稀有海洋放线菌Salinispora arenicola大片段DNA基因组文库的构建

目的:构建稀有海洋放线菌S.arenicola基因组文库。方法:以稀有海洋放线菌S.arenicola为实验材料,随机剪切提取的总DNA,5′-磷酸末端补平回收40kb左右的DNA片段,与pWEBTM载体连接,经包装蛋白包装成噬菌体后侵染宿主细胞E.coliEPI100,构建该菌株的基因组文库,并对该文库进行质量鉴定。结果:成功构建了稀有海洋放线菌S.arenicola的基因组文库,效价达6.5×104CFU/mL,得到3000个阳性克隆子,远远大于按覆盖率为99%计算至少所需的657个阳性克隆子数,且平均插入片段长度为36kb,重组率100%。阳性克隆子保存于96孔板中,-80℃保存。结论:所构建文库的各项指标均达到要求,为了进一步评估S.arenicola所能合成的所有潜在天然产物,还需要进一步检测该文库中包含有生物合成基因簇的大肠杆菌的表达情况。

海洋放线菌(Salinispora arenicola)基因转移系统的建立

该实验旨在建立海洋放线菌Salinispora arenicola基因转移系统,以便基因敲除和外源基因表达等遗传操作。以整合型质粒pSET152和p IB139为出发质粒,通过接合转移构建了海洋放线菌Salinispora arenicola的基因转移系统。结果表明,25μg/m L阿泊拉霉素可有效筛选接合子,大肠杆菌与孢子的比例为8:1时可获得较多的转化子。经聚合酶链式反应(PCR)验证,质粒成功整合到菌株海洋放线菌S.arenicola基因组中,接合子经多次传代后,导入的质粒pSET152和pIB139仍稳定整合于接合子基因组上。成功构建了海洋放线菌S.arenicola接合转移系统。

一株抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的海洋放线菌的鉴定及系统发育分析

从海南三亚海域的海绵中分离到一株抗耐甲氧西林金黄色芎芍methicillin-resistant Staphylococcusaureus(MRSA)的海洋放线菌A115。该菌株在燕麦片琼脂上插片培养孢子丝螺旋形,孢子长圆形,表面有稀疏的短刺;菌株细胞壁含LL-DAP,糖型C;16S rDNA序列分析及系统发育分析表明,分离菌株A115与Streptomyces albogriseolus属同一分支,同源性为99.0％,但形态学、生理生化鉴定及活性情况存在一些差异。由此推断菌株A115为S.albogriseolus的海洋变种,命名为Streptomyces albogriseolus var.marine。

一株新的海洋放线菌所产黄色素稳定性研究及其16S rDNA序列分析

对一株分离自威海海域的产黄色素的海洋放线菌新菌株MA01进行了色素提取方法及其稳定性的研究。测定其最大吸收波长,考察了pH、光照、温度、金属离子、氧化剂和还原剂、防腐剂等因素对黄色素稳定性的影响。此外,对菌株MA01进行分子鉴定,利用PCR技术扩增其16S rDNA序列,并构建了系统进化树。实验结果表明,该黄色素在300nm处有最大吸收峰,超声波法提取色素优于溶剂法。该黄色素为水溶性色素,易溶于甲醇和乙醇,在弱酸性、中性和碱性条件下稳定,温度小于60℃时热稳定性良好,对紫外光和可见光照射稳定性良好,基本不受金属离子K+、Na+、Mg2+、Mn2+、Ca2+影响,防腐剂食盐和蔗糖对其均无不良影响。该黄色素不耐氧化剂,还原剂也会降低其稳定性。16S rDNA序列分析和系统进化树显示菌株MA01与多株Streptomyces sp.的16S rDNA具有99%的相似性,初步鉴定菌株MA01是链霉菌属Streptomyces sp.的一种。菌株MA01具有较高的研究和开发价值。

海洋放线菌WBF7的鉴定及其抗肿瘤代谢产物的初步研究

目的对海洋放线菌WBF7进行菌种鉴定,并对其抗肿瘤代谢产物进行初步研究。方法通过形态学观察、培养特征和生理生化特性检测、细胞壁组分以及16S rDNA基因序列分析,鉴定菌株;将其发酵液pH调至2、7或10后100℃加热处理1h,研究活性物质的稳定性;用石油醚、乙酸乙酯及其水饱和正丁醇对其发酵液依次进行萃取,研究活性物质的极性;通过MTT法对处理后样品进行抗肿瘤活性研究。结果通过菌种鉴定,将菌株WBF7归属为灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens);其抗肿瘤活性物质具有较强的酸碱稳定性和热稳定性,并且易于被乙酸乙酯萃取。结论海洋放线菌WBF7是第一次从海洋中分离得到的灰略红链霉菌,其抗肿瘤代谢产物稳定性好,大部分极性中等,具有较好的开发前景。

海洋放线菌M324抑菌活性代谢产物的研究初报

M324是从中国江苏连云港沿海海泥中分离出的一株放线菌,能产生广谱抗菌活性物质。文章报道了对该菌株的分子生物学鉴定、其抑菌活性产物的粗提取和部分化学性质的研究结果。发现海洋放线菌M324为灰菌素链霉菌的一个新菌株,归属球孢亚群;抗菌物质具有强极性,易溶于水和二甲基亚砜,微溶于甲醇和乙醇,能够被弱极性大孔树脂所吸附,并能用低浓度甲醇溶液解吸;活性物质中有糖环结构,为一种中性糖苷类抗生素。

一株具有抗肿瘤活性的海洋放线菌的分离和鉴定

海洋放线菌ACMA006的发酵产物具有很强的抗肿瘤活性和较好的抑菌效果,但对人常细胞毒性较弱。该菌株在大多数培养基上生长良好,产生可溶性色素;基质菌丝在培养早期现横隔,随后发生断裂;最适生长温度为28°C。基于16SrDNA序列的系统发育分析表明,菌ACMA006属于链霉菌属(Streptomyces)的成员,与该属的合格发表种卡伍尔链霉菌华盛顿亚(S.cavourensis subsp.washingtonensis)的16SrDNA序列相似性最高,同源性达100%,但在部分态特征和理化特性上存在较大差异。初步确定ACMA006属于卡伍尔链霉菌华盛顿亚种的一个洋变种。

海洋放线菌NZ1203菌种鉴定及活性产物研究

目的:对海洋放线菌NZ1203进行菌种鉴定,并对其抗肿瘤代谢产物进行初步研究。方法:通过形态学观察和16S rDNA基因序列分析,鉴定菌株;用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇对其发酵液依次进行萃取,并且通过抑菌实验和抗肿瘤实验对其发酵萃取物的活性进行初步研究。结果:通过菌株鉴定,将放线菌NZ1203归属于极暗黄链霉菌属(Streptomyces fulvissimus);乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物具有较强的抑菌作用和良好的抗肿瘤效果,且正丁醇相优于乙酸乙酯相,石油醚相无抑菌效果。结论:海洋放线菌NZ1203为极暗黄链霉菌属,其代谢产物抑菌和抗肿瘤作用效果明显,可进一步进行分离鉴定,获得单体代谢产物,为进一步药物开发提供前期研究和物质基础。

筛选鉴定一株产生抑菌活性物质的海洋放线菌

目的:分离筛选能够产生抑菌活性物质的海洋放线菌,并进行生理生化和16S rDNA鉴定。方法:用分离培养基培养海洋放线菌,并筛选出能够产生抑菌活性物质的菌株,对所筛选菌株的形态特征、生理生化特性进行鉴定分析;采用通用引物27F、1492R扩增该菌株的16S rDNA,对测序结果进行分析;采用Neighbor-Joining(N-J)法构建系统发育进化树。结果:筛选到一株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌具有较强抗性的海洋放线菌F1,该菌株好氧,中度嗜盐,在高氏Ⅰ号培养基上呈白色绒粉状,16S rDNA序列比对表明该菌株与田无链霉菌(Streptomycestanashiensis)NR043369的相似度为99%。结论:筛选到的菌株F1是一株海洋来源的放线菌,与田无链霉菌NR043369的同源性较高,可能属海洋链霉菌属,对金黄色葡萄球菌等病原菌具有较强的抑菌活性。

产生物活性物质海洋放线菌的筛选和鉴定

本实验从辽宁大连海域的海水、海泥和海参养殖圈的样品中分离得到38株海洋放线菌,以金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌、枯草芽孢杆菌、副溶血性弧菌和铜绿假单胞杆菌为指示菌,筛选出两株抑菌活性高的菌株,分别命名为HS-B31和HS-B34。16S r DNA测序鉴定及构建系统发育树的结果显示,它们都属于放线菌目、链霉菌属的不同种。对两株链霉菌的发酵上清液进行萃取、粗提和浓缩得到粗提物,即B31和B34;抗菌作用的结果显示,这两种粗提物的抗菌效果均为显著。经薄层层析分析,并利用制备型层析板对粗提物B31和B34进行活性物质的分离制备,共得到八个组分,即B31-1、B31-2、B31-3、B31-4、B31-5和B34-1、B34-2、B34-3。用滤纸片法对这些组分进行抗菌检测,结果显示组分B31-3和B34-3不仅对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌有较好的抑菌作用,而且对海洋致病菌革兰氏阴性菌副溶血性弧菌也显示出较强的抑菌效果。研究为新型抗生素的研制和应用提供了微生物新资源。

一株群体感应抑制活性海洋放线菌的筛选与鉴定

群体感应抑制剂(Quorum Sensing Inhibitors,QSIs)可以通过干扰群体感应(Quorum Sensing,QS)而有效降低病菌的感染性和毒力,并且不会胁迫致病菌使其产生耐药性,是具有前景的抗生素替代品。海洋微生物是新型QSIs的潜在来源。本研究利用紫色杆菌(Chromobacterium violaceum 026,CV026)模型评价QS抑制活性,在来源于南海中西部和印度洋深海沉积物样品的放线菌中筛选QS抑制活性菌株,并且根据形态学特征和16S rRNA基因序列鉴定活性菌株。通过筛选获得了菌株SCSIO 53717,其提取物在CV026模型中能够显著降低指示菌株的紫色菌素产量,并且在0~1000mg·mL^-1的有效浓度范围内不影响紫色杆菌的生长。菌株SCSIO 53717被鉴定为Kocuria属,是首次报道的具有QS抑制活性的Kocuria属菌株,因而具有进一步深入研究的价值。

2株红树林淤泥放线菌的鉴定及抗菌活性研究

【目的】对分离自广西北海红树林海洋淤泥中的2株放线菌(BH200951、BH200954)进行鉴定,并对其抗菌活性进行分析。【方法】对BH200951与BH200954 2株典型放线菌的形态特征及生理生化特征进行了观测,并采用医学药敏试验方法对其抗菌活性进行了测定,最后提取2株菌株的总DNA,用放线菌通用引物对其16 SrDNA进行PCR扩增,对获得的扩增结果进行DNA序列测定,采用邻接法构建其与其他典型菌株的系统发育树。【结果】在高氏1号培养基上,BH200951和BH200954菌株生长良好,菌落分别呈灰白色和黄色,菌落皱褶,致密坚实;在光学显微镜下观察发现,2株菌株气生菌丝发达,呈深灰色,成熟后生成孢子丝;能使明胶液化,淀粉、纤维素水解,牛奶凝固而不胨化;对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、普通变形杆菌均有较好的抑制作用。经测序后比对显示,2株放线菌菌株均属于链霉菌属,其中BH200951鉴定为链霉菌属(Streptomyces aurantiogriseus)AY999773的变种;BH200954初步鉴定为链霉菌属的仙台链霉菌。【结论】对分离自广西北海红树林海洋淤泥放线菌BH200951和BH200954菌株进行了鉴定,其发酵产物具有明显的抗菌活性。

西太平洋放线菌的分离筛选

放线菌能够产生抗生素、酶及酶抑制剂等,对当代医药工业的发展做出了重大贡献,是最具经济价值和生物技术价值的原核生物。近年来,海洋放线菌及其次生代谢产物的研究也在逐步深入。本文以海洋六号大洋27航次采集的西太平洋样品为基础获得纯培养菌株,结合KOH检测、放线菌特异性引物PCR、BOX-PCR等方法对分离菌株进行初步筛选,然后选取代表性菌株进行16S rDNA测序,共获得了80株多样性较强的海洋放线菌,其中还包括了6株放线菌潜在新属或新种,丰富了西太平洋可培养放线菌的多样性。

一株新的海洋放线菌所产红色素理化性质研究及其16S rDNA分析鉴定

对分离自威海近海海域的一株产红色素的海洋放线菌SHXF02-1进行了红色素提取方法及其稳定性研究,测定其最大吸收波长,考察了pH值、温度、光照、氧化剂和还原剂、防腐剂等因素对色素稳定性的影响。此外,对菌株SHXF02-1进行了分子鉴定,利用PCR技术扩增了其16S rDNA序列,利用软件MEGA4.1构建了系统进化树。实验结果表明,该红色素在波长530nm处有最大吸收峰,用乙醇浸提该色素优于其他试剂。该红色素为脂溶性色素,酸性条件下稳定,该色素的光、热稳定性好,耐氧化能力强,耐还原性较差。防腐剂食盐和蔗糖对色素均无不良影响。16S rDNA序列分析和系统进化树显示菌株SHXF02-1与多株micrococcus sp.的16S rDNA具有99%的相似性,初步鉴定菌株SHXF02-1是微球菌属Micrococcus sp.的一种。菌株SHXF02-1具有较高的研究和开发价值。

一株产黑褐色色素海洋放线菌的研究

从舟山群岛潮间带海域中分离到一批产色素的海洋放线菌,用滤纸片法进行抑菌试验,并对目标菌株进行鉴定,然后对其所产色素进行粗提,测色素的最大吸收波长,研究理化因子对其影响。结果表明筛选到产黑褐色色素的菌株B2,其对Vibrio parahaemolyticus和Escherichia coli具有较好的抑制作用,色素初步研究结果显示,在波长456nm处具有最大吸收值,光照对色素稳定性影响较弱,不耐高温和酸碱。生理生化鉴定和16S rDNA分子序列分析显示菌株B2为链霉菌属的一种,系统进化树显示B2与菌株Streptomyces sp.28a-34-3具有最好同源性,相似性为99.8%。菌株B2具有较好的研究价值。