生防菌海洋芽孢杆菌B-9987发酵过程中活茵量大幅波动的原因研究

通过采用无菌发酵滤液梯度稀释、添加消泡剂对比试验和葡萄糖单因子试验，初步研究了海洋芽孢杆菌B-9987发酵过程中活菌量大幅波动的原因，为建立稳定的发酵工艺提供参考依据。结果表明，菌体胞外代谢产物和发酵过程中添加的消泡剂对菌体的生长具有抑制作用，培养基中葡萄糖含量也会引起菌体量波动，因此推测，三者共同作用导致发酵过程中活菌量大幅波动。通过综合调控培养基中葡萄糖含量和消泡剂的添加方式，解决了发酵过程中活菌量大幅波动的问题，并使发酵液中活菌量大幅提升，发酵结束时活菌含量在5．0×10^9cfu／mL以上。

海洋芽孢杆菌B-9987中抗MDR菌活性成分研究

目的挖掘具有优良多重耐药菌(MDR)抗菌活性的次级代谢产物,为海洋新药研发提供分子多样性。方法对海洋芽孢杆菌B-9987进行大发酵,将发酵产物进行提取分离,每一步分离过程进行MDR活性追踪。结果 B-9987粗提物对4株MDR菌(金黄色葡萄球菌CCARM 3090、沙门氏菌CCARM 8250、大肠杆菌CCARM 1009、粪肠球菌CCARM 5203)具有良好的抗菌活性。通过HPLC分离纯化及MS、NMR等波谱分析获得了化合物1(Macrolactin F)和化合物2(Bacillaene A)。化合物1对MDR菌没有抗菌活性。由于化合物2对光、温度、氧气十分不稳定,无法直接测试活性。对含有化合物2的组分进行活性测试,确定了B-9987的MDR菌抗菌活性来自于Bacillaene类化合物。结论鉴定了B-9987中的抗MDR菌活性成分。

海洋芽孢杆菌可湿性粉剂配方的优化

为提高海洋芽孢杆菌B-9987可湿性粉剂(WP)的润湿性和悬浮率,降低其pH值,通过助剂筛选、混料设计试验等方法优化了制剂配方。结果表明:以十二烷基硫酸钠作为该可湿性粉剂的助剂时,助悬浮及助润湿效果明显;通过混料设计试验确定了该可湿性粉剂固体介质的最佳配比(质量分数)为:十二烷基硫酸钠9.54%,轻质碳酸钙83.74%,高岭土6.72%;其预测悬浮率为75.15%,pH为8.62,润湿时间89.40 s,验证试验结果悬浮率为73.13%,pH 8.33,润湿时间100.00 s,二者比较接近。优化后的海洋芽孢杆菌可湿性粉剂不需经过高耗能的气流粉碎过程即可达到农药可湿性粉剂标准的要求,可明显降低生产成本。

海洋芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus B-9987中difficidins生物合成基因簇的分析鉴定

目的对海洋芽孢杆菌B-9987中difficidins生物合成基因簇及其关键基因进行分析、鉴定及功能研究。方法通过生物信息学手段对difficidins基因簇的基因组成和功能结构域进行了分析;结合其结构特征及聚酮化合物的生物合成原理,初步推导其生物合成途径;构建了烯酰辅酶A水合酶基因difO双交换阻断突变株,对其功能进行初步验证并对基因簇进行确认。结果从B-9987发酵液中分离纯化得到化合物oxydifficidin,鉴定了B-9987中该化合物的生物合成基因簇,其是由位于同一个操纵子的15个基因difA-O所编码的反式酰基转移酶聚酮合酶体系组装而成;difO基因阻断后,oxydifficidin不再产生。结论 difficidins生物合成基因簇的鉴定为后续研究其生物合成途径及相关基因的功能奠定了基础。

海洋芽胞杆菌B-9987产新型抗菌环脂肽Marinhysin A的培养基优化

Marinhysin A(MA)是由海洋芽胞杆菌B-9987产生的具有抗真菌活性的新结构环脂肽类化合物,该化合物不仅抑菌谱广而且盆栽防效良好。采用响应面分析法(Response SurfaceMethnology)对海洋芽胞杆菌B-9987产脂肽MA的培养基进行了优化。Plackett-Burman(PB)实验表明,蔗糖和酵母粉是显著影响MA产量的因素。中心组合实验(Central Composite Design)分析表明,当培养基中蔗糖和酵母粉的含量分别为42.0g/L和42.3g/L时,MA的浓度最大可达68.19mg/L,与实验值75.74mg/L相近。优化后,MA产量(250ml摇瓶发酵)较优化前的54.12mg/L提高了28.5%。用优化后培养基进行5L罐发酵,MA浓度可达182mg/L,较优化前的130mg/L提高了28.4%。