目的构建与海肾荧光素酶（Rluc）融合的人Neurotensin-R1（HumanNeurotensinreceptorl，NTS1 or NTSR1）真核表达载体，用于生物发光共振能量转移法检测人NTS与其它受体间的相互作用以及研究Neurotensin—R介导的细胞内信号转导机制。...目的构建与海肾荧光素酶（Rluc）融合的人Neurotensin-R1（HumanNeurotensinreceptorl，NTS1 or NTSR1）真核表达载体，用于生物发光共振能量转移法检测人NTS与其它受体间的相互作用以及研究Neurotensin—R介导的细胞内信号转导机制。方法以质粒peDNA3．1-hNTS1为模板，PCR方法扩增人NTS。扩增的人NTS以及质粒pRluc—pcDNA3．1用NotI和XbaI双酶切，然后将这2种酶切产物按常规方法连接、转化至大肠杆菌Top10中，该菌在培养箱中孵育12～16h后，挑取菌落培养，提取质粒，进行酶切鉴定，最后进行测序。将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾（humanembryonickidney293，HEK293）细胞。最后，通过共聚焦显微镜观察经过免疫荧光染色的细胞以及Westernblot鉴定人Neu—rotensinl—R的表达。结果通过PCR扩增出一条1257bp的基因片段，序列与GenBank（NM-002531）相同。Westernblot中大约90kDa处有一蛋白条带，与预期大小相同。人Neurotensin—R表达在细胞膜上。结论成功构建了pRluc—hNeurotensinl—R重组表达载体，建立了该质粒转染HEK293的细胞模型。可被用于检测与其它受体间的相互作用以及研究Neurotensinl—R介导的细胞内信号转导机制，这将有助于探究疾病的发病机制及开发新的药物靶点。展开更多
文摘目的构建与海肾荧光素酶（Rluc）融合的人Neurotensin-R1（HumanNeurotensinreceptorl，NTS1 or NTSR1）真核表达载体，用于生物发光共振能量转移法检测人NTS与其它受体间的相互作用以及研究Neurotensin—R介导的细胞内信号转导机制。方法以质粒peDNA3．1-hNTS1为模板，PCR方法扩增人NTS。扩增的人NTS以及质粒pRluc—pcDNA3．1用NotI和XbaI双酶切，然后将这2种酶切产物按常规方法连接、转化至大肠杆菌Top10中，该菌在培养箱中孵育12～16h后，挑取菌落培养，提取质粒，进行酶切鉴定，最后进行测序。将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾（humanembryonickidney293，HEK293）细胞。最后，通过共聚焦显微镜观察经过免疫荧光染色的细胞以及Westernblot鉴定人Neu—rotensinl—R的表达。结果通过PCR扩增出一条1257bp的基因片段，序列与GenBank（NM-002531）相同。Westernblot中大约90kDa处有一蛋白条带，与预期大小相同。人Neurotensin—R表达在细胞膜上。结论成功构建了pRluc—hNeurotensinl—R重组表达载体，建立了该质粒转染HEK293的细胞模型。可被用于检测与其它受体间的相互作用以及研究Neurotensinl—R介导的细胞内信号转导机制，这将有助于探究疾病的发病机制及开发新的药物靶点。
