海洋真菌烟曲霉H1-04生产的生物碱类化合物及其抗肿瘤活性

目的研究海洋真菌烟曲霉H1-04（Aspergillus fumigatus H1-04）生产的抗肿瘤活性产物。方法以生物活性为导向．利用液液萃取、硅胶柱色谱、制备HPLC等技术分离纯化活性化合物；根据理化常数及波谱数据鉴定化学结构：采用SRB法和MTT法测试评价抗肿瘤活性。结果与结论从烟曲霉H1—04发酵物中分得7个化合物，分别鉴定为fumiquinazoline J（1）、fumiquinazoline F（2）、fumiquinazoline G（3）、fumiquinazoline C（4）、fumiquinazoline A（S）、tryptoquivaline J（6）和pseumtin A（7）。化合物1～7对小鼠乳腺癌tsFT210细胞均呈一定的细胞增殖抑制活性，1、4和7对人肝癌BEL-7402、人肺癌A549、人白血病HL60和小鼠白血病P388细胞也有不同程度的抑制活性。化合物1为首次从自然界分离获得，其抗肿瘤活性也属首次报道，化合物6为首次从海洋来源微生物产物中分离得到。

海洋真菌烟曲霉H1-04发酵液中的硫代二酮哌嗪类产物及其抗肿瘤活性

目的研究海洋来源真菌烟曲霉H1-04（Aspergillus fumigatusH1-04）发酵液中的抗肿瘤活性产物。方法采用液液萃取、硅胶柱色谱、制备HPLC等技术,从烟曲霉H1-04的发酵产物中分离纯化活性产物。活性产物的结构经IR、MS、^1H-NMR确证。采用SRB法和MTT法测试评价抗肿瘤活性。结果与结论从烟曲霉H1-04发酵物中分离鉴定了4个硫代二酮哌嗪类化合物,分别是胶霉毒素（gliotoxin,1）、bisdethiobis（methylthio）gliotoxin（2）、bis-N-norgliovictin（3）、didehydrobisdethiobis（methylthio）gliotoxin（4）。化合物1在浓度为0.1μmol·L^-1时几乎能完全抑制小鼠白血病P388细胞和人肺癌A549细胞的增殖,抑制率分别为100%和99.1%;对小鼠乳腺癌tsFT210细胞也呈现很强的细胞凋亡诱导、细胞周期抑制、坏死性细胞毒等活性。化合物2-4对tsFT210细胞显示出不同程度的抗肿瘤活性。化合物2-4为首次从烟曲霉发酵物中分离得到,并首次报道2-4的抗肿瘤活性。

A Pair of New Spirocyclic Alkaloid Enantiomers with TrxR Inhibitory Activities Were Isolated from Marine-Derived Aspergillus ruber TX-M4-1

One new spirocyclic alkaloid,5-isopentenyl-cryptoechinuline D(1),along with 11 known compounds(2–12),were iso-lated from a marine fungus Aspergillus ruber TX-M4-1.The structures of compounds 1–12 were elucidated by spectroscopic evi-dences.Compound 1 was initially isolated as an enantiomer,and further separation of 1 by chiral HPLC afforded a pair of enantio-mers,including(-)-5-isopentenyl-cryptoechinuline D(1a)and(+)-5-isopentenyl-cryptoechinuline D(1b).Their absolute configura-tions were elucidated by ECD spectroscopic data.Compounds 1a,5 and 10 could inhibit thioredoxin reductase(TrxR)activity with IC50 values of 6.2,36.3 and 18.6μmol L^(-1),respectively.Surface plasmon resonance(SPR)study also demonsrated the interactions between compounds 6,8 and Niemann-Pick C1 Like 1(NPC1L1)respectively,which indicate that compounds 6 and 8 are potential NPC1L1 inhibitors.

黑曲霉内切β-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达

利用RT-PCR技术,提取黑曲霉(Aspergillusniger)L3的总RNA进行反转录,并通过PCR扩增得到去除天然信号肽的β-1,4-葡聚糖酶基因egⅠ,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,使之位于α-因子信号肽下游,并与之同框,构建重组表达质粒pPIC9k-egⅠ,电击转化毕赤酵母GS115,经MM、MD、CMC-Na和G418平板筛选,得到重组毕赤酵母工程菌1#和5#,在摇瓶中β-1,4-葡聚糖酶酶活分别达到1456U/mL和1928U/mL。重组酶最适温度为70℃,最适pH为5.0。

Dectin-1和TLR4在烟曲霉菌性角膜炎大鼠角膜组织中的表达及其在角膜炎发病中的作用

目的:探讨烟曲霉菌感染大鼠角膜后Dectin-1和Toll样受体-4(TLR4)表达及炎症因子的分泌特点,阐明其在大鼠角膜炎发病中的作用。方法:40只SD大鼠随机分为对照组(n=10)和烟曲霉菌性角膜炎组(n=30),对照组不予任何干预,烟曲霉菌性角膜炎组给予双眼烟曲霉菌感染造模,分别于感染12h(n=10,12h组)、24h(n=10,24h组)和48h(n=10,48h组)后取角膜组织,ELISA法检测IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10和NF-κB水平,免疫组织化学法、RT-PCR法及Western blotting法测定角膜组织中Dectin-1和TLR4mRNA及蛋白表达。结果:大鼠造模均成功,眼角膜裂隙灯检测观察可见对照组眼睛清澈,感染烟曲霉菌后,12h组眼睛表面有明显的一层薄膜,薄膜与健康的角膜边界清晰;24h组可见眼部有一层白色的浸润灶形成,且表面粗糙;48h组角膜白色浸润灶进一步加深,且范围明显扩大,基本覆盖了整个眼球。烟曲霉菌感染后,12h组、24h组和48h组角膜组织中炎症因子IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α和NF-κB水平明显高于空白对照组(P<0.05),其中24h组和48h组明显高于12h组(P<0.05),48h组明显高于24h组(P<0.05);免疫组织化学检测,大鼠角膜组织中Dectin-1和TLR4表达水平随着感染时间的增加逐渐增加,RT-PCR法和Western blotting法检测,大鼠眼角膜组织烟曲霉菌性角膜炎组(12h组、24h组和48h组)Dectin-1和TLR4蛋白及mRNA表达水平明显高于对照组(P<0.05),其中24h组和48h组明显高于12h组(P<0.05),48h组明显高于24h组(P<0.05)。结论:Dectin-1和TLR4在受到烟曲霉菌感染后可过量分泌,进而造成大鼠炎性相关因子表达,最终促使角膜炎的发生。

黄曲霉产β-1,4-木聚糖酶发酵条件的优化及其酶学特性

研究发现一株高产β-1,4-木聚糖酶的黄曲霉,拟优化其产酶条件并分析该酶的酶学特性。采用单因素法优化其摇瓶发酵条件,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合酶谱法判定酶的特性以及薄层色谱分析法(TLC)判定酶的水解特异性。结果表明,产酶最佳培养基为:麸皮3.5%、磷酸氢二铵3.0%、吐温-60 1.0%、NaCl 0.5%、MgSO_4·7H_2O 0.05%和KH_2PO_4 0.075%;黄曲霉在35℃下培养5 d达到最高酶活力115.08 U/mL,为未优化时的9.4倍。该菌能分泌两种β-1,4-木聚糖酶,分子量约为20.1和31.0 kDa,均不同于已有报道。粗酶的最适pH和最适温度分别为MOPS 7.5和55℃,在pH5.5～9.0及30～50℃范围内能保持酶活力的稳定。该酶不仅能水解榉木木聚糖产生低聚木糖,还能微弱降解大麦葡聚糖,有助于它在木质纤维素降解领域中的应用。

3-溴-2-(2′,3′-二溴-4′,5′-二甲氧基苯甲基)-4,5-二甲氧基苯甲酸甲酯的合成及其PTP1B酶抑制活性研究

为了研究海洋溴系列化合物的生物活性,以香兰素(1)为起始原料,经过溴代、还原、氧化、傅克酰基化及酯化等反应,成功的合成了新化合物3-溴-2-(2′,3′-二溴-4′,5′-二甲氧基苯甲基)-4,5-二甲氧基苯甲酸甲酯(9),总收率为19.6%。通过1H-NMR,13C-NMR等方法对目标产物进行了结构表征。通过比色法对目标化合物进行了PTP1B酶抑制活性测定,结果显示化合物浓度为20 mg/L时,PTP1B酶抑制率为55.84%,表明该化合物有一定的PTP1B酶抑制活性。

黄曲霉毒素B_(1)对卵白蛋白激发人外周血嗜碱性白血病细胞(KU812)脱颗粒的影响

目的 研究黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1), AFB_(1))暴露对鸡蛋过敏原卵白蛋白(ovalbumin, OVA)激发人外周血嗜碱性白血病细胞(KU812)脱颗粒的影响,以阐明AFB_(1)暴露与食物过敏的相关性。方法 构建AFB_(1)暴露下OVA激发KU812细胞脱颗粒模型,采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测AFB_(1)对其生物活性介质β-氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase,β-HEX)和组胺,以及细胞因子白细胞介素-4(interleukin-4, IL-4)、白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)、白细胞介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)释放量的影响;然后采用实时定量荧光聚合酶链反应法分析对IL-4和IL-6的mRNA表达水平的影响。结果 OVA刺激KU812细胞后会使其释放更多生物活性介质,包括β-HEX、组胺及细胞因子(IL-4、IL-6、IL-1β);当有AFB_(1)同时暴露,则会不同程度地加重这些生物活性介质的释放量。其中,AFB_(1)对β-HEX和组胺的释放量影响较小;但能够显著提高细胞因子IL-4、IL-6以及IL-1β的分泌量(P<0.01),尤其是对IL-1β的影响更显著,相较于对照组其分泌量提高84%。同时IL-4和IL-6的mRNA基因的表达水平也被提高。结论 OVA激发KU812会导致其脱颗粒并释放与食物过敏相关的一些活性介质和细胞因子。而AFB_(1)质量浓度为10000ng/mL的同时暴露,会提高这些相关活性介质和细胞因子的释放量,从而加重OVA所引发的食物过敏反应。

烟曲霉Aspergillus Fumigatus 3-甾酮-Δ~1-脱氢酶基因的克隆、异源表达和活性鉴定

微生物转化在甾体药物合成中起着不可替代的作用,其中C1,2位脱氢是最为重要的反应类型。以烟曲霉(A.fumigatus)为出发菌株,运用同源序列比对从烟曲霉酸基因簇中钓取出kstDF序列。该基因与玫瑰色热微菌(Ther-momicrobium roseum)DSM 5159的kstD一致性为51%。构建pET28a(+)-kstDF表达载体,转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(λDE3),获得高表达重组子菌株。经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析,发现高温(37℃)有利于KstDF蛋白表达,低温(20℃)有利于酶活的保持。该重组菌显示出良好的甾体转化能力,在12 h内完全转化13.3 mg.L-1雄甾-4-烯-3,17-二酮,为构建高效转化3-酮基-4-烯类固醇的基因工程菌奠定了基础。

Toll样受体4参与介导黄曲霉毒素G1对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的致损伤作用

目的在基因水平上探讨Toll样受体4(TLR4)参与介导黄曲霉毒素G1(AFG1)对肺泡Ⅱ型上皮细胞的致损伤生物学效应,及其作用机制和途径。方法分离、纯化、培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞并配置3个不同浓度的AFG1液体。实验随机分为正常组、实验组、溶剂对照组,每组6个样本。正常组加入同等量的无菌生理盐水;实验组加入不同浓度的AFG1液(高、中、低浓度分组),溶剂对照组加入同等量的二甲基亚砜(DMSO),终浓度为0.4 ml/L;同时处理24 h后在上述5组提取细胞mRNA,采用RT-PCR法检测各组TLR4 mRNA、NF-κBmRNA、TNF-αmRNA和IL-6mRNA的表达水平。结果正常组肺泡Ⅱ型上皮细胞上TLR4 mRNA、NF-κBmRNA、TNF-αmRNA和IL-6mRNA的表达量较低。实验组经AFG1液作用后,各项指标的表达量显著高于正常组(P<0.05)和溶剂对照组(P<0.05),且呈浓度依赖性增高。溶剂对照组各项指标的表达量与正常对照组相比,无显著性差异(P>0.05)。结论 TLR4→NF-κB→炎症介质信号转导通路参与AFG1对AT-Ⅱcells的损伤作用。

海洋曲霉Aspergillus ruber TX-M4-1的次级代谢产物研究

目的 对来自涠洲岛火山口的海洋曲霉Aspergillus ruber TX-M4-1的次级代谢产物进行研究。方法 利用硅胶、凝胶和高效液相等柱色谱方法进行分离纯化,运用紫外、红外、质谱和核磁共振波谱等分析方法对化合物进行结构鉴定,分别采用96孔板微量法、CCK-8法和DPPH法对化合物的抗菌活性、肿瘤细胞毒活性及抗氧化活性进行测试。结果 从海洋曲霉Aspergillus ruber TX-M4-1的发酵产物中分离鉴定了1个新的苯甲醛类化合物及10个已知结构的化合物,分别鉴定为5′-顺式-四氢金色灰绿曲霉素(1)、2-(1′,5′-庚二烯基)-3,6-二羟基-5-(3"-甲基-2"-丁烯基)苯甲醛(2)、异二氢金色灰绿曲霉素(3)、二氢金色灰绿曲霉素(4)、四氢金色灰绿曲霉素(5)、灰绿曲霉黄色素(6)、谷甾醇(7)、胆固醇(8)、链蠕孢素(9)、脱氢海胆灵(10)和新海胆灵A(11)。化合物1、5和6具有清除自由基活性,20μmol/L浓度下其DPPH自由基清除率分别为61.9%、88.0%和91.9%。结论 化合物1为新的苯甲醛类化合物。化合物1、5和6具有强的抗氧化活性。

宇佐美曲霉木聚糖酶基因xynⅡ在不同毕赤酵母中的分泌表达

将宇佐美曲霉E001的内切-1,4-木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,得到重组质粒pPXY-NII,将其经SalⅠ线性化后分别转化2株毕赤酵母GS115和KM71,xynⅡ基因通过同源重组被整合到毕赤酵母染色体上,并处于酵母α因子的下游,经筛选获得阳性重组菌PXGL98(Mut+)和PXKL29(Muts)。该木聚糖酶基因在2株毕赤酵母中均实现了分泌表达。同时对工程菌的发酵条件进行了优化,在甲醇诱导下,PXGL98与PXKL29培养物上清液中的酶活力分别可达1156.92 U/mL和1646.03 U/mL。

海洋来源黄直丝链霉菌产物中新细胞周期抑制剂的研究

目的研究海洋来源黄直丝链霉菌Z4-007产物中的抗肿瘤活性成分。方法采用流式细胞术筛选模型与分离技术紧密结合的活性跟踪分离模式,以细胞周期抑制活性为抗肿瘤指标,分离纯化活性成分;根据理化常数及波谱数据鉴定化学结构;用流式细胞术测试化合物活性。结果从黄直丝链霉菌Z4-007发酵物中分离得到4个活性化合物,其中1个鉴定为1-(2,4-二羟基-3,5-二甲基苯基)-(2E,4E)-己二烯-1-酮(1),其余3个初步推测为环肽类化合物。用小鼠乳腺癌tsFT210细胞经用流式细胞术测试分析结果表明:化合物Ⅰ在高浓度时将细胞周期抑制在G0/G1期,而在低浓度时则抑制在G2/M期并显示出一定的细胞凋亡诱导活性。结论化合物Ⅰ为首次从链霉菌属的微生物产物中分离得到,是一个新的细胞周期抑制剂。

HPLC-MS/MS法测定中药桃仁中黄曲霉毒素G_2、G_1、B_2、B_1

目的：建立中药桃仁中黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的HPLC-MS/MS测定方法。方法：样品经有机溶剂提取及免疫亲和柱净化后,以高效液相色谱-串联三重四极杆质谱进行分析测定。采用Phenomenex SB-C18（2.0 mm×50 mm,4μm）色谱柱,流动相为甲醇-10 mmol.L-1醋酸铵溶液,梯度洗脱,流速0.5 mL·min^-1;质谱条件为电喷雾离子源（ESI源）,正离子模式检测,扫描方式为多反应监测（MRM）,黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的定量分析离子分别为m/z331.1→313.1、m/z329.1→243.1、m/z315.0→287.1、m/z313.1→241.0。结果：黄曲霉毒素G2、B2进样量在0.375-30 pg范围内与峰面积呈良好的线性关系,黄曲霉毒素G1、B1进样量在1.25-100 pg范围内与峰面积呈良好的线性关系,r〉0.999;回收率在88.5%-103.9%之间。结论：本法灵敏、快速、准确,专属性强,可用于中药桃仁中黄曲霉毒素的测定。