含有海肾萤光素酶报告基因的登革4型病毒亚基因组复制子的构建

目的：构建含有海肾萤光素酶（Renilla luciferase，R．luc）报告基因的登革4型病毒亚基因组复制子。为探讨病毒基因组中保守序列和元件在复制和翻译调控机制中的作用提供新的手段。方法：利用定点诱变PCR技术构建prM-E基因缺失的登革4型病毒亚基因组复制子（DENRP），用顺式水解酶元件（cis-acting hydrolase element，CHYSEL）技术将R．luc报告基因插入到DENRP缺失的结构基因区，构建含有R．1uc报告基因的复制子（DEN-R．luc2A-RP）。将构建的复制子线性化并体外转录成RNA后，经电穿孔转染BHK-21细胞。通过间接免疫荧光、RT．PCR和R．luc检测技术对复制子进行鉴定。结果：所构建的prM-E基因缺失的复制子和含有海肾萤光素酶报告基因的复制子，均可在BHK-21细胞中自主复制并稳定表达病毒特异蛋白。DEN-R．luc2A-RP可持续表达外源R．luc报告基因21d，在转染后24～96h R．luc荧光信号呈线性增强。在该区间进行实时检测可显示复制子复制和翻译水平的变化。结论：获得了两株可在BHK-21细胞中稳定表达的复制子，为进一步研究登革4型病毒复制和翻译机制奠定了基础。

O型口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建及其鉴定

为构建含有海肾萤光素酶(Rluc)报告基因的O型口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子,本研究在前期构建的O型FMDV cDNA感染性克隆的基础上,利用融合PCR的方法,以Rluc报告基因替换FMDV的前导蛋白Lb基因和结构蛋白P1基因,构建含有Rluc报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDVRep。将该复制子质粒线性化后,经体外转录制备复制子全长RNA,转染BHK-21细胞,通过RT-PCR方法和间接免疫荧光试验分别检测该复制子RNA的自主复制能力以及FMDV非结构蛋白3B的表达情况。结果显示,复制子RNA在BHK-21细胞中能够进行自主复制并且能够表达病毒的非结构蛋白。Rluc活性检测结果表明,该复制子RNA在BHK-21细胞中可以高效表达Rluc,在转染后2 h^12 h Rluc活性呈线性递增,进一步反映该复制子具有良好的表达外源基因的能力。O型FMDV亚基因组复制子的构建,为深入研究FMDV的复制和翻译机制奠定了基础。