长期体外培养条件下海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊化牛肾上腺嗜铬细胞的变化

目的:了解在体外长期培养的条件下,海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊化牛肾上腺嗜铬细胞的形态及其细胞活率的变化。方法:实验于2003-09/2004-05在解放军总医院老年医学研究所细胞生物学室完成。①材料:细胞为牛肾上腺嗜铬细胞;海藻酸钠和多聚赖氨酸由SIGMA公司提供;DMEM-H培养液由GIBCO公司提供;加强型小牛血清由HYCLONE公司提供。②方法:用海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微胶囊包裹牛肾上腺嗜铬细胞,以含有体积分数为0.1的小牛血清的DMEM-H培养基培养于CO2孵箱中,定期换液。③观察指标:在光学显微镜下观察微囊及囊内细胞的形态;以锥虫蓝染色法计数囊内细胞的数量和存活率,观察时间为8个月以上。结果:①微囊包裹后1d时,光镜下见微囊呈圆形,囊膜完整,表面光滑;囊内为单个细胞,均匀散在分布。体外培养35d时,微囊仍呈圆形,囊膜完整,表面光滑;囊内细胞聚集成体积较小的团块。体外培养240d时,微囊形态无明显变化;囊内大部分细胞已聚集成多个体积较大的团块,少数微囊内的细胞聚集成一个大的细胞团。②随着培养时间的延长,囊内细胞数量逐渐减少,从最初的(54±10)个/囊减少到培养243d时的(35±7)个/囊,但差异无显著性意义(P>0.05);囊内细胞的活率无明显改变,开始为95%,到培养243d时仍有93%的细胞存活。结论:在体外培养条件下,海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊化牛肾上腺嗜铬细胞可较长时间地保持良好状态。

基于电诱导沉积原理制备形状可控的海藻酸钙-多聚赖氨酸水凝胶微封装胶囊

海藻酸钙水凝胶是一种具有良好生物相容性、生物降解性的生物医用高分子材料。文中提出了一种基于电诱导沉积原理制备形状可控的海藻酸钙-多聚赖氨酸(PLL)水凝胶微封装胶囊。在涂有光刻胶的FTO导电玻璃表面上利用光刻技术制造多种预设图案的微电极,基于电诱导沉积原理在微电极上制备特定几何结构海藻酸钙水凝胶,通过PLL等试剂的处理最终得到环形与六边形结构的海藻酸钙-PLL水凝胶微封装胶囊,酵母细胞包含在微封装胶囊中进行24 h的培养,获得有一定生物活性的细胞。这种方法可以制备用于组织工程学研究的生物支架,将对细胞装配,生物打印以及药物输送等领域有重要的参考价值。

海藻酸钡-多聚赖氨酸-海藻酸微囊植入大鼠体内的生物相容性的实验研究

研究海藻酸钡-多聚赖氨酸-海藻酸(BPA)微囊在大鼠体内的生物相容性。用静电微囊发生仪制备BPA微囊,将4mL空微囊分别注射于20只Sprague-Dawley大鼠腹腔内,于1、2、4、8周各取5只大鼠,处死后用生理盐水灌洗腹腔,收集灌洗液,待微囊全部沉淀后,计算其中空微囊数并观察微囊的形态改变。结果表明:移植后1、2、4、8周从大鼠腹腔内取出的微囊95%～98%为完整、圆形、表面光滑、无明显的结缔组织包绕。说明我们所制作的BPA微囊具有较好的生物相容性。

β-榄香烯海藻酸钙-壳聚糖微囊的制备

采用乳化-内部凝胶化技术制得载b-榄香烯的海藻酸钙凝胶微球,然后与壳聚糖反应制得b-榄香烯海藻酸钙-壳聚糖微囊。利用激光共聚焦扫描显微镜和激光粒度仪观测所得微囊的形态、粒径及分布,通过气相色谱法考察体外释放性能。结果表明制品球形度好、膜层均匀,粒径呈正态分布,体外释放曲线符合Higuchi方程。

乳糖化修饰海藻酸钠-多聚赖氨酸纳米粒的制备及其肝靶向性研究

目的探讨乳糖化修饰海藻酸钠-多聚赖氨酸纳米粒(Alg-Lac PLLNP)的制备及其作为肝脏靶向性药物载体的可行性。方法合成乳糖化多聚赖氨酸(Lac-PLL),并以乳糖化多聚赖氨酸为原料改性修饰海藻酸钠纳米粒。通过半乳糖修饰纳米粒建立配体-受体生物特异性介导来实现肝主动靶向,并分别与非糖化组比较肝靶向效果,对纳米-DNA复合物鼠体内时间、空间分布进行研究。结果电子显微镜的检测结果,Alg-LacPLL纳米粒粒径在250nm左右,近似球形,大小分布均匀;纳米粒未聚集。AlgNP纳米粒PEGFPC-1质粒掺入比为6.15-4.21/6.25=68。给药30min鼠体生物分布显示,Alg-LacPLLNP以肝为第一靶向器官。结论海藻酸钠-多聚赖氨酸纳米粒的制备与载体海藻酸钠的浓度及最佳凝聚剂氯化钙的浓度密切相关,且多聚赖氨酸和氯化钙加入海藻酸钠溶液的先后顺序对粒径的影响至关重要。该制备工艺简便,药物包封率高。AlgLacPLL-DNA具有一定肝靶向性。

用固定化L-赖氨酸脱羧酶细胞制备1,5-戊二胺

研究了4种固定化蜂房哈夫尼菌(H.alveiAS1.1009)菌体细胞的材料和方法,包括海藻酸钙包埋法、半透膜透析袋法、海藻酸钙-明胶交联包埋法和明胶包埋法。其中海藻酸钙包埋法稳定性最好,该方法最优转化条件为:在ρ(海藻酸钠)=30g/L的水溶液中,最适菌体质量浓度为ρ(菌体)=30.8g/L,100mL转化液中海藻酸钙球体体积为30mL,转化最适温度为37℃,最适pH=5.0。用该方法转化测得比酶活可达1028.9U。重复性佳:第一批固定化细胞酶活可达游离菌体的98.62%,第四批可达第一批酶活的38.68%。

聚赖氨酸-海藻酸微囊介导的病毒基因组DNA转染

通过多孔CaCO3微粒吸附伪狂犬病毒(Pseudorabies,PRV)基因组DNA,并在其表面依次交替聚合PLL、Alg至7层;以EDTA溶解去除CaCO3内核,制成聚PLL/Alg包被DNA的载体并感染家兔,观察PRV基因组DNA在体内的复制情况。结果显示,Na2CO3与CaCl2反应可获得直径4～6μm的多孔CaCO3微粒,对DNA的吸附效率约为1mg CaCO3微粒可吸附1μg DNA。经PLL/Alg包被后获得直径1～2μm、囊膜厚约200nm的PRVDNA聚PLL/Alg微囊。肌肉注射含6.5μg PRV DNA的PLL/Alg微囊,可引起试验兔死亡,经PCR检测确定为PRV感染引起的。结果表明,聚PLL/Alg微囊能够介导DNA高效转染,在作为DNA疫苗载体方面具有良好应用前景。

四种防脱片剂在不脱钙骨组织切片中的应用研究

目的:不脱钙骨组织切片因组织有机及无机钙较多,其与普通石碏切片有较大差别。一种良好的防组织脱片剂是制片成功的关键因素之一,本研究的目的是寻找一种效果良好的防组织脱片剂以减少组织的损失,提高制片成功率。方法:选择目前组织病理制片中常用的三种防组织脱片剂对捞取切片的载玻片进行处理,防组织脱片剂分别为:3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷(APES)、铬明矾-明胶、多聚赖氨酸;另一种直接用已涂好防组织脱片剂(SUPERFROST PLUS)的进口玻片。组织切片经Goldners’三色法染色,比较分别使用上述四种防组织脱片剂的不脱钙骨组织切片组织保存的效果。结果:载玻片经3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷(APES);铬明矾-明胶;多聚赖氨酸;SUPERFROST PLUS等四种防组织脱片剂处理后,镜下观察:防组织脱片效果最好即组织保存最完整的是经铬明矾-明胶处理的玻片,完整贴片率为75%;多聚赖氨酸与SUPERFROST PLUS玻片两种基本相当,完整贴片率为30%;四种中效果最差的防组织脱片剂是3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷(APES),完整贴片率为15%。结论:通过对上述四种防组织脱片剂的应用比较,我们认为铬明矾-明胶作为不脱钙骨组织切片用防脱片剂是最理想的。

APA微囊低温保存中降温方法的建立

目的探讨海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙(APA)微囊低温保存的降温方法。方法用静电法制作APA微囊,分别以程控降温法、冰箱梯度法或直接液氮法降温,最终将APA微囊保存于液氮中。复温后,在显微镜下观察APA微囊的破损情况,并用荧光标记的葡聚糖检测APA微囊膜通透性的变化。结果程控降温组为微囊完好率(91.2±1.57)%、皱缩率(3.1±0.81)%、破损率(5.7±2.62)%;冰箱梯度组为微囊完好率(85.3±1.42)%、皱缩率(5.2±0.74)%、破损率(9.5±3.81)%;直接冻存组为微囊完好率(14.5±1.57)%、皱缩率(84.1±3.47)%、破损率(1.4±2.62)%。冻存复温后,各组完好的APA微囊膜通透性无改变。结论程控降温法可较好地低温保存APA微囊并维持其通透特性。

固定化铜绿微囊藻对污水的净化及其生理特征变化

将铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)包埋固定在海藻酸钙凝胶中,分别对合成污水和实际污水进行净化,研究其对污水中氨氮和正磷酸盐的净化效率以及净化过程中藻类的生长、叶绿素a含量的变化,并与未固定的铜绿微囊藻进行对照比较。结果表明,合成污水经过5天的净化,固定化铜绿微囊藻对合成污水中NH3-N和PO43--P去除率分别为92.92%和69.19%,而悬浮态藻对NH3-N和PO43--P的去除率分别为36.54%和26.77%;实际污水经过6天的净化,污水中NH3-N的浓度由27.1 mg.L-1降为0 mg.L-1;PO43--P的浓度由2.55 mg.L-1降为0 mg.L-1。

微囊化猪肝细胞移植治疗大鼠急性肝衰的免疫隔离机制

目的:探讨微囊化猪肝细胞腹腔内移植对药物性肝衰大鼠的治疗作用,观察受体存活率、肝组织病理变化及大网膜的免疫隔离作用. 方法:以海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)包裹乳猪肝细胞,体外观察APA微囊对NK细胞介导的细胞毒作用的隔离效果.D-氨基半乳糖腹腔内注射诱导大鼠急性肝衰竭,48 h后将微囊化的猪肝细胞移植于大鼠腹腔内,观察移植大鼠存活率,免疫组化法检测大鼠大网膜内CD4、CD8、IgG和IgM的表达. 结果:微囊可有效保护囊内K562细胞不受NK细胞的杀伤.与裸肝细胞移植组相比,微囊化乳猪肝细胞移植组大鼠存活率显著提高(1wk存活率78.6% vs 66.7%, P=0.0 046;2 wk存活率42.9% vs 25.0%,P=0.0027, P<0.01).大网膜CD4、CD8、IgG表达较弱(P=0.0 342、P=0.0 197及P=0.0 445,P<0.05),而IgM表达无明显差异(P>0.05). 结论:APA微囊可有效隔离抗体及淋巴细胞介导的体液和细胞免疫反应.微囊化异种肝细胞移植可治疗大鼠急性肝衰,给予肝功能代谢支持,提高移植治疗效果.

利用激光扫描共聚焦显微镜测定APA微囊通透性

目的：海藻酸钠多聚赖氨酸海藻酸钠（ＡＰＡ）微囊能够成功地延长同种或异种移植组织或细胞的存活时间，而微囊膜的通透性是决定囊内细胞存活和微囊免疫隔离效果的关键因素。本实验用激光扫描共聚焦显微镜（ＬＳＣＭ）以测定ＡＰＡ微囊膜的通透性。方法：采用ＦＩＴＣ标记的不同分子量的葡聚糖（ＦＤ）和ＩｇＧ与微囊共孵育，观察形成的激光共聚焦图像。结果：平均分子量为７１和１６７ｋＤａ的ＦＤ及分子量为１５０ｋＤａ的ＩｇＧ均不能扩散进入微囊内，而平均分子量为１２和２０ｋＤａ的ＦＤ则可自由扩散进微囊内，平均分子量为４０ｋＤａ的ＦＤ可部分扩散进微囊内。提示微囊膜的截割分子量在４０～７１ｋＤａ之间。利用ＬＳＣＭ的时间扫描功能可动态观察ＦＤ１２向单个微囊内的扩散情况，表明较小直径微囊内ＦＤ１２增加的速度明显快于直径较大的微囊。包囊细胞和含血清的培养液对微囊膜的分子截割范围和ＦＤ１２向微囊内的扩散速度无明显影响。结论：我们制备的ＡＰＡ微囊既可允许小分子的营养物通过，以满足微囊内细胞的生存需要，又能截割７１ｋＤａ以上的大分子物质，起到免疫隔离作用。

微囊化牛嗜铬细胞及冷冻保存的体外培养研究

目的 观察体外培养的微囊化牛嗜铬细胞及其冷冻保存复苏后的细胞活力,探索微囊化牛嗜铬细胞的冻存保存方法,为将来进行大规模细胞移植治疗疼痛奠定临床基础.方法 经胶原酶消化成单细胞,微囊包裹,并取部分进行冷冻保存及复温,观察细胞的生长情况;放免法分别检测其培养液中去甲肾上腺素、甲-脑啡呔的含量和在高钾、乙酰胆碱刺激下的分泌量来观察其功能活性.结果 微囊化牛嗜铬细胞及其冷冻复苏后的细胞形态结构完整,生长良好;冻存复苏后的微囊保留了儿茶酚胺和甲-脑啡呔的的分泌功能,基础与刺激分泌量大约为冻存前微囊化牛嗜铬细胞分泌量的92%;同时刺激后去甲肾上腺素、甲-脑啡呔水平较其基础值均有明显增加（P＜0.01）.结论 微囊化牛嗜铬细胞及其冷冻复苏后的细胞具有良好的细胞功能,冷冻保存的微囊化牛嗜铬细胞是有效和成功的.

微囊化大鼠胰岛移植物的制备与异种移植

为了解决胰岛移植中排斥反应,用海藻酸钠—聚赖氨酸生物膜制备微囊化大鼠胰岛,体外培养,胰岛素释放试验功能良好,与单纯胰岛无显著性差异;异种移植可成功地纠正糖尿病小鼠的高血糖状态平均达4个月之久。表明:大鼠胰岛微囊化可在不使用免疫抑制剂的情况下,有效地延长胰岛在糖尿病小鼠体内的生存期。

微囊化人头皮毛乳头细胞体外培养及异种移植

目的探讨微囊化人头皮毛乳头细胞体外培养及异种移植的可行性,并对海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-polylysine-alginate,APA)微囊与海藻酸钠-BaCl2(barium-alginate,BA)微囊的物理、生物性能进行评价。方法采用“一步酶消化法”分离、培养人头皮毛乳头细胞,分别用APA微囊与BA微囊包裹。对两种微囊的生物相容性、机械强度、免疫隔离效果及微囊内细胞活性进行比较。结果APA微囊生物相容性优于BA微囊(P<0.01),但机械强度低于BA微囊(P<0.01);成囊后短期BA微囊内细胞活性高于APA微囊(P<0.01),但APA微囊内细胞活性增高较快(P<0.05)。在微囊完整、表面无纤维化时,两种微囊均可起到良好的免疫隔离作用。结论微囊化人头皮毛乳头细胞可在体外及异种体内培养。综合评价APA微囊与BA微囊的利弊,在不同情况下选择不同的成囊方式是必要的。

微囊化牛视网膜色素上皮细胞移植治疗伴Lewy小体形成帕金森病的实验研究

目的观察微囊化牛视网膜色素上皮细胞(RPE)移植对伴Lewy小体形成帕金森病(PD)大鼠的治疗作用。方法用蛋白酶体选择性抑制剂lactacystin制作伴Lewy小体形成的PD模型;将微囊化牛RPE植入大鼠纹状体,移植分生理盐水对照组(NS)、RPE、空微囊(APA)及微囊化RPE(RPE-APA)四组;观察移植后旋转行为变化、纹状体中多巴胺(DA)和高香草酸(HVA)及酪氨酸羟化酶(TH)含量的变化。结果微囊化RPE的旋转行为在移植后第1周开始改善(改善程度为21.3%,与空微囊组相比P<0.05),第4周改善更加明显(改善程度为57.89%,与第1周相比P<0.05),并一直持续到第14周(改善程度为59.47%,与空微囊组相比P<0.05)。行为学改善的大鼠,纹状体内DA和HVA含量的变化同其行为学改善相符合。行为学有改善大鼠囊内细胞TH染色呈弱阳性,微囊周边的纹状体可见TH阳性纤维密度较空微囊组高。结论微囊化牛RPE脑内移植对伴Lewy小体形成PD大鼠有治疗作用。

微囊包裹人肿瘤细胞的研究进展及应用

微囊是指直径在200～1500μm的球形生物相容性半透膜,这种膜允许营养物质、氧气、细胞分泌的产物及废弃物双向通过,却能阻止大分子物质如抗体和免疫活性细胞通过.体内原位注射微囊化的肿瘤细胞在细胞生长、模拟体内细胞生长环境、制造原位肿瘤模型、器官转移模型等方面相对于体外单层细胞、团块状细胞培养,体内原位、远端器官肿瘤细胞注射及肿瘤组织种植,都有无可比拟的优势.微囊化人肿瘤细胞可广泛用于抗肿瘤药物的筛选、疗效评估等.本文对微囊化人肿瘤细胞的优点及应用前景作一综述.