海藻酸裂解酶基因在毕赤酵母中的表达及重组酶性质的初步研究

褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）是一种海藻酸降解菌.本实验采用PCR的方法,以褐球固氮菌基因组DNA为模板,克隆出约1.05 kb的海藻酸裂解酶基因algL的成熟蛋白编码序列,并将其插入巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K-algL.重组质粒线性化后用聚乙二醇（PEG）法导入毕赤酵母菌株GS115中,获得高效分泌表达海藻酸裂解酶的毕赤酵母工程菌株.用甲醇诱导培养基进行摇瓶发酵,表达得到43 kDa的目的蛋白,酶活力可达1 400 U/cm^3左右.经测定,该重组酶的最适反应pH为8.5,最适反应温度为40℃,并且在20-55℃,pH2.0-11.0具有较好的稳定性.另外,10 mmol/cm^3的Cu^2＋,Fe^2＋,Co^2＋,Mn^2＋和Ca^2＋对酶有不同程度的抑制作用.

海藻酸裂解酶酶学与基因工程研究进展及应用

海藻中富含海藻酸盐,海藻酸裂解酶降解后产生的寡糖物质具有很强的生物活性及益生作用,酶法降解海藻酸盐的生物降解取代传统的化学降解已日益受到人们的关注,就海藻酸盐降解酶的来源、作用机制、应用效果和影响因素进行了全面综述,阐明了海藻酸盐降解酶的研究具有显著的理论意义和应用价值。

Shewanella haliotis BP-1海藻酸裂解酶基因的克隆表达

【目的】了解海洋细菌Shewanella haliotis B P-1中海藻酸裂解酶降解海藻酸钠的生物活性。【方法】应用基因克隆和大肠杆菌异源表达技术,过量表达海藻酸裂解酶,将粗酶液通过 DEAE Sepharose FF柱分离纯化后检测其酶活性。【结果】从S.haliotis BP-1菌株的基因组DNA中克隆得到一个大小为2157 bp的海藻酸裂解酶基因Alg17S ,该基因编码的海藻酸裂解酶 Alg17S属于PL17家族的蛋白,大小为79726 Da,其中包括N端26个氨基酸的信号肽,与Saccharophagus degradans 2-40菌株产生的海藻酸裂解酶 Alg17C 具有高度同源性,相似性为52%。经纯化后获得的重组酶 Alg17S和△snAlg17S（N端不含26个氨基酸的信号肽）均具有降解海藻酸钠的活性,但△snAlg17S对海藻酸钠的催化活性比 Alg17S高,其酶比活力高达9635 U/mg。【结论】重组海藻酸裂解酶△snAlg17S兼具高表达水平及高酶活性,是进一步研究海藻酸盐糖化和生物燃料生产的潜在的优势酶。

解藻酸弧菌株ATCC 17749中海藻酸裂解酶基因的克隆与鉴定

以解藻酸弧菌株(Vibrio alginolyticus)ATCC 17749为研究对象,利用生物信息学寻找并预测得到5个可能的海藻酸裂解酶基因algV1、algV2、algV3、algV4和algV5。通过构建5个以pET-28a(+)为载体的大肠杆菌表达质粒pET28a-algV1、pET28a-algV2、pET28a-algV3、pET28a-algV4和pET28a-algV5,实现了5个基因的异源表达,并经海藻酸裂解酶定量和定性的活性分析,确定5个基因的编码产物都具有海藻酸裂解酶活性,其中重组的algV1、algV2和algV3为胞外酶,algV4和algV5为胞内酶。

海藻酸裂解酶异源表达研究进展

海藻酸裂解酶是通过β-消除反应切断海藻酸分子中的糖苷键,产生非还原性端具有不饱和双键的糖的酶.通常作为制备海藻酸寡糖的工具酶,广泛应用于医疗、食品和生物质能源等领域的研究.介绍了海藻酸裂解酶异源表达的研究现状、存在的问题和发展的趋势.

海藻酸裂解酶的发酵条件优化

通过纯化实验,从海带(Laminariajaponica)得到1株具有较高海藻酸酶活力的菌。对其发酵培养,测定发酵液的酶活力,得出海藻酸酶发酵获得最大酶活力的条件:pH7.5左右,25℃,褐藻酸钠添加量为0.5%,蛋白胨作为主要氮源时,连续培养144h。

来自Yeosuana marina sp.JLT21内切型海藻酸裂解酶的异源表达及酶学表征

褐藻寡糖有着丰富的生物学功能,酶法制备功能性褐藻寡糖具有重要实践应用价值。为发掘高活性及稳定性的褐藻寡糖制备酶,对浅海热液嗜热菌Yeosuana marina sp.JLT21中的海藻酸裂解酶YMA-1的基因在大肠杆菌中进行表达、纯化及酶活鉴定。结果发现YMA-1由306个氨基酸残基构成,是多糖裂解酶家族7(PL7)新成员;重组YMA-1酶的最适催化条件是55℃,pH 9.0,比活力1.3×10^(4) U/mg,Cu^(2+)可有效促进酶活;在37℃,pH 9.0条件下,该酶对海藻酸钠、聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸的比活力分别达到(5201.21±86.46)U/mg、(6399.73±253.12)U/mg和(3751.68±116.25)U/mg,酶解海藻酸钠终产物多为不饱和三糖和四糖,表现出内切双功能型海藻酸裂解酶活性。YMA-1酶作为PL7家族中较宽底物谱、高活性及稳定性的内切海藻酸裂解酶,在高效绿色生产功能性褐藻寡糖上有着潜在应用价值。

Mangrovibacterium sp.SH-52耐热内切型海藻酸裂解酶基因的克隆及酶学鉴定

研究来自厌氧海藻酸分解菌的海藻酸裂解酶,表征其酶学特征,旨为丰富海藻酸裂解酶工业应用提供理论依据。从一株厌氧菌Mangrovibacterium sp.SH-52中克隆一个海藻酸裂解酶基因SHA-I,分析基因序列,并在大肠杆菌中进行异源表达,纯化后对其酶学性质进行分析。SHA-I由362个氨基酸构成,分子量大约为41 kD,与Lewinella cohaerens中的海藻酸裂解酶同源性最高,为80%,属于多聚糖裂解酶类(Polysaccharide lyase,PL)7家族。SHA-I最适pH为7.0,最适温度是50℃,在60℃时的活性超过最高活性的50%,在80℃时约为最高活性的40%,表明SHA-I是一种耐热性海藻酸裂解酶。SHA-I对polyG(聚甘露糖醛酸)有底物特异性,其降解海藻酸主要产生二糖和三糖,是一种内切型海藻酸裂解酶。

厌氧菌Sunxiuqinia sp. SH-52外切型海藻酸裂解酶的异源表达及酶学特征

【背景】目前已报道的海藻酸分解菌多数为好氧菌,未见有关厌氧菌的报道。从分离的海藻酸分解菌中表征的海藻酸裂解酶大多为内切型海藻酸裂解酶,外切型较少。【目的】研究来自厌氧海藻酸分解菌的海藻酸裂解酶基因,表征新型海藻酸裂解酶并阐明其酶学性质,为海藻酸裂解酶的多样性和微生物降解海藻酸机制提供理论依据。【方法】对来自厌氧海藻酸分解菌Sunxiuqinia sp. SH-52的海藻酸裂解酶SHA-4编码基因进行克隆,分析基因序列,构建重组质粒PGEX-4T-1-SHA-4并在大肠杆菌中实现异源表达,经纯化后对其酶学性质及降解特征进行研究。【结果】该酶在28°C、用0.1 mmol/L IPTG (异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)条件下诱导6 h达到最大表达量,纯化后酶的比活力达到21 U/mg。酶学性质分析表明SHA-4的最适温度为37°C;最适pH为7.5;对PolyMG (杂聚古罗糖醛酸-甘露糖醛酸嵌段)具有底物偏好性;Na+对该酶的活性具有抑制作用,而金属离子Cu^(2+)具有明显促进作用,使活性提高了约168%;SHA-4催化海藻酸的Km值为2.5 mg/mL,Vmax为8.7 mg/(mL·min);SHA-4为外切型海藻酸裂解酶,降解海藻酸终产物为单糖。【结论】异源表达了来自一株厌氧海藻酸分解菌Sunxiuqiniasp.SH-52的海藻酸裂解酶SHA-4,该酶是PL6家族中第一个对PolyMG有底物偏好性的外切型海藻酸裂解酶,而且活性较高,作为工具酶有很好的应用前景,为海藻酸降解机制的探索提供了新的线索。

海藻酸裂解酶高产菌株Microbulbifer sp.SH-1的分离、鉴定及其产酶条件优化

【目的】筛选一株海藻酸裂解酶高产菌株,并通过优化产酶条件提高海藻酸裂解酶活性。【方法】以海藻酸钠为唯一碳源的培养基,对福建漳州滨海土壤中的微生物进行筛选和分离,获得海藻酸裂解酶高产菌株;依据形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析对目的菌株进行鉴定;然后通过单因素和正交试验对其产酶条件进行优化。【结果】十六烷基吡啶(CPC)染色得到4株透明圈与菌落直径比值(D/d)>3的菌株;DNS法测定4菌株发酵液中海藻酸裂解酶活力,其中菌株SH-1的海藻酸裂解酶活性最高,达到315.52 U/mL;经形态、生理生化和16S rDNA测序鉴定,将其命名为Microbulbifer sp.SH-1;通过单因素和正交试验优化,确定该菌株最适产酶培养基为:海藻酸钠10 g/L,NaCl 5 g/L,(NH4)2SO45 g/L,MgSO40.2 g/L,K2HPO41 g/L,FeSO40.02 g/L。对培养条件的进一步优化结果发现,在初始pH 7.5、温度32°C条件下,以1%的接种量将SH-1菌株接入50 mL优化培养基中,240 r/min转速下振荡培养24 h,SH-1菌株产酶最大活性可达757.90 U/mL,比优化前提高了2.4倍。【结论】SH-1最佳产酶条件的建立,为海藻酸裂解酶的大规模制备以及更深层次研究提供了试验基础和理论依据。

海藻酸盐裂解酶研究进展

海藻酸盐裂解酶是一类降解褐藻中海藻酸盐的酶。此酶已经在多种有机体中得到分离。对海藻酸盐裂解酶的生物特性、研究方法及其生物学功能进行了介绍。在酶学特性研究的基础上 ,通过酶解构建新型海藻酸盐多聚物 ,可增强和扩展海藻酸盐裂解酶在工业、农业、医药领域中的应用 ,使其在海藻多糖的高值化应用中发挥重要的作用。概述了海藻酸盐和海藻酸盐裂解酶过去和现在的研究状况 ,展望了海藻酸盐和海藻酸盐裂解酶将来的应用前景。

复合酶法提取马尾藻中海藻酸的工艺研究

海藻酸在食品、医药、材料等领域有着广泛的用途,从海藻中提取是目前海藻酸的主要制备方法。本研究以提高马尾藻(Sargassum)中海藻酸的提取率为目标,系统研究了利用纤维素酶、果胶酶和海藻酸裂解酶复合提取马尾藻中海藻酸工艺。实验探究了酶添加量、时间、温度和pH对提取海藻酸的影响,并通过正交试验进一步优化提取工艺。结果表明在料液比1∶20(m/v),添加2%的纤维素酶、2%的果胶酶和2%的海藻酸裂解酶,提取温度55℃、提取pH 4.5,酶解90 min后再采用钙析-酸化法制备海藻酸的工艺条件下,海藻酸提取率可达25.43%,相对于传统化学法提高了163%,相对于市场上现有商品复合酶提取法提高了20%。复合酶法提取海藻酸的酶解效率高、海藻酸产品品质好,为复合酶法从马尾藻原料中高效提取海藻酸提供了数据支撑。[中国渔业质量与标准,2023,13(2):18-24].

条斑紫菜海藻酸盐裂解酶的生物信息学分析

为了了解条斑紫菜海藻酸盐裂解酶PyAly(Porphyra yezoensis alginate lyase)的结构与功能,试验通过生物信息学方法分析其理化性质、信号肽、跨膜区、亚细胞定位、结构及进行多序列比对,并将建模得到的结构进行分子动力学模拟。结果表明:PyAly为亲水性蛋白,N端1-25位为信号肽,下游区域位于胞内,二级结构中无规则卷曲和α-螺旋占比较高,三级结构具有明显β-jellyroll结构,属于PL-7蛋白家族,尚未发现与其同源性较高的真核生物来源蛋白,活性位点处的保守氨基酸残基对其功能的发挥具有重要作用。优化后的蛋白结构较为合理,可为PyAly酶解机理研究奠定基础。

海带酶解和菌解工艺优化及其降解产物对菜心抗逆性的影响

【目的】海藻(海带)降解物对作物具有抗逆促生作用,研究海带菌解和酶解的最佳工艺条件,并比较两个工艺生产的降解产物对菜心的抗逆效果。【方法】采用单因素和正交试验,探究不同的底物浓度、接种量、溶液pH、降解温度分别对微泡菌Microbulbifer sp.SH-1和海藻酸裂解酶AlgSH7制备海藻降解产物的影响。同时,借助光学显微镜,研究SH-1菌和AlgSH7酶降解过程中海带细胞形态变化。并在此基础上,利用盆栽试验,研究海带菌解产物、酶解产物对菜心非生物胁迫抗性的影响。【结果】海藻酸裂解酶AlgSH7降解海带的最佳工艺条件是底物浓度2%,酶添加量6%,降解体系初始pH 8.5,温度44℃;SH-1菌株降解海带的最佳工艺条件是底物浓度2.5%,接种量1.5%,降解体系初始pH 7.5,温度32℃。与菌解产物相比,酶解产物中海藻酸、总糖、还原糖含量分别提高141.8%、57.6%、150.5%,而褐藻多酚、甘露醇、甜菜碱含量分别下降35.3%、60.6%、62.6%,但菌解工艺的产率比酶解工艺高9.3%。细胞形态观察结果表明,海带原始细胞排列紧密,形状规则饱满,随菌解或酶解时间的延长,海带细胞可视面积变小,细胞之间的间距增大。降解24 h时,酶解海带细胞可视面积仅为菌解的77.2%。在盆栽试验中,中度干旱条件下(土壤相对含水量50%),酶解液灌根处理的菜心生物量比菌解液处理提高13.7%;酶解液配施水溶肥(NPK,N:P_(2)O_(5):K_(2)O=110:50:60)处理的菜心生物量比菌解液配施NPK处理明显提高10.6%。淹水条件下(淹水层深度2 cm),酶解液处理的菜心生物量比菌解液处理降低7.1%,但均显著高于对照处理;酶解液配施NPK处理的菜心生物量比菌解液配施NPK处理提高5.6%。盐胁迫条件下(土壤中NaCl含量24 g/kg),海带酶解液处理的菜心生物量比菌解液处理有增加趋势,但增加不显著。【结论】海带酶解产物中海藻酸、总糖、还原糖含量高于菌解产物,而褐藻多酚、甘露醇、甜菜碱含量低于菌解产物。菌解海带的产率高于酶解海带的产率。逆境胁迫条件下,海带酶解液配施NPK处理的菜心生物量高于菌解液配施NPK处理,海带酶解液对农作物抗逆促生作用优于菌解产物。

海藻酸分解菌研究进展

海藻酸分解菌是一类能够自身合成海藻酸裂解酶,能够降解并同化海藻酸的微生物。海藻酸分解菌是海藻酸裂解酶的重要来源,其产生的海藻酸裂解酶具有种类多、反应条件温和、酶活高和易于大规模生产等优点,并且在生物、医疗、化工等领域有重要的应用价值。在过去的几十年里,海藻酸分解菌一直作为海藻酸裂解酶生产者的角色被研究和应用。但随着近年来能源危机的加剧,以海藻酸等海藻生物质为原料转化生物能源成为解决能源危机的潜在途径,因此,海藻酸分解菌又有了崭新的研究领域,即海藻酸分解菌利用海藻酸发酵生产生物能源。本文从海藻酸分解菌及其海藻酸裂解酶的种类和特性、海藻酸分解菌的代谢以及海藻酸分解菌基因工程等方面,介绍海藻酸分解菌的研究现状,并展望未来的发展趋势。

海藻酸转化生物乙醇研究进展

作为第三代生物燃料,大型褐藻类生物质转化燃料乙醇的研究受到广泛的关注。但是,现有的乙醇工业菌株并不能利用褐藻中的主要成分海藻酸,这个问题是海藻生物乙醇实现工业化生产的主要技术难关。近几年随着对海藻酸裂解酶和海藻酸降解菌代谢途径的深入研究,科研人员构建了不同的海藻酸发酵菌株,为高效转化大型海藻生产生物乙醇提供了可行的技术基础。这篇文章对海藻酸资源概况和海藻酸转化生物乙醇存在的科学问题及其研究进展进行了综述。

铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究

【目的】通过构建毕赤酵母工程菌株,以期获得重组海藻酸裂解酶,并对其性质加以研究。【方法】采用PCR的方法,以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)基因组DNA为模板,克隆出约1.0kb的海藻酸裂解酶基因algL的成熟蛋白编码序列,并将其插入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K-algL。重组质粒线性化后用聚乙二醇(PEG)法导入毕赤酵母菌株GS115中表达。【结果】用甲醇诱导培养基进行摇瓶发酵,表达得到40kD的目的蛋白,酶活力达540U·ml-1左右。经测定,该重组酶的最适反应pH为8.5,最适反应温度为40℃,并且在20～45℃,pH3.0～12.0具有较好的稳定性。50mmol·L-1的Co2+和Ca2+对酶活力均有显著的促进作用,Zn2+、Cu2+和Fe2+在不同浓度下对酶活力均有不同程度的抑制作用。在重组酶的辅助作用下,抗生素的抑菌效果明显提高。【结论】用重组毕赤酵母可高效表达外源海藻酸裂解酶,为其今后在工农业中的应用奠定了基础。

马尾藻发酵生产生物乙醇的两步法糖化预处理

马尾藻是典型的大型褐藻,含有大量的碳水化合物,通过糖化处理后能够用于生物乙醇的发酵生产。研究了马尾藻的两步水解方法,优化了两步水解法中酸水解和酶水解的最适水解条件。试验发现在料液比为6%(w/v),H2SO4浓度1.5%(v/v),时间40 min,温度为120℃的水解条件下马尾藻的第1步酸水解效率可以达到(31.05±0.32)%(w/w)。进一步用海藻酸盐裂解酶进行第2步水解,最适水解条件:料液比5%(w/v)、酶用量0.0025%(w/v)、时间2 h,第2步酶水解后马尾藻的水解效率可以在第1步水解的基础上提高9.68%(w/w)。最终两步法的总水解效率可以达到38%～40%(w/w),达到理论产量的89%。用工业酿酒酵母R1-11对水解液进行发酵实验,在未优化发酵条件的情况下每千克马尾藻生产乙醇60.75 g,当水解液补充1%(w/v)(NH4)2SO4时乙醇的产量可以达到每千克马尾藻生产乙醇91.9 g。