60℃和6.5~8.0。化学试剂β-巯基乙醇可使酶活提高5倍,十二烷基磺酸钠(SDS)和苯甲基磺酰氟(PMSF)能抑制该酶酶活。羽毛降解产物中共检测到16种氨基酸,其中7种为必需氨基酸,总的游离氨基酸含量为221.24 mg/L,其中苯丙氨酸含量最高为118.36 mg/L。综上,海洋来源的P.geniculata Gxun-15具有高效分泌角蛋白酶的能力,所产角蛋白酶为丝氨酸蛋白酶,具有较强的化学试剂稳定性。该菌的羽毛降解产物中富含多种氨基酸,在饲料方面具有较好的应用潜力。

培养基成分对海洋假单胞菌7-11产蛋白酶的影响

对海洋假单胞菌 7 1 1 ( pseudomonassp .7 1 1 )产蛋白酶进行了培养基的优化 ,初步确定了促使蛋白酶产率提高的培养基的配方 .经过 2 6℃、1 40r/min、1 2h培养 ,蛋白酶的相对产量可达 2 0 1 .7IU/mL ,比培养基优化前的 2 6.8IU/mL提高了 64 6%

原料乳和牧场环境中嗜冷菌多样性及蛋白酶水解特性研究

为探究原料乳和牧场环境中嗜冷菌多样性及产酶性能,该研究从中国4个地区的规模化牧场采集不同环节的原料乳及牧场环境样品,基于纯培养技术对嗜冷菌进行分离鉴定,分析中国地区嗜冷菌多样性,明确嗜冷菌的污染分布,并进一步对其中的假单胞菌(Pseudomonas)的蛋白酶活力测定及碱性肽酶基因(aprX)进行检测。结果显示,从64份样品中共分离到329株嗜冷菌,归为21个属,76个种。假单胞菌属是牧场中分布最广的污染菌株,占总分离菌株的57.45%,在28℃下,61.38%的假单胞菌株能产生蛋白酶,其中高达92.24%的假单胞菌株携带aprX基因,所产生的蛋白酶经135℃处理5 s后仍有21.55%的酶残留率超过60%。该研究牧场中原料乳及牧场环境嗜冷菌种类丰富,产耐热蛋白酶能力较强。

荧光假单胞菌胞外蛋白酶的纯化及特性研究

采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose FF离子交换层析、Sephacryl S-100 HR凝胶过滤层析方法对从原料乳中分离出一株荧光假单胞菌胞外耐热蛋白酶进行纯化及特性研究。将纯化后的单一蛋白酶进行SDS-PAGE分子质量测定,并考察最适温度、最适pH值、热稳定性、金属离子对其酶活性的影响及对该蛋白酶的氨基酸种类分析。纯化后蛋白酶的分子质量为47kD,经纯化后蛋白酶比活力提高了近61.38倍;最适温度和pH值分别为30℃和7.0;二硫苏糖醇对蛋白酶活性具有一定的抑制作用,Fe2+可以促进蛋白酶活性的提高;该酶具有较强耐热性,原酶液经130℃热处理3min后,残留酶活仍超过原酶液的47.67%;该蛋白酶氨基酸组成中甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和谷氨酸(Glu)的含量占明显优势,其中Gly含量最高,物质的量分数高达42%。

产低温碱性蛋白酶海洋适冷菌SY的筛选

从连云港海域、港口、远洋捕捞船及鱼市等地采集的海水和各类海鱼、贝类等样品中分离到217株产蛋白酶的细菌,并从中得到1株产低温碱性蛋白酶的海洋适冷细菌—SY。研究表明,该菌株最适生长温度和最适产酶温度均在15℃左右,0℃下仍可生长;具有一定的耐盐性和嗜盐性,无盐条件不能生长,在3%的NaCl盐浓度时,生长达到最高峰;最适生长和最适产酶pH均为8.0;SY菌所产的蛋白酶可能为一种丝氨酸蛋白酶,酶最适作用温度为50℃,最适作用pH为9.0;酶的热稳定性差,50℃保温20min,酶活下降40%。

一株产低温碱性蛋白酶嗜冷海洋细菌YS-9412-130的分离和培养条件研究

自海水贝类中取样 ,经分离培养基和酪蛋白培养基复合培养 ,用检测蛋白酶产生水解圈和Folin-酚碱性蛋白酶活性测定相结合的方法从 10 0 0多份样品中初步筛到了产碱性蛋白酶活力高、性能优良的菌株 YS- 94 12 - 130。对其初步研究结果表明 ,该菌只能利用有机氮源生长 ;在接近自然海水盐度、温度 2 0℃、p H在 7.0～ 9.0条件下 。

海洋假单胞菌GY-1菌株的抗菌作用及其胞外抗菌蛋白的分离纯化

采用对峙培养法和牛津杯法测定海洋假单胞杆菌(Pseudomonas)GY-1菌株和发酵液的抑菌作用。结果表明:GY-1菌株和发酵液对小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、禾谷镰刀病菌(Fusarium graminearum)、菠菜早疫病菌(Alternaria solania)、斑点落叶病菌(Alternaria alternata)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)和小麦叶枯病菌(Alternaria tenuis Nees)等植物病原真菌有较强的抑制作用。发酵液采用硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow柱层析、Sephadex G-75凝胶层析,以小麦根腐病菌为指示菌进行活性追踪和SDS-PAGE电泳纯度跟踪检测,纯化出一种对小麦根腐病菌具有明显抗菌作用的抗菌蛋白,其分子质量约为70.9kD。

冷藏原料乳中荧光假单胞菌的分离鉴定及其产蛋白酶特性研究

【目的】对冷藏原料乳中易污染的嗜冷菌进行分离筛选，为提高乳品品质、控制乳品质量提供参考。【方法】从冷藏原料乳中筛选出1株嗜冷菌，通过形态学观察、生理生化试验、16S rDNA分子生物学分析，对该株嗜冷菌进行鉴定；并采用福林酚试剂法、蛋白酶定性检测试验、耐热性试验以及牛奶酸度、黏度影响等试验，对其产酶特性进行研究。【结果】从冷藏原料乳中分离出的该株嗜冷菌为革兰氏阴性短杆菌，与GenBank中登录的荧光假单胞菌的生理生化特征相符，二者同源性为92.5%～97.6%。对该菌产胞外酶能力的研究发现，该菌所产胞外酶为一种耐热碱性蛋白酶，最适温度为30 ℃，最适pH为8.0，可引起牛乳黏度增大、凝集和乳清析出。【结论】从冷藏原料乳中分离出了嗜冷荧光假单胞菌，该菌所产胞外碱性蛋白酶会引起牛乳黏度增加、凝集和乳清析出，明显缩短乳品的保质期。

Tween-80和鼠李糖脂对铜绿假单胞菌及枯草芽孢杆菌产蛋白酶的影响

研究了添加表面活性剂Tween-80和生物表面活性剂鼠李糖脂对从堆肥中筛选得到的铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌生产蛋白酶的影响.用固态发酵的方法,对添加不同浓度的表面活性剂对这2种微生物产蛋白酶能力的影响、2种微生物产蛋白酶能力的差异以及发酵过程中的一些参数(包括菌体数、酶提取液表面张力、pH值和挥发性有机质)进行了考察.结果表明,Tween-80对铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌产蛋白酶有较大促进作用,添加浓度为0.05%时,能分别使铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌产蛋白酶最高酶活提高65%和30%;鼠李糖脂对铜绿假单胞菌产蛋白酶有轻微抑制作用,但能将枯草芽孢杆菌产蛋白酶,当添加浓度为0.018%时,鼠李糖脂能将枯草芽孢杆菌产蛋白酶最高酶活提高51%.铜绿假单胞菌产蛋白酶能力明显强于枯草芽孢杆菌,前者对照样的蛋白酶产量是后者对照样蛋白酶产量的6倍多.发酵过程中,铜绿假单胞菌酶提取液的表面张力明显低于枯草芽孢杆菌;添加表面活性剂对菌体生长有一定影响,但对pH值变化影响不大;挥发性有机质变化与微生物酶活成正相关关系.

铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的高效表达

目的 提取具有弹性蛋白酶活性的铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)临床分离株的染色体DNA ,PCR扩增弹性蛋白酶基因成熟蛋白编码区,A -T克隆于质粒pMD 18-T载体中,阳性重组子经酶切后连接至相应线性化的表达型载体pQE - 31中,转化大肠杆菌JM 10 9感受态,筛选高效表达株,表达产物经SDS -PAGE初步鉴定。所克隆的基因在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物经重组质粒测序初步确定为铜绿假单胞菌弹性蛋白酶。本研究为该表达蛋白的纯化、复性和酶动力学研究奠定了基础。

铜绿假单胞菌对支气管扩张患者气道中基质金属蛋白酶-9和金属蛋白酶组织抑制因子-1表达的影响

目的对不同细菌感染的支气管扩张(BE)患者气道中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的表达进行研究,分析铜绿假单胞菌(PAE)对MMP-9、TIMP-1表达的影响。方法采用病例对照研究的方法,分设BE组及对照组,BE组又根据支气管肺泡灌洗液(BALF)培养结果分为PAE组及其他菌株组两个亚组。收集患者的BALF,ELISA法检测其中MMP-9和TIMP-1的浓度,并计算TIMP-1/MMP-9比值。同时取气管内膜活检组织,免疫组织化学法检测其中MMP-9及TIMP-1的表达。结果 MMP-9在PAE组及其他菌株组的BALF中均明显升高(P均=0.0000);MMP-9在PAE组(P=0.0421)及其他菌株组(P=0.0003)支气管内膜活检组织中的表达亦明显升高。TIMP-1在PAE组BALF中的浓度明显低于其他菌株组(P=0.0324);BALF中TIMP-1/MMP-9比值在BE组明显低于对照组(P=0.0000),PAE组明显低于其他菌株组(P=0.0026)及对照组(P=0.0000),而其他菌株组又明显低于对照组(P=0.0000)。结论 PAE感染可能是通过促使MMP-9分泌并抑制TIMP-1同步分泌而使BE病情恶化。

铜绿假单胞菌弹性蛋白酶抑制肺表面活性蛋白A介导的免疫吞噬作用

目的探讨肺表面活性蛋白A(SP-A)与铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)弹性蛋白酶在铜绿假单胞菌肺部感染过程中的关系。方法铜绿假单胞菌突变菌株P.aeruginosa野毒株PAO1、弹性蛋白酶LasB突变株△lasB和回复突变株PDO240LasB鼻腔接种C3H小鼠建立肺部感染模型以观察细菌的毒力变化。将同等数量的细菌与SP-A共同孵育,通过Western blot法检测SP-A的体外降解。将预先经SP-A作用过的细菌与小鼠Raw264.7巨噬细胞孵育进行体外吞噬实验以观察细菌被吞噬的情况。结果由于弹性蛋白酶表达的缺失,铜绿假单胞菌突变菌株P.aeruginosa△lasB在通过鼻腔接种C3H小鼠建立的肺部感染模型中,与野毒株PAO1相比毒力显著降低。体外SP-A降解实验显示,△lasB基本失去了降解SP-A的能力。进一步的体外吞噬实验和聚集实验表明,△lasB在SP-A作用下更容易聚集成簇并被鼠巨噬细胞Raw264.7吞噬。结论铜绿假单胞菌弹性蛋白酶可降解SP-A,破坏SP-A介导的细菌聚集作用。

铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因的扩增与克隆

目的PCR扩增及克隆铜绿假单胞菌的弹性蛋白酶基因。方法从铜绿假单胞菌培养物中提取染色体DNA,PCR扩增弹性蛋白酶基因成熟蛋白编码区,AT克隆于pMD18T载体中,对重组质粒进行酶切与测序鉴定。结果从高GC含量的铜绿假单胞菌染色体DNA中扩增到弹性蛋白酶基因并进行了克隆与鉴定。结论本研究成功克隆到铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,为实现活性弹性蛋白酶的高效表达奠定了基础。

铜绿假单胞菌popN^-突变子Ⅲ型分泌水平及与蛋白酶关系的研究

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,TTSS)是重要的细菌致病因子之一,能够将酶蛋白直接注入到宿主细胞内,导致细胞损害的发生。重点研究了TTSS中的popN基因的功能,通过构建popN-突变子,发现该突变子在非诱导条件下,能够分泌酶蛋白,显示popN基因编码的蛋白对TTSS蛋白的分泌具有负调控作用。进一步研究发现,popN-突变子在不同培养基中TTSS的分泌水平存在着显著差异,影响对popN基因的功能的判断。为了解决这一矛盾,从几个方面分析了造成表型差异的可能因素,确定蛋白酶对TTSS分泌蛋白的降解作用,是表型差异存在的主要原因,从而首次系统地阐明popN-突变子在不同培养基中都具有TTSS组成型表达的表型,对于深入研究TTSS的调控机制具有重要意义。

大蒜提取液与环丙沙星对铜绿假单胞菌生物被膜弹性蛋白酶影响的研究

目的:测定铜绿假单胞菌两个主要细胞外毒性因子弹性蛋白酶的活性,比较大蒜提取液与环丙沙星对其影响。方法:将大蒜分为40ug/mL、80ug/mL、100ug/mL三组,环丙沙星分为0.3ug/mL、0.5ug/mL、1ug/mL三组及空白对照组,共8组。测定其对PA01和PAO-JP2的影响。结果:同一浓度大蒜液对PAO1弹性蛋白酶抑制幅度大于PAO-JP2,不同浓度环丙沙星的对PAO1、PAO-JP2弹性蛋白酶抑制幅度统计学显示无明显差异(P>0.05)。结论:由此推测,大蒜液对QS系统有抑制作用,环丙沙星对QS系统无抑制作用。