牦牛“海绵吸附”bta-miR-146a的lncRNA筛选及靶向验证

【目的】筛选牦牛卵泡发育过程中可能对靶向Smad家族成员4(Smad family member 4,Smad4)基因的bta-miR-146a具有“海绵吸附”作用的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。【方法】使用miRanda和RNAhybrid数据库对靶向牦牛bta-miR-146a的lncRNA进行预测;采集牦牛卵巢,分离健康、闭锁卵泡,用Trizol法提取RNA并反转录为cDNA,利用PCR检测所预测lncRNA的表达情况;利用实时荧光定量PCR法检测所筛选lncRNA和bta-miR-146a/Smad4在牦牛健康、闭锁卵泡中的表达情况;构建lncRNA-ENSBGRT00000000387.1的野生型和突变型双荧光素酶载体,将其与bta-miR-146a-mimics、mimics NC共转染至HEK293T细胞,检测双荧光素酶活性。【结果】试验共筛选出7个可能对靶向Smad 4基因的bta-miR-146a具有“海绵吸附”作用的lncRNAs,其中的lncRNA-ENSBGRT00000000387.1在牦牛卵泡中表达量极显著高于其他lncRNAs(P<0.01)。实时荧光定量PCR检测发现,lncRNA-ENSBGRT00000000387.1、bta-miR-146a和Smad 4基因mRNA在牦牛健康和闭锁卵泡中共表达,且lncRNA-ENSBGRT00000000387.1和Smad 4基因mRNA在牦牛健康卵泡中的表达量均显著高于闭锁卵泡(P<0.05),bta-miR-146a在牦牛健康卵泡中的表达量极显著低于闭锁卵泡(P<0.01)。试验成功构建牦牛lncRNA-ENSBGRT00000000387.1野生型及突变型pmirGLO双荧光素酶报告质粒,双荧光素酶活性结果显示,bta-miR-146a mimics对牦牛lncRNA-ENSBGRT00000000387.1-WT具有极显著下调作用(P<0.01)。【结论】lncRNA-ENSBGRT00000000387.1、bta-miR-146a和Smad 4基因mRNA可能在牦牛卵泡发育或闭锁过程中存在调控机制,并在体外初步证实lncRNA-ENSBGRT00000000387.1与bta-miR-146a具有“海绵吸附”作用,这为进一步研究lncRNA-ENSBGRT00000000387.1在牦牛卵泡中的功能机制提供依据。

miR-21海绵吸附载体在脑胶质瘤细胞中的应用

目的探讨微小RNA-21(miR-21)海绵吸附载体在脑胶质瘤细胞中发挥的作用。方法采用microRNA(miRNA)海绵技术构建人源miR-21(has-miR-21)反义片段(miR-21AS),并串联重复8个构建至真核表达载体(pCMV),转染脑胶质瘤细胞U251,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRTPCR)检测miR-21的表达,四甲基偶氨唑盐(MTT)实验检测细胞增殖能力,并检测miR-21肿瘤密切相关靶基因肿瘤抑制基因原肌球蛋白1(tumor suppressor gene tropomyosin 1,TPM1)、第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)、生长素β受体(transforming growth factor-beta,TGF-β)、人MutS蛋白同基因2(Human mutS homolog2,hMSH2)、程序性细胞死亡4基因(programmed cell death protein 4,PDCD4)的表达。结果 U251细胞转染重组pCMV-miR-21AS质粒后显著下调了miRNA-21的水平,也显著降低了细胞增殖能力,显著提高了TPM1、PTEN、TGF-β、hMSH2、PDCD4的mRNA水平。结论构建的miR-21海绵吸附载体可显著下调miR-21水平,从而降低肿瘤细胞学效应,为肿瘤miRNA基因治疗提供理论基础。

LncRNA XIST通过海绵吸附miR-133a调控甲状腺癌细胞的增殖和凋亡

目的探究LncRNA XIST对甲状腺癌细胞增殖、凋亡的调控机制。方法收集49例甲状腺癌手术患者的癌组织和癌旁组织,培养甲状腺上皮细胞系Nthy-ori 3-1和甲状腺癌细胞系TPC-1、FTC-133、SW579、WRO,采用qRT-PCR检测甲状腺癌组织和癌旁组织及各细胞中LncRNA XIST和miR-133a的表达;培养TPC-1和FTC-13细胞,将细胞分为Control组、DMSO组、oe-NC组、oe-XIST组、si-NC组、si-XIST组、oe-NC+NC mimic组、oe-XIST+NC mimic组、oe-NC+miR-133a mimic组及oe-XIST+miR-133a mimic组,RNA pull down检测LncRNA XIST和miR-133a的结合情况,MTT检测各组细胞的增殖能力,流式细胞术检测各组细胞凋亡,qRT-PCR检测LncRNA XIST和miR-133a的表达。结果与癌旁组织比较,甲状腺癌组织中LncRNA XIST表达降低,miR-133a表达升高(P<0.05);与甲状腺上皮细胞系Nthy-ori 3-1比较,TPC-1、FTC-133、SW579、WRO细胞中LncRNA XIST表达显著升高,miR-133a表达降低(P<0.05);与oe-NC组比较,oe-XIST组细胞48 h和72 h时增殖能力增强(P<0.05);与si-NC组比较,si-XIST组细胞48 h和72 h时增殖能力降低(P<0.05)。与oe-NC组比较,oe-XIST组细胞凋亡比例降低(P<0.05);与si-NC组比较,si-XIST组细胞细胞凋亡比例升高(P<0.05);与oe-NC+NC mimic比较,oe-XIST+NC mimic组细胞中XIST表达升高,oe-NC+miR-133a mimic组细胞中miR-133a表达升高,oe-XIST+miR-133a mimic组细胞中XIST和miR-133a表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);与oe-XIST+NC mimic比较,oe-XIST+miR-133a mimic组细胞中miR-133a表达显著升高(P<0.05)。结论Ln cRNA XIST在甲状腺癌细胞中过表达,其通过海绵吸附miR-133a,进而促进甲状腺癌细胞增殖和凋亡。

miR-196b海绵吸附慢病毒载体的构建及其在骨髓基质细胞系ST2中的表达

目的构建miR-196b海绵吸附慢病毒载体,为研究miR-196b在骨髓基质细胞系中的功能奠定基础。方法根据miR-196b的成熟体序列设计与之互补的串联的六重复序列设计成引物,通过PCR反应将该六重复序列亚克隆至pUC19质粒中,再经酶切连接至pLVX-shRNA2慢病毒载体,利用293T细胞将构建成功的miR-196b海绵吸附慢病毒载体进行病毒包装和滴度测定,pLVX-shRNA2慢病毒作为对照组,miR-196b海绵吸附慢病毒作为实验组,将其感染ST2细胞,观察感染效率,并通过Western blotting检测miR-196b靶基因叉头框蛋白O1(FoxO1)的蛋白水平。结果酶切鉴定和测序结果正确,慢病毒包装所测滴度为1×108PFU/mL,将其感染靶细胞,其感染效率达80%。Western blotting结果显示,与对照组相比,其靶基因FoxO1蛋白表达水平有明显增加(P<0.05)。结论成功构建了miR-196b海绵吸附慢病毒载体,并能有效吸附内源性的miR-196b,从而发挥其抑制作用。

耳显微镜下明胶海绵吸附自体血贴补修复外伤性鼓膜穿孔162例体会

目的:探究耳显微镜下明胶海绵吸附自体血贴补修复外伤性鼓膜穿孔的效果。方法:选择2012年1月-2017年12月笔者所在医院收治的162例外伤性鼓膜穿孔患者为研究对象,所有患者均给予明胶海绵吸附自体血贴补修复治疗,观察患者鼓膜穿孔修复的手术效果及语言频率(0.5、1、2 kHz)平均气骨导差值是否提高。结果:162例患者中治愈48例,好转90例,无效24例,总好转率为85.2%。患者治疗后的平均气骨导差值显著高于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05)。其中3例患者出现排斥反应,半年后采用取乳突部骨膜行鼓膜修补术后治愈。2例穿孔鼓膜术后部分愈合,患者不愿再手术,半年后失访。其余穿孔者全部愈合。结论:耳显微镜下明胶海绵吸附自体血贴补修复外伤性鼓膜穿孔效果显著,排斥反应少,值得临床推荐。

海绵吸附材料去除水体中重金属离子的研究进展

海绵吸附材料因其孔隙丰富、比表面积大、机械性能良好、形状大小可控以及易于固液分离等诸多优势,在重金属污染水体处理领域得到广泛关注。但如何利用海绵吸附材料高效去除重金属离子并加强其应用的推广仍是研究的关键。本文总结了目前国内外在该领域的研究成果和进展,归纳了海绵吸附材料的制备方法、类型及吸附机理,介绍了影响海绵吸附材料吸附性能的各种环境因素和实际应用进展,并提出了未来的研究方向。

miR-181a吸附海绵载体改善肝细胞胰岛素抵抗作用研究

目的:构建对肝癌细胞系HepG2中内源性成熟miR-181a具有的抑制作用的特异性吸附海绵载体(miR-181a-sponge),验证其在葡萄糖胺诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗模型中改善胰岛素敏感性的作用。方法:针对成熟人源miR-181a的序列,设计在9-12位发生突变的反义序列,并重复7个拷贝,串联至pEGFP-C2真核表达载体及pGL3-Promoter载体中,通过双荧光素酶报告基因系统验证该吸附海绵的效果;同时在葡萄糖胺诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗模型中转染miR-181a吸附海绵载体,检测细胞对胰岛素刺激的应答效果。结果:pEGFP-C2-181a-SP载体可以成功的在细胞中表达,其绿色荧光呈阳性。双荧光素酶报告基因系统显示,pEGFP-C2-181a-SP载体可以显著抑制外源性miR-181amimics的活性(P<0.05)。Western blot结果显示转染pEGFPC2-181a-SP载体可以改善葡萄糖胺诱导的HepG2胰岛素抵抗细胞模型对胰岛素的应答。结论:miR-181a吸附海绵载体策略可以成功的诱导吸附miR-181a,构建的pEGFP-C2-181a-SP载体基因显著增加HepG2细胞的胰岛素敏感性,为改善miR-181a导致的肝细胞胰岛素抵抗提供了潜在的解决方案,有可能成为2型糖尿病治疗的新策略。

纤维素纳米纤维基吸附剂的制备及水中重金属的去除

采用3-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷将支化聚乙烯亚胺化学交联到2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基氧化的纤维素纳米纤维(CNF)上,制备了CNF基海绵状吸附剂(TOCGP),并考察了其对常见重金属Cu^(2+)、Cd^(2+)和Pb^(2+)的吸附效果。SEM、XRD和FTIR表征结果表明,TOCGP表面顺利引入氨基和羧基。TOCGP对重金属离子的吸附去除效果受pH影响较大,Cu^(2+)、Cd^(2+)和Pb^(2+)单一溶液的最佳pH依次为5.0、5.0和6.0,3种离子共存溶液的最佳pH为5.0。Cu^(2+)、Cd^(2+)和Pb^(2+)在TOCGP上的吸附较符合准二级动力学方程和Langmuir等温吸附模型。TOCGP具有较好的重复利用性能,经5次再生循环后对Cu^(2+)的吸附量仍可达初始吸附量的80%以上。

竞争性内源RNA调控肝癌及中医药干预机制研究进展

长链非编码RNA(LncRNA)是长度大于200个核苷酸的非蛋白质编码转录物,近几年来的研究表明,LncRNA上具有结合microRNA(miRNA)的部分互补序列,这些互补序列通过竞争性结合miRNA,从而抑制miRNA对靶基因mRNA的表达作用。也就是说,LncRNA能够作为一种竞争性内源RNA(ceRNA),通过海绵吸附的方式与miRNA竞争性结合,从而阻止miRNA同其靶mRNA结合,进而调控蛋白质的表达水平。在临床上,肝细胞癌(HCC,简称肝癌)通常被诊断为最致命的恶性肿瘤之一,其在全球癌症相关死亡中居于前列,肝癌因其发病机制的复杂性以及对化疗药物的耐药性,使得HCC的诊断和治疗以及预后仍然不能令人满意。随着研究的不断进展,人们发现LncRNA除了可以直接参与基因的表达调控外,还能够作为一种竞争性内源RNA(ceRNA)与miRNA相互作用,从而在HCC的进展中参与调控细胞增殖、死亡以及侵袭与转移等过程。该文从LncRNA海绵吸附miRNA发挥生物学功能这个方面,归纳总结相关LncRNA在肝癌发生发展中的作用及其与中医药干预机制的研究进展,以此为肝癌的诊断与治疗提供新思路。

环状RNA与疾病发生的关系

环状RNA是一种存在于真核细胞中的,具有稳定环状结构的RNA。它主要通过对miRNA海绵吸附作用,拮抗miRNA对其靶基因表达的抑制,进而在转录水平上对靶基因进行调控,miRNA与疾病的发生密切相关,提示circRNA在疾病发生中发挥着重要的调控作用,可望成为新型疾病诊断标志物,将在疾病预防、诊治领域发挥重要作用。

lncRNA作为ceRNA参与乳腺癌耐药研究进展

乳腺癌是目前女性最常见的恶性肿瘤之一,死亡率较高。随着乳腺癌早期筛查的普及、诊断水平的提高、治疗策略的规范。近几年来,乳腺癌死亡率不断降低,患者预后不断提高。乳腺癌辅助治疗药物尤其是化疗药物的耐药是影响乳腺癌复发转移及预后的重要因素。近年研究发现,长链非编码RNA(lncRNA)通过多种机制参与乳腺癌耐药。就lncRNA作为内源性竞争性RNA参与乳腺癌耐药的机制及相关通路做一综述。

石墨炉原子吸收测定矿石中金的含量

在实验过程中,矿石经过720℃的灰化温度处理后,然后以体积比例为3:1的盐酸—硝酸的溶液进行溶解,并且通过海绵充分吸附溶液中的金元素,另外再以质量分数为1%的硫脲通过络合物的性质反吸附金元素,并通过石墨炉原子吸收测定矿石中金元素的含量。

RNA 结合蛋白 QKI 吸附海绵载体的构建及其对肝癌细胞增殖的影响

目的：构建针对 RNA 结合蛋白 quaking （QKI）的特异性吸附海绵载体（QRE-sponge）,验证其对肝癌细胞系 HepG2中内源性 QKI 分子的抑制作用。方法利用人源 QKI 的特异性识别效应原件（qua-king responsive element, QRE）序列,重复13个拷贝,串联克隆至 pEGFP-C2真核表达载体中,转染 HepG2肝癌细胞及293 T 细胞。通过 Real time PCR,双荧光素酶报告基因检测及 MTT 实验进一步验证该吸附海绵的效果及其对肝癌细胞系 HepG2增殖的影响。结果 pEGFP-C2-QRE-SP 载体经测序证实构建成功,可以成功的在 HepG2细胞中表达,其绿色荧光呈阳性,且转染24 h 后显著影响 HepG2细胞中 QKI 下游靶基因的表达（P ﹤0.05）。双荧光素酶报告基因系统显示, pGL3-QRE-SP 载体可以显著抑制外源性 QKI 的活性（P﹤0.05）。 MTT 结果显示 pEGFP-C2-QRE-SP 载体促进 HepG2细胞的增殖。结论 QKI 吸附海绵载体策略构建的 pEGFP-C2-QRE-SP 载体可以成功的诱骗吸附 QKI,并促进肝癌细胞系 HepG2增殖,为进一步研究 QKI的功能研究提供了良好工具。

环状RNA circAZIN1在骨关节炎中调控软骨细胞退变的作用机制

目的研究环状RNA(circRNA)hsa_circ_0003304(circAZIN1)在骨关节炎(OA)中调控软骨细胞退变的作用及机制。方法基因芯片检测人脂肪源性干细胞(hADSC)成软骨分化过程中circRNA的表达水平变化。从基因芯片检测差异化表达最明显的前10位circRNA中,用IL-β及TNF-α构建的软骨细胞炎症模型进一步筛选出circAZIN1,过表达circAZIN1(转染pcDNA3.1-circAZIN1-EF1-ZsGreen质粒)后实时荧光定量PCR(qPCR)检测其对软骨细胞外基质(ECM)代谢的影响。RNA-蛋白体外结合(RNA pull down)试验检测circAZIN1结合的蛋白,miRNA-circRNA Interactions预测circAZIN1可能海绵吸附的微RNA(miRNA)及其位点,进一步利用TargetMiner、miRDB及TargetScan数据库预测circAZIN1可能海绵吸附的miRNA及下游mRNA,过表达miRNA后检测circAZIN1、miRNA及下游的mRNA是否存在镜像调控现象。结果circAZIN1在hADSC成软骨分化过程中(第3天和第21天)、IL-β及TNF-α构建的软骨细胞炎症模型中差异化表达最明显(第3天组vs.第21天组、对照组vs.IL-β组、对照组vs.TNF-α组);过表达circAZIN1可促进软骨细胞ECM的合成、抑制其分解;RNA-Pull down试验检测到circAZIN1明显结合AGO2蛋白,提示circAZIN1海绵吸附miRNAs的可能性大,进一步数据库预测circAZIN1的下游miRNA为hsa-miR-654-3p,而hsa-miR-654-3p的下游mRNA为CACNA1I,最后过表达hsa-miR-654-3p后qPCR检测证实circAZIN1、hsa-miR-654-3p及CACNA1I间存在镜像调控现象。结论circAZIN1通过海绵吸附hsa-miR-654-3p继而抑制CACNA1I的沉默效应从而发挥抑制软骨细胞退变的作用,这为circRNA在OA发生、发展中的调控机制研究提供了参考。

神经系统疾病circRNAs研究进展

目的环状RNAs(circular RNAs,circRNAs)是广泛存在、呈闭环结构的内源性非编码RNA(non-coding RNA)。本文综述了circRNAs的基本概况、特征、功能及其在神经系统疾病中的最新研究进展。方法应用PubMed、中国知网、万方数据库和维普中文期刊服务平台等检索系统,以"circRNAs、神经系统疾病"等为关键词,检索2014-01-01-2017-12-31的相关文献。纳入标准:(1)circRNAs最新研究进展;(2)与神经系统疾病相关circRNAs的文献。排除无关和重复文献。根据纳入和排除标准共筛选出35篇高度相关文献。结果 circRNAs结构稳定、丰度高、不受核酸外切酶的影响,具有高度稳定性、组织表达特异性和生物进化保守性等特点。这些特点使circRNAs具有许多潜在功能,如发挥microRNA海绵吸附作用,结合RNA结合蛋白和调节亲本基因的表达等。而且circRNAs在神经细胞增生、分化及突触的生成、可塑性等方面发挥了重要的调控作用,与多种神经系统疾病的发生、发展密切相关。结论深入研究circRNAs在神经系统疾病发生、发展中的作用,有助于为神经系统疾病的诊断、治疗及预后评估提供新思路。