茶树海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)基因家族鉴定与表达分析

【目的】海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是植物体内海藻糖生物合成通路中的关键酶。对茶树[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]TPS基因家族进行鉴定和分析,并研究其在逆境胁迫下的表达模式,为开展TPS基因功能验证提供基础。【方法】利用生物信息学方法鉴定茶树CsTPS基因家族成员,分析其编码的蛋白理化特性、保守基序与结构域、染色体定位、系统进化关系和启动子顺式作用元件等生物学信息,利用转录组数据结合RT-qPCR技术分析CsTPS家族成员在干旱、盐和低温胁迫下的表达模式。【结果】在茶树基因组中鉴定到16个TPS基因家族成员,系统发育分析将它们划分为Class I和Class II两个亚族。同一亚族成员具有相似的motif组成和基因结构。共线性与进化分析表明,CsTPS基因在茶树基因组内发生了基因复制事件,且它们在进化过程中经历了纯化选择作用。RT-qPCR结果显示,6个候选基因CsTPS3、CsTPS5、CsTPS6、CsTPS9、CsTPS11和CsTPS14均被PEG、NaCl和低温胁迫诱导,且表达模式与转录组结果一致。【结论】从茶树全基因组中系统鉴定出16个TPS家族成员。茶树CsTPS3、CsTPS5、CsTPS6、CsTPS9、CsTPS11和CsTPS14基因对干旱、盐和低温胁迫均有响应,但其敏感性水平各不相同。

香蕉海藻糖-6-磷酸合成酶基因MaTPS2克隆及表达特性分析

在获得MaTPS2基因全长序列的基础上,采用同源序列比对、聚类分析、实时定量PCR等技术初步探讨香蕉MaTPS2基因的功能。从香蕉A基因组中获得一条3 277bp MaTPS2全长序列,包含一个完整的开放阅读框1 344bp,编码蛋白含447个氨基酸。其氨基酸理化性质分析表明,MaTPS2蛋白属于不稳定疏水性蛋白,具有一个结构域GT1-TPS。通过与已知植物的TPS氨基酸同源序列比对,同源性达77.95%。系统发育树进化关系分析表明,MaTPS2编码的氨基酸序列与银杏TPS氨基酸序列(AAX16014.1)邻近,说明二者的亲缘关系较近。器官特异性分析表明,MaTPS2在香蕉植株的根、球茎、假茎、叶、花各器官中均有表达,其中在球茎、假茎和叶中表达量较多,在果实中表达量较低。在ABA、干旱、盐害和枯萎病菌胁迫处理下,MaTPS2表达量升高,在ACC胁迫处理下,MaTPS2表达量显著下降,而低温胁迫条件下,MaTPS2表达不响应。由此推导,MaTPS2可能参与调控香蕉抗旱、抗病机制。植物生长调节剂ACC和ABA胁迫处理说明MaTPS2的表达可能受激素蛋白间接调控。

杨树桑黄6-磷酸海藻糖合成酶基因克隆鉴定与表达分析

对杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)6-磷酸海藻糖合成酶基因(SvTPS)进行克隆和生物信息学分析,并进行原核表达;采用荧光定量PCR方法研究SvTPS在杨树桑黄菌丝体和不同年份子实体中的表达情况,测定菌丝体和不同年份子实体中SvTPS活性。结果表明:SvTPS DNA序列长度为1894 bp,编码576个氨基酸。SvTPS相对分子质量为65130,等电点为6.21,脂肪系数为88.14,平均亲水系数为-0.281,不稳定系数为42.41。SvTPS氨基酸序列与暴马桑黄(S.baumii)的相似性最高,仅有一个TPS单结构域;SvTPS二级结构中α-螺旋、β-折叠、延伸链、无规卷曲占比分别为48.61%、5.56%、15.62%、30.21%。三年生子实体SvTPS的表达量最高,菌丝体的表达量最低。菌丝体的SvTPS活性最低;随着栽培时间增加,SvTPS活性增加,三年生子实体的最高。研究结果为进一步探讨SvTPS在杨树桑黄生长发育过程中的功能提供参考。

香蕉海藻糖合成酶基因(MaTPS5)生物学及表达特性分析

通过研究香蕉Ma TPS5基因的生物学功能,探讨海藻糖合成酶基因在香蕉植株抗逆反应中的作用。利用随机克隆测序法从香蕉根系转录组中获得海藻糖合成酶基因,命名为Ma TPS5。生物信息学分析表明,Ma TPS5全长c DNA序列3 081 bp,完整开放阅读框2 559 bp,编码852个氨基酸;Ma TPS5蛋白属于不稳定、疏水性蛋白,等电点p I6.52,有两个结构域GT1-TPS和TPP,定位于细胞质中,含2个跨膜区域,不存在信号肽;与已知植物TPS氨基酸序列同源性达到77.31%;进化分析表明,香蕉Ma TPS5氨基酸序列与野蕉TPS氨基酸序列聚为一类,说明二者亲缘关系较近,具有共同的祖先。组织特异性表达研究表明Ma TPS5在球茎、叶、花中表达量较高,在根中表达量最低。q RT-PCR分析表明,Ma TPS5响应激素ACC和盐的处理,表达量在24 h均达到极显著水平。在Foc TR4病原菌处理后,表达量升高,并在3个时段保持一致。结果表明,Ma TPS5可能依赖乙烯信号传导途径诱导自身表达,合成海藻糖,参与香蕉抗逆反应。

海藻糖-6-磷酸合成酶转基因烟草提高耐盐性的研究

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-pho sphate synthase,TPS)是海藻糖合成途径中的一个关键酶,近些年来受到广泛关注,以往的研究多数集中于细菌和真菌等,而对植物体内TPS基因的研究较少。为此,我们首先通过RT-PCR(reverse tran-scription PCR)克隆得到了拟南芥的TPS基因,进而将其构建到原核高效表达载体pET30a(+)上并在大肠杆菌BL21中进行高效诱导表达。在确认该基因能够在体外正常表达之后,将其构建到植物表达载体上并转入烟草体内,通过实时荧光定量PCR检测,证明在转基因个体中目的基因已经在受体基因组上完成整合,并且在其中的2个个体中实现了正常转录。在对目标个体进行海藻糖含量的测定以及抗逆性实验后发现,S5个体具有良好的表现,其体内海藻糖的含量明显高于其它个体,并具有较强的耐受盐胁迫的能力。

酿酒酵母海藻糖-6-磷酸合成酶基因克隆及植物表达载体的构建

从耐热性极强的酿酒酵母菌株AS2 1 41 6中分离纯化出总RNA和mRNA ,以AMV逆转录酶合成cDNA ,采用保守引物 ,从该cDNA中扩增克隆出tps1基因 ,对该基因的全序列分析表明 ,该基因含有 1 50 7个核苷酸 ,与国外报道相关基因的同源性达 99 6%。利用BamHⅠ和SacⅠ切点将tps1基因插入植物表达载体 pBin438多克隆位点上 ,得到tps1基因植物表达载体重组质粒。

碱茅6-磷酸海藻糖合成酶基因的克隆及其耐逆性分析

从碱茅酵母cDNA文库中经过NaCl、NaHCO。筛选，均得到长为1153bp碱茅6一磷酸海藻糖合成酶基因（PutTPS）片段。通过3’End cDNA amplification方法获得基因缺失的3’序列，该基因全长3358 bp，编码882个氨基酸。氨基酸序列比较结果表明，PutTPS氨基酸序列与水稻、拟南芥、玉米等多种高等植物的TPS蛋白的同源性高达60％～90％。利用Northern blot技术，研究该基因的组织表达模式及NaCl、NaHCO3胁迫处理下基因的表达模式变化；同时对转pYES2-PutTPS基因酵母菌株进行盐、碱、氧化胁迫、渗透胁迫处理，观察其在逆境下的生存表现。结果表明，PutTPS具有组织表达特异性，其中在根和花中表达量最大；NaCl、NaHCO3会诱导PutTPS基因在根和叶中的上调表达；同时重组酵母菌株对盐碱、氧化、渗透胁迫及干旱等逆境的适应能力显著增强。以上研究结果表明，碱茅PutTPS基因与逆境之间具有一定的应答关系，并在植物适应环境逆境过程中起着重要的作用。

海藻糖-6-磷酸合成酶基因的序列优化与表达研究（英文）

为了获得一个优良的玉米抗旱育种基因资源,借助于生物信息学手段和分子生物学实验操作技术,从木棉植物中获得了一个编码海藻糖-6-磷酸合成酶的抗旱基因序列。根据玉米对密码子使用的偏爱性,合成了1个可用于玉米转化并提高其耐旱性的新的海藻糖-6-磷酸合成酶基因,进一步通过DNA分子的酶切和连接等操作将该基因构建成表达质粒,再导入大肠杆菌和酵母细胞以鉴定其是否能在原核和真核细胞中表达。最后该基因被构建到植物表达载体上,并转入农杆菌细胞。结果表明,新合成基因全长为2 586 bp,包含完整的开放阅读框,编码861个氨基酸;构建出的原核和真核表达质粒与预期的结果相符,该基因可用于细胞转化试验;该新合成基因能在大肠杆菌和酵母细胞中有效表达出海藻糖-6-磷酸合成酶;该基因被成功构建到植物表达载体p CAMBIA-2300上,并转入了农杆菌细胞LBA4404工程菌株。综合上述结果认为,获得了1个新的海藻糖-6-磷酸合成酶基因,该基因能在原核和真核细胞中有效表达出海藻糖-6-磷酸合成酶,构建的植物基因表达质粒可以直接用于玉米抗旱转基因育种。

垫状卷柏海藻糖-6-磷酸合成酶基因的克隆及功能分析

海藻糖-6-磷酸合成酶(Trehalose-6-phosphate synthse,TPS)是植物海藻糖合成途径的关键酶,在旱生卷柏等复苏植物对逆境胁迫应答中起重要作用。文章以我国特有旱生植物垫状卷柏(Selaginella pulvinata)为材料,采用同源扩增与RACE技术相结合的方法克隆了海藻糖-6-磷酸合成酶基因SpTPS1,cDNA全长3223bp,包括一个2790bp的开放阅读框,推导的氨基酸序列与模式物种的海藻糖-6-磷酸合成酶具有较高的序列相似性,催化活性中心保守位点基本一致。酵母功能互补实验证明,用SpTPS1基因开放阅读框转化的海藻糖合成酶基因突变(tps1△)酵母菌株,可恢复在以葡萄糖作为唯一碳源培养基上的生长,说明垫状卷柏海藻糖-6-磷酸合成酶基因SpTPS1的编码蛋白具有生物活性,可应用于植物抗逆性的转基因改良。

甜瓜海藻糖-6-磷酸合成酶基因鉴定及表达

为了明确甜瓜海藻糖-6-磷酸合成酶基因(CmTPS)家族信息及对逆境信号的响应,该研究采用生物信息学方法,通过拟南芥TPS家族基因与甜瓜基因组数据库比对,从甜瓜基因组中共鉴定出7个海藻糖-6-磷酸合成酶基因,按照其在染色体上的位置分别命名为CmTPS1~7。系统进化分析结果显示,CmTPS4和CmTPS7为第1类,二者均含有16个内含子,推测其编码产物均具有海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)活性;其余5个CmTPS基因归为第2类,分别含有2~4个内含子;在这7个甜瓜TPS中,除CmTPS3只有TPS结构域外,其余CmTPS都含有TPS、TPP及UDP-forming结构域;蛋白序列比对结果显示,甜瓜TPS家族各成员间相似性较低(15.90%~57.31%);亚细胞定位预测表明,CmTPS1、CmTPS2和CmTPS6定位在细胞核内,其余4个CmTPS定位在细胞质内。qRTPCR表达分析表明,低温胁迫下甜瓜叶片可能以CmTPS4为主要的TPS编码基因;CmTPS基因家族对盐胁迫较为敏感,同时在ABA信号传递中起调控作用。这为进一步研究甜瓜TPS基因家族奠定了基础。

植物海藻糖-6-磷酸合成酶基因研究进展

海藻糖-6-磷酸代谢通路是植物响应非生物胁迫生理调控网络中的重要组成部分,海藻糖-6-磷酸合成酶基因TPS(Trehalose-6-phosphate synthase)是植物合成海藻糖的关键基因。为了更加充分地理解TPS基因在植物应答非生物胁迫、调节开花时间等方面的作用,本文首先对植物TPS基因家族成员的系统进化关系及序列结构信息进行了研究,重点论述了TPS基因在植物响应干旱、盐害、高温、低温胁迫中的调控功能及分子作用机制,最后对TPS基因参与植物开花调控的研究进展进行了综述。本文深入总结了目前植物TPS基因响应非生物胁迫及开花调控的研究进展,并对今后TPS同源基因的研究方向和应用价值进行了展望。

红花1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因CtDXS1的克隆及表达分析

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase,DXS)是2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)途径中的第一个关键酶,在植物萜类化合物生物合成中起着重要作用。为了明确红花DXS基因的序列特征和表达特点,结合红花转录组数据,以豫红花1号为试验材料,首次克隆得到1个红花DXS基因的全长cDNA序列,命名为CtDXS1,并对其进行生物信息学分析和基因表达特点分析。结果表明,红花CtDXS1基因的开放阅读框(ORF)长2136 bp,编码711个氨基酸,其蛋白质分子质量是76503.10 u,蛋白质保守区预测表明,CtDXS1具有典型的转酮醇酶家族功能结构域。系统进化分析显示,CtDXS1与来自黄花蒿的DXS亲缘关系最近,属于DXS基因家族的Ⅰ类基因。组织特异性表达分析表明,CtDXS1基因在苞片中表达量最高,其次是叶和茎,在其他组织部位中表达量较低;不同花色红花基因表达定量分析表明,CtDXS1基因在黄色红花中表达量较高;干旱、低温胁迫能够诱导CtDXS1基因表达上调;茉莉酸甲酯(MeJA)能诱导CtDXS1基因的表达,而赤霉素(GA3)和脱落酸(ABA)对CtDXS1基因表达有一定的抑制作用。构建原核表达载体pET28-CtDXS1并转化至大肠杆菌Transetta(DE3)进行原核表达,成功表达了CtDXS1重组蛋白。

芥蓝1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因BaDXS1的克隆及原核表达

本研究以芥蓝为实验材料,采用同源克隆的方法分离出Ba DXS1基因,其开放阅读框为2 139 bp,编码712个氨基酸。理化性质分析表明,Ba DXS1蛋白的分子量为77.21 ku,等电点p I为8.59,不含跨膜区域,位于植物细胞叶绿体内。氨基酸序列比对发现,芥蓝DXS1与甘蓝、拟南芥、烟草、番茄等植物的DXS蛋白序列的一致性达到79%以上;系统进化树分析显示,芥蓝DXS1与甘蓝DXS的亲缘关系最近。构建原核表达载体p EASY-Blunt E1-Ba DXS1,并对其进行诱导表达,发现该蛋白在大肠埃希菌体内主要以包涵体的形式存在。

卷叶贝母1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因的克隆与表达分析

【目的】MEP途径是合成生物碱、萜类物质前体的重要途径之一,1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DXS)是MEP途径中的第1个限速酶。为了解卷叶贝母DXS的结构和功能特点,本研究利用分子生物学手段对其进行分析,以期为贝母生物碱合成途径研究打下基础。【方法】采用PCR技术克隆卷叶贝母FcDXS基因开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)序列,运用生物信息学方法对其进行序列分析,预测其潜在的功能。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测FcDXS基因在野生状态(根、茎、叶、鳞茎)和组培诱导物(愈伤组织)中的表达情况。【结果】获得了2151 bp FcDXS基因ORF片段,编码716个氨基酸,并与NCBI公布的砂仁等植物DXS蛋白相似性达80%以上;在Fc DXS蛋白的二级、三级结构预测中,得出Fc DXS蛋白主要由α螺旋构成; qRTPCR检测结果表明FcDXS基因在野生状态下鳞茎表达量最高,激素诱导状态的愈伤组织表达量则是野生鳞茎的5倍。【结论】Fc DXS蛋白质特征区及同源性等生物信息学分析表明该蛋白的结构域较保守,结合荧光定量分析结果证明,Fc DXS是一个有生物学功能且受激素诱导表达的蛋白质。本研究为后续利用基因工程手段提高卷叶贝母生物碱含量奠定了理论基础。

烟草1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因全长cDNA的克隆及表达分析

利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结合快速扩增cDNA末端(RT-PCR)技术克隆了烟草1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因的全长cDNA(GenBank accession number: CBA12009)。序列分析表明该基因全长2386 bp,含有一个编码718个氨基酸残基的开放阅读框(ORF)。根据cDNA序列预测的蛋白质的理论等电点和分子量分别为7.31和77.413 kDa。该蛋白与辣椒和番茄的DXS的氨基酸序列的同源性分别达到96%和95%。对来自10种植物(包含烟草)的DXS的聚类分析显示,烟草的DXS与辣椒和番茄的DXS同属一个支系。Northern杂交分析显示,DXS基因在叶片和幼茎中表达水平最高,而在根和花器官中表达水平很低,这表明该基因的产物可能在绿色组织中参与次生物质的代谢。该基因cDNA序列的获得为通过基因工程途径改良烟叶香气品质奠定了基础。

凡纳滨对虾6-磷酸海藻糖合成酶在抗高温胁迫中的表达特征

6-磷酸海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成的关键酶,在生物体逆境胁迫应答中发挥着重要的作用。本研究以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)高温胁迫转录组测序的Unigene序列为基础,采用直接PCR扩增的方法,获得了TPS部分cDNA(完整的ORF和部分UTR)序列(LvTPS)。序列分析结果显示,LvTPS序列包含1个2529 bp的开放阅读框,可编码842个氨基酸,分子量为95.4 kDa,等电点为6.17。LvTPS具有Glyco-transf-20和Trehalose PPase 2个功能结构域。多序列比对结果显示,LvTPS与中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)的相似性最高,为63.73%;系统进化树显示,凡纳滨对虾与中国对虾亲缘关系最近,并与蓝蟹(Callinectes sapidus)、脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)、克氏原螯虾(Procambarus clarkia)等无脊椎动物聚为一支,脊椎动物单独聚为一支。基因表达水平的定量分析结果显示,LvTPS在鳃、肝胰腺、眼柄、心脏、神经和肌肉6种组织中均表达。鳃和肌肉表达量基本相同,为最高;眼柄、心脏和神经表达量次之,显著低于鳃和肌肉中的表达量(P<0.05);肝胰腺中表达量为最低,显著低于其他5种组织中的表达量(P<0.05)。与26℃温度下的凡纳滨对虾相比,水温升至32℃时,眼柄和心脏中的LvTPS显著上调表达(P<0.05);水温升至38℃时,鳃、肝胰腺、眼柄和心脏中LvTPS显著上调表达(P<0.05)。其中,在肝胰腺中表达量变化较显著。之后,随着温度的下降,其表达量总体呈下调趋势。回温至32℃和26℃时,6种组织中LvTPS基因表达量与对照组均无显著性差异。在神经和肌肉中,不同温度胁迫下的LvTPS基因表达量没有显著变化。上述研究结果表明,LvTPS与凡纳滨对虾应对高温胁迫过程密切相关。本研究可为解析凡纳滨对虾应答高温胁迫机制提供一些基础数据。

酵母海藻糖磷酸合成酶基因的PCR扩增及其产物克隆

以海藻糖高产菌株啤酒酵母SaccharomycescerevisiaeAS2.1416的cDNA克隆为模板 ,根据国外报道的序列 ,设计适当的引物 ,利用PCR技术 ,克隆出大约1.5kb的片段。PCR产物经低溶点胶纯化 ,与pBluscript载体连接并转化大肠杆菌DH -5α ,阳性重组子经酶切鉴定 ,表明已获得海藻糖磷酸酶基因PCR产物及其克隆。

酵母海藻糖合成酶基因植物表达载体的构建

以从原核表达载体中酶切得到的 tps1基因为模板 ,设计适当的引物 ,利用 PCR技术 ,克隆出核苷酸数大约 1.5 k的片段 .PCR产物经回收后 ,与 PCAMBIA130 3载体连接并转化大肠杆菌 DH5 a,阳性重组子经PCR鉴定 ,结果表明已获得海藻糖磷酸合成酶基因的植物表达载体 .

荆芥1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因克隆及生物信息学分析

目的克隆荆芥1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,StDXS)基因,并进行生物信息学分析。方法根据荆芥转录组数据获得的StDXS基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR技术获得StDXS基因cDNA的全长序列,并进行生物信息学分析。结果荆芥StDXS基因全长2177 bp,包含一个长度为2157 bp的开放阅读框,编码718个氨基酸,其理论相对分子质量为77240,等电点为6.32,定位于叶绿体,不存在跨膜区及信号肽,为非分泌蛋白。同源系统进化树分析表明,该序列与同科植物鼠尾草的DXS基因进化关系较近,均属于DXS1亚家族。密码子偏性分析表明,该基因偏好使用以A/T结尾的密码子,具有28个偏性密码子,烟草为该基因最适合的外源表达宿主。结论成功克隆荆芥StDXS基因并进行生物信息学分析,为从分子水平调控荆芥的生长发育和改善药材产量和品质提供理论基础。

香蕉MaTPS1基因序列及其表达特性分析

通过随机克隆测序法,从香蕉根系cDNA文库中获得海藻糖合成酶基因,命名为MaTPS1。MaTPS1扩增获得cDNA序列,全长3 946bp,开放阅读框2 562bp,编码853个氨基酸。生物学信息分析表明,MaTPS1蛋白属于不稳定蛋白,等电点4.72,具有TPS和TPP结构域。序列预测分析表明,MaTPS1蛋白定位于细胞质中,不存在信号肽,为跨膜疏水蛋白。与已知植物TPS氨基酸同源序列比对结果显示,一致性达74.81%,其中与2种马来西亚野生蕉、玉米、野茶树、中果咖啡的TPS编码氨基酸序列一致性分别为100%、79.91%、71.33%、63.93%和65.13%。器官特异性分析表明,MaTPS1在香蕉的根、球茎、假茎、叶、花和果实中都有表达,其中在根、球茎、假茎和花中表达量较高。qRT-PCR分析表明,ABA、ACC、干旱、低温、盐害和枯萎病胁迫处理后,MaTPS1表达量在盐胁下增加,于24h时达到最高,而在其他胁迫下较正常条件下降低。研究认为,MaTPS1可能参与调控香蕉抗盐胁迫机制,从而提高香蕉耐盐性。