粘细菌Myxococcus sp.CYD-1海藻糖合酶基因克隆及酶学特性分析

【目的】海藻糖合酶(trehalose synthase,EC.5.4.99.16)可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,该反应仅需一步,且所用原料低廉,在酶法生产海藻糖上显示出一定的应用潜力。本文以粘细菌Myxococcus sp.CYD-1为材料,挖掘新的海藻糖合酶资源。【方法】以菌株CYD-1基因组DNA为模板,使用加尾PCR的方法克隆编码海藻糖合成酶的基因MCTs,构建含有组氨酸标签的重组表达载体,并将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。重组蛋白经Ni^(2+)-NTA纯化,以麦芽糖为底物研究其酶学性质,包括最适温度、最适pH、温度和pH稳定性及金属离子和抑制剂的影响。【结果】从菌株CYD-1基因组中克隆到一个编码海藻糖合成酶的基因MCTs。MCTs全长1659 bp,编码一个552个氨基酸的蛋白,分子量大小为65 kU。氨基酸序列分析表明MCTs与来源于Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶相似性为92.36%,与其他已报道的海藻糖合酶有较大差异。MCTs具有高度保守的基序202DAVPYL207,244EANQ247和307RNHDEL312,以及活性中心三联体Asp202-Glu244-Asp310,三维建模结果显示MCTs的催化结构域具有典型的(α/β)8桶状结构,表明MCTs归属于糖苷水解酶GH13家族。重组蛋白在E.coli BL21(DE3)中大量可溶性表达后,通过Ni^(2+)-NTA将目的蛋白纯化至电泳纯。重组酶rMCTs最适反应温度为40℃,最适反应pH为6.5,最大比活力为105.6 U/mg。重组酶rMCTs在30℃下处理4 h,残留酶活为50%,但在65℃下处理1.5 h活力丧失。重组酶rMCTs在pH 5.0~8.0范围内有活性,在pH 6.0~7.5处理12 h活力稳定。1 mmol/L Ca^(2+)对重组酶rMCTs有轻微的激活作用,Co^(2+)、Fe^(3+)、Cu^(2+)对重组酶rMCTs有抑制作用,其余金属离子对酶活力无影响。甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂和SDS对重组酶rMCTs有强烈的抑制作用,TritonX-100对rMCTs酶活力无显著影响。【结论】MCTs具有潜在的应用价值,丰富了海藻糖合成酶资源。

理性设计和定点突变对提高海藻糖合酶TreSI热稳定性的影响

[目的]来源于黏细菌Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶(trehalose synthase,EC 5.4.99.16)TreSI可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,在酶法生产海藻糖上有很高的应用前景,其热稳定性是制约该酶工业应用的关键。本文旨在通过定点突变对TreSI相关氨基酸残基进行改造,以期获得热稳定性强的突变子,提高其应用潜力。[方法]使用在线预测软件PoPMuSiC-2.1对TreSI每个氨基酸突变后的去折叠自由能变化(ΔΔG)进行初步预测,以SDM(site directed mutator)和mCSM(mutation cutoff scanning matrix)以及两者联合(Duet)进行预测。用重叠延伸PCR法构建11个海藻糖合酶突变体,经大肠杆菌表达和蛋白纯化后,对其酶学特性进行表征。[结果]成功筛选到2个热稳定性提高的突变子。突变子R149L、N193E的比酶活与野生型无显著差异,且最适pH值和最适反应温度也未发生改变;R149L、N193E在50℃处理1 h的残余酶活性为野生型的1.37和2.50倍;在60℃处理1 h的残余酶活性为野生型的2.41和4.32倍。[结论]本研究利用PoPMuSiC结合SDM、mCSM模拟的设计策略提高了TreSI的耐热性,为工业应用提供了新的酶资源,也为其他工业酶的定向改造提供了参考。

产海藻糖合酶枯草芽孢杆菌破壁及转化工艺研究

以细胞破碎率与海藻糖转化率为考察指标,确定发酵液破壁的最佳方式与参数。结果表明,采取高压均质机1000bar破壁两次破壁效果及海藻糖得率最佳,细胞破碎率可达99.32%,海藻糖转化率可达41.46%,较初始超声波破壁分别提升了12.31%,7.52%。采取单因素法,分别优化单酶法转化海藻糖的pH、温度,通过延长转化时间,监测转化过程中海藻糖得率的变化,确定不同转化时间糖得率的变化趋势,确定最佳的转化周期,并对胞内胞外酶转化的占比进行研究。结果显示,最佳转化条件为转化pH7.8,转化温度35℃,周期28h,在该工艺条件下进行转化,海藻糖浓度可达68.63g/L,较初始条件提升了41.88%,转化率可达48.16%,较未优化前提升了14.22%。

甘蔗根癌农杆菌介导转化海藻糖合酶基因获得抗渗透胁迫能力增强植株

由双拷贝CaMV35S启动子驱动担子菌灰树花 (Grifolafrondosa)的海藻糖合酶基因 (TSase)构建植物表达载体 pBBBT ,通过三亲交配法将 pBBBT导入根癌农杆菌EHA10 5菌株 ,经根癌农杆菌介导转化甘蔗 (Saccha rumhybrid)栽培品种 ,以增强甘蔗的抗旱能力。结果表明 ,甘蔗胚性愈伤组织对EHA10 5菌株敏感 ,甘蔗外植体开始大量形成胚性愈伤组织时是感染的适宜时期 ,用膦丝菌素 (PPT)筛选 ,抗性植株发生频率平均为 4 .5 %。经PCR及dot Southern检测证明 ,TSase已经整合到甘蔗基因组中。部分转化植株根叶畸形、株型异常、生长缓慢。移栽到含PEG80 0 0 17.4 % (w/v)的MS培养基后 。

透性化细胞海藻糖合酶的制备及其性质研究

研究了亚栖热菌CBS-01菌株细胞的渗透处理工艺,并对所得透性化细胞海藻糖合酶的性质进行了考察.结果表明:以2%的甲苯为渗透剂,对10%浓度的菌悬液,50℃渗透处理30～60 min即得透性化细胞海藻糖合酶.该透性化细胞酶的最适反应pH为6.2～7.2,最适反应温度为50～65℃;50℃时,催化麦芽糖生成海藻糖的转化率为70%.

海藻糖合酶基因转化黑麦草及耐旱性研究

以多年生黑麦草(Lolium perenne L.)种子成熟胚为外植体,在MS附加5mg/L2,4-D、500mg/L的L-脯氨酸、130mg/L天门冬酰氨、10mg/LAgNO3的诱导培养基(MSJ)上诱导胚性愈伤组织。用基因枪法将ubiqutin启动子驱动的海藻糖合酶基因(TPS基因)转入多年生黑麦草的胚性愈伤。在含有5mg/LBialaphos的选择培养基上经过2个月的抗性筛选,抗性愈伤组织在分化培养基上生成了898株再生植株,其中的220株检测为阳性株,检测的阳性率占供检株数的24.5%。PCR分析及PCR-Southern杂交鉴定表明,TPS基因已整合到黑麦草的基因组中。抗旱性鉴定表明,转基因黑麦草在干旱胁迫条件下的保水能力增强,电解质渗出率明显低于对照,耐旱性提高。

海藻糖合酶的分子生物学研究进展

海藻糖合酶能够将麦芽糖转化为海藻糖,在海藻糖的工业生产中具有十分重要的意义。本文从海藻糖合酶的基因克隆、基因工程应用、结构和催化机制的研究以及其在微生物体内的功能等方面讨论了海藻糖合酶的研究进展。

水生栖热菌FL-03海藻糖合酶基因的克隆及真核表达

通过基因工程技术合成海藻糖合酶Tres全基因,插入到毕赤酵母菌表达载体pPICZα中。电转化毕赤酵母菌GS115后,经Zeocin抗性筛选阳性菌株。用PCR和全基因测序鉴定目的基因的表达。通过诱导表达目的蛋白,并以SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。成功地构建了pPICZα-Tres重组质粒,并证明目的基因已整合于毕赤酵母菌的基因组。

重组海藻糖合酶工程菌高密度发酵条件的研究

目的:通过对前期构建的海藻糖合酶基因工程菌进行高密度发酵的研究,获得了其高密度工艺条件。方法:采用摇瓶发酵和10L自控罐高密度发酵研究了培养基、pH、发酵方式对工程菌生长及目的蛋白表达的影响,并考察了工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果:海藻糖合酶基因工程菌高密度发酵的培养基为2YT+0.2%葡萄糖,最适pH为7.0,发酵方式为分批补料,通过10L自控罐高密度发酵最终得到的工程菌细胞密度达到了50.78g/L,酶活达到了3.197U/mL。所构建的重组质粒在宿主中得到了稳定遗传。结论:优化了海藻糖合酶基因工程菌高密度发酵的条件,为海藻糖规模化生产奠定了基础。

海藻酸锶凝胶固定化含海藻糖合酶细胞的研究

含有海藻糖合酶的亚栖热菌CBS-01菌株细胞经过透性化处理后,以海藻酸锶凝胶对透性化细胞进行了固定化,当加酶量为12U/g海藻酸钠时,所得固定化细胞的载酶量可达6U/g海藻酸钠。细胞固定化后,最适酶反应pH值由6.5升至7.0,最适酶反应温度未变,为60℃,但热稳定性有所提高,70℃保温60min时,固定化细胞的残存酶活为60%,而未固定化细胞的残存酶活约30%。间歇反应时,固定化细胞催化麦芽糖转化为海藻糖的转化率可达60%,重复使用10次,仍可保持约70%的酶活。

细菌纤维素固定化海藻糖合酶的研究

以细菌纤维素为载体,采用吸附-交联的方法将海藻糖合酶固定化,在最适固定化条件下,15℃吸附20h,然后与6%戊二醛在15℃交联20h。实验发现,与游离酶相比,固定化酶的最适pH值向碱性方向移动0.4,为pH7.4,最适作用温度为45℃,比游离海藻糖合酶提高10℃,酸碱稳定性、热稳定性均有较大提高;重复使用6次后,酶剩余活力保持在87%左右,有较好的操作稳定性和重复使用稳定性。

嗜热栖热菌海藻糖合酶的分子改造及其应用

对前期获得的Thermus thermophilus海藻糖合酶进行了分子改造以提升其催化制备海藻糖的性能。利用定点突变技术,将第251位Pro突变为Leu,得到突变体P251L,并于E.coli BL21(DE3)中重组表达,重组菌在摇瓶中发酵酶活为6.9 U/m L。以突变体催化制备海藻糖的研究表明,当以0.3 g/m L麦芽糖为底物,初始反应p H为7.5,温度为50℃,加酶量为20 U/g麦芽糖时,转化率达到最高值62.0%,比天然酶高出13.0%。

海藻糖合酶研究进展

介绍了海藻糖合酶的来源、性质、固定化及细胞透性化技术。并通过实例探讨适合海藻糖工业化生产的方法,展望海藻糖合酶固定化及透性化技术的研究趋势。

水生栖热菌FL-03海藻糖合酶的分离纯化及特性研究

将从水生栖热菌FL-03中获得的海藻糖合酶粗酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose CL-6B离子交换层析、Sephaeryl S-200HR凝胶过滤层析后，纯化68．48倍，产率为18．4％。研究表明：该酶分子量约为101kD，最适反应温度为60℃，最适pH为7．0，在40～80℃、pH 6.0～9．0范围内具有较高的反应活性和稳定性。Fe^3＋对该酶具有一定的激活作用，Cu^2＋、Tris、Zn^2＋对该酶具有较强的抑制作用。该酶具有高度的底物特异性，只能专一地将麦芽糖转化为海藻糖。在40℃、48h条件下，麦芽糖转化为海藻糖的转化率最大可达到79％。

海藻糖合酶基因工程菌诱导表达条件的研究

实验将构建后的重组质粒pET21TreS转入大肠杆菌Rosetta gami(DE3)中,得到海藻糖合酶基因工程菌,并通过对培养时间、温度及诱导剂浓度等条件的优化,对其进行诱导表达,得到了该基因工程菌诱导表达的最适条件:发酵培养至菌体浓度(OD600)至0.6～0.8时,以1mmol/L浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),37℃,诱导2h后得到的蛋白表达量较高。

透性化海藻糖合酶的研究

海藻糖是一种新型食品添加剂 ,目前其主要生产方法是利用微生物酶法合成。文章研究了在不易破壁取得胞内酶的情况下 ,采用渗透处理细胞技术生产透性化细胞酶的方法 。

乳化法制备交联海藻糖合酶聚集体的研究

交联酶聚集体（CLEAs）是一种高活性的无载体固定化酶，常用的基于溶液法（Sheldon法）制备的CLEAs呈无定形的集簇体，影响其连续使用效率．以海藻糖合酶为模型酶，首次在油包水乳化体系中构建了CLEAs，利用扫描电镜和光学显微镜分析了所得CLEA的微观结构，考察了CLEAs的活性和重复使用性能．结果表明，乳化法制备的CLEAs外观呈较规则的微球形，粒径约20～60μm，其活性和重复使用性能均高于参照Sheldon法制备的CLEAs．

交联海藻糖合酶聚集体的制备及其性质

采用交联酶聚集体(CLEAs)技术制备交联海藻糖合酶聚集体,研究不同沉淀剂、酶与交联剂浓度比例、交联强度及硼氢化钠还原处理对海藻糖合酶CLEAs活性的影响及其结构特征与反应性能。结果表明:采用质量浓度为10mg/mL的酶以质量浓度为30mg/mL的聚乙二醇(PEG)为沉淀剂,以体积分数为0.5%的戊二醛室温交联2h,再以硼氢化钠还原处理后,制备得到的海藻糖合酶CLEAs最适催化温度为70℃,比游离酶提高20℃,最适pH值为7.0,与游离酶相比,CLEAs的温度及pH值稳定性均得到提高,对Zn2+、Cu2+、Fe2+、Al3+金属离子的抗性明显增强。微观形貌分析表明单个海藻糖合酶聚集体粒径在0.2～0.5μm,众多聚集体以"脚手架"结构形成大小不一的集簇。

海藻糖合酶的结构和催化机制研究进展

海藻糖合酶是一种能够催化麦芽糖和海藻糖之间发生双向替换反应的分子异构酶,这种合成途径是目前已知的海藻糖生成方式中最简洁的一条路径。该异构酶的结构特点及作用机制受到学术界和药理学界的广泛关注。该文从海藻糖合酶的晶体结构、催化机制及应用现状三个方面阐述有关海藻糖合酶的最新研究成果,有助于改进海藻糖相关产品研发模式,增加海藻糖工业生产经济效益。

产海藻糖合酶嗜热菌的筛选

采用薄层层析及高效液相色谱对酶反应产物进行分析的方法,从地热水样中筛选出一株产胞内海藻糖合酶的嗜热菌CBS-01菌株。该菌株在固体培养基中细胞为杆状,在液体培养基中细胞通常为丝状,丝状体长度可变,好氧,革兰氏染色阴性,无芽孢,菌落呈圆形,表面光滑,凸起,边缘整齐,暗红色,生长温度范围为40～70℃,最适生长温度为55～60℃,生长pH范围为6.5～9.5,最适生长pH值为7.5～8.5,初步鉴定为亚栖热菌(Meiothermus sp.)。