大豆海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因GmTPP的鉴定及其在生长发育和非生物胁迫响应中的表达分析

海藻糖在植物代谢、生长发育和抗逆性中起着重要作用。海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)基因对海藻糖的生物合成至关重要。大豆是重要豆类作物,种子含有丰富的蛋白质和油脂,其TPP基因家族少有报道。为分析TPP基因在大豆中的结构和功能,利用生物信息学方法在大豆全基因组中筛选得到15个GmTPP基因。系统发育分析表明,这15个GmTPP可分为3个亚家族,每个GmTPP含有9~11个内含子,同一亚家族的GmTPP基因的内含子数目相同。顺式作用元件分析表明,GmTPP基因参与植物激素和环境胁迫反应。此外,还利用转录组数据研究这些GmTPP在不同组织中的表达模式以及对不同的非生物胁迫的表达特征。结果显示,GmTPP在大豆各个组织器官中均有特定的表达模式,在盐胁迫、干旱胁迫处理下表达不同。该研究不仅为揭示GmTPP基因家族在大豆海藻糖调控中的作用奠定了基础,也为利用TPP基因家族提高大豆抗逆性提供一定的参考价值。

沙葱萤叶甲海藻糖磷酸酶基因GdTPP的克隆、原核表达及对温度胁迫的响应

【目的】海藻糖磷酸酶(Trealose-6-phosphate phosphatase,TPP)是参与昆虫海藻糖合成的关键酶之一。本研究旨在克隆和表达沙葱萤叶甲Galeruca daurica海藻糖磷酸酶基因,分析其对不同温度胁迫的响应,以期为进一步揭示其在沙葱萤叶甲生长发育及抗寒、耐热中的作用奠定基础。【方法】根据沙葱萤叶甲转录组数据,通过cDNA末端快速扩增(Rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆沙葱萤叶甲TPP的全长cDNA序列,并对该基因进行生物信息学分析;将该基因与pET28a载体链接构建表达载体,导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)使其表达;利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测TPP基因在沙葱萤叶甲2龄幼虫不同温度下的表达格局。【结果】克隆获得1条沙葱萤叶甲TPP基因cDNA全长序列(GdTPP,GenBank登录号:MG431210),该基因全长1 372 bp,开放阅读框(ORF)864 bp,编码287个氨基酸;蛋白预测分子量为32.32 ku,等电点(pI)为6.19;无信号肽和跨膜结构;包含2个N-糖基化位点;蛋白质亚细胞定位预测该蛋白位于细胞质中。同源性分析表明,GdTPP与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata TPP亲缘关系最近。成功构建原核表达载体pET28a-GdTPP,经IPTG诱导,GdTPP在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中高效表达。qPCR结果表明,低于25℃对照时,GdTPP表达量随着温度下降而上升,﹣10℃时达到最高值,为对照的1.82倍;高于25℃对照时,GdTPP表达量随着温度上升而上升,40℃时达到最高值,为对照的1.68倍。【结论】沙葱萤叶甲幼虫通过上调GdTPP的表达来应对高温和低温胁迫,该结果为进一步揭示TPP在昆虫应对温度胁迫过程中的作用奠定了基础。

结核分枝杆菌海藻糖磷酸磷酸酶诱导小鼠体液和细胞免疫应答

目的 研究结核分枝杆菌（M．tuberculosis）海藻糖磷酸磷酸酶（TPP）诱导小鼠体液和细胞免疫。方法 差速离心分离结核分枝杆菌H37Rv和卡介苗（BCG）的各细胞组分，通过Western杂交检测抗原TPP在结核分枝杆菌H37Rv和BCG中的亚细胞定位情况。分别用5×10^6 CFU的BCG和50μg的TPP蛋白免疫C57BL／6小鼠，检测小鼠血清中抗TPP的IgG1和IgG2a抗体效价。取免疫小鼠的脾细胞，体外抗原刺激，用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测γ干扰素（IFN-γ）分泌细胞。结果 TPP亚细胞定位于结核分枝杆菌H37Rv和BCG的胞壁和细胞膜组分。TPP蛋白免疫后小鼠产生的TPP特异性IgG1和IgG2a抗体效价明显高于BCG免疫小鼠，并且IgG2a的抗体效价高于IgG1。体外抗原刺激TPP蛋白和BCG免疫小鼠的脾细胞，都能诱导较高的IFN-γ分泌。结论 结核分枝杆菌细胞壁蛋白TPP能诱导小鼠Ⅰ型辅助性T细胞介导的免疫反应，可作为抗结核疫苗的候选抗原。

红麻海藻糖生物合成关键酶基因HcTPPJ的克隆及响应逆境的表达分析

海藻糖生物合成关键酶基因TPP在植物响应各种非生物胁迫过程中具有重要作用。为了明确红麻TPP基因在应对非生物胁迫过程中的作用,本研究根据转录组CL541.Contig2Unigene序列设计特异性引物,通过PCR获得红麻TPP基因的cDNA全长序列。生物信息学分析表明,该基因最大开放读码框为1128 bp,编码一个含有375个氨基酸的蛋白质。序列一致性分析发现,该蛋白质氨基酸序列与其他物种TPPJ氨基酸序列的一致性为71.18%,故将该基因命名HcTPPJ。表达模式分析表明,该基因在根、茎、叶中均有表达,在盐、干旱胁迫下,随着胁迫时间的延长,HcTPPJ表达显著上调,表明该基因参与红麻的盐、干旱胁迫响应过程。在盐、干旱胁迫下, HcNCED3显著上调表达,而外源喷施脱落酸时,HcTPPJ表达变化不明显。由此推测,在红麻响应盐、干旱胁迫过程中,该基因的表达可能不受脱落酸信号分子的调控。这将为进一步阐明该基因在红麻响应盐、干旱胁迫过程的作用奠定基础。

海藻糖对盐胁迫下两个沙棘品种逆境生理的影响

通过研究海藻糖对沙棘逆境生理指标的影响规律,探索海藻糖的抗盐生理机制,为生产中应用海藻糖缓解沙棘盐胁迫提供理论依据。试验在盆栽条件下,设置空白对照、盐胁迫+不同浓度的海藻糖(0、0.2、0.4、0.6 mmol·L^(-1))共计5个处理,3次重复。结果表明:0.4 mmol·L^(-1)的海藻糖可以显著提高盐胁迫下两个沙棘品种叶片内的叶绿素、游离脯氨酸含量,降低MDA含量;海藻糖会提高盐胁迫下两个品种沙棘叶片内海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)活性,提高可溶性糖和可溶性蛋白含量;0.4 mmol·L^(-1)的海藻糖对提高TPP活性效果优于0.2 mmol·L^(-1)和0.6 mmol·L^(-1)处理,有利于可溶性糖的积累,缓解盐胁迫对沙棘的危害。海藻糖对TPP活性的调控作用可能是其缓解沙棘盐胁迫的生理机制,0.4 mmol·L^(-1)为适宜的喷施浓度。

茶树TPP基因家族的鉴定及其对低温胁迫的响应

[目的]本文旨在鉴定茶树海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)基因家族,并探索其在茶树抵御低温胁迫调控中的功能。[方法]利用生物信息学的方法,对茶树TPP基因家族进行进化树、保守结构域、启动子顺式元件等特性进行分析;通过茶树TPP基因家族的组织特异性表达及其对低温胁迫的响应,初步探讨CsTPP的生物学功能。[结果]从茶树基因组中鉴定到12条具有Trehalose-PPase保守结构域的CsTPP序列。系统进化树分析表明,根据与拟南芥、水稻的TPP基因同源性差异比较,可以将CsTPP分成3组。启动子顺式元件分析表明,CsTPP的启动子区含有多个胁迫响应相关元件和激素响应相关元件。基因表达分析显示,12个CsTPP基因在不同组织的表达量差异较大,具有明显的组织表达特异性。低温胁迫响应分析显示,4个CsTPP基因可能参与茶树叶片响应低温胁迫过程。[结论]CsTPP基因家族可能参与茶树响应低温胁迫的过程。

烟草TPP基因家族鉴定及表达模式分析

海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)是植物海藻糖代谢过程的关键酶,在植物的生长发育及非生物胁迫响应过程中发挥着重要的作用。为挖掘参与烟草发育及抗逆胁迫的TPP基因家族成员,本研究通过生物信息学的方法,在普通烟草基因组中共鉴定出了15个TPP基因,其中7个TPP基因定位在染色体上。系统进化分析发现,新鉴定的烟草TPP成员可分为3个亚家族,分别为CLASS Ⅰ、CLASS Ⅱ和CLASS Ⅲ。共线性分析表明,有5个烟草Nt TPP基因分别与7个拟南芥AtTPP基因形成同源基因对。启动子分析发现,NtTPP成员的启动子上存在多种激素和非生物胁迫响应元件。表达模式分析发现,NtTPP基因表达具有一定的组织特异性,大部分NtTPP基因在根中的表达量最高,有12个NtTPP基因在干旱胁迫下表达量上调,13个NtTPP基因能够被盐胁迫显著诱导表达。这说明NtTPP基因家族成员在烟草非生物胁迫应答中发挥着重要作用。

水稻OsTPP3基因的克隆及生物信息学分析

海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)是海藻糖合成的关键酶,通过合成具有渗透能力的海藻糖增加植物在逆境中的存活能力。本研究通过克隆得到水稻OsTPP3基因并构建原核表达载体进行体外表达,对基因启动子顺式作用元件组成、表达模式和模拟蛋白三维结构等生物信息学分析,揭示OsTPP3基因在水稻抵抗逆境胁迫中的作用。结果显示,OsTPP3基因编码366个氨基酸,预测分子量39.99 kD,成功构建原核表达载体并体外表达。OsTPP3蛋白具有三个保守的基序构成酶活性位点,蛋白两个结构域之间是底物结合位点。OsTPP3基因的基因芯片结果显示在正常生长条件下各器官均检测到表达信号,是组成型表达基因。但在花和种子各器官中表达量明显较高;7 d幼苗经干旱和盐胁迫处理后,OsTPP3基因在根和芽中表现出表达量明显增加的特点。OsTPP3基因启动子组成元件预测基因表达模式与基因芯片表达情况一致。通过对OsTPP3基因表达模式的研究,发现其在生长发育和渗透性胁迫中发挥重要功能,可作为转基因遗传育种的备选基因。