Homer1b/c通过内质网功能调节由谷氨酸兴奋性毒性损伤诱发的小鼠海马神经元HT22细胞自噬

目的研究Homer1b/c蛋白在谷氨酸兴奋性毒性损伤诱发的细胞自噬中的作用及机制。方法选用小鼠海马神经元HT22细胞,通过500μmol/L L-谷氨酸处理建立细胞损伤模型。用siRNA慢病毒转染方式下调Homer1b/c表达,用10μmol/L钙离子螯合剂BAPTA-AM、10 mmol/L内质网应激抑制剂4-PBA分别抑制细胞内钙离子释放和内质网应激后,使用蛋白质印迹法检测细胞中Homer1b/c蛋白,自噬效应蛋白[beclin-1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)]及内质网应激标志蛋白[C/EBP同源蛋白(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP 78)]的表达水平。结果L-谷氨酸处理HT22细胞12 h后,细胞中beclin-1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均较对照组升高(均P<0.05);与转染对照组相比,下调Homer1b/c表达可降低细胞中beclin-1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(均P<0.05);抑制细胞内钙离子释放和内质网应激均能降低细胞中beclin-1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(均P<0.05);下调Homer1b/c表达后,抑制细胞内钙离子释放和内质网应激未能进一步降低细胞中beclin-1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。结论Homer1b/c能够调节谷氨酸兴奋性毒性损伤诱发的细胞自噬,其调节作用可能与内质网功能有关。

神经复元方对H_(2)O_(2)诱导的大鼠海马神经元损伤后雄激素受体活化的影响

[目的]探究神经复元方对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的SD大鼠海马神经元损伤中雄激素受体(AR)的活化影响,探讨其治疗卒中后抑郁的作用机制。[方法]取新生24 h的SD大鼠的海马组织,分离原代大鼠海马神经元,通过微管相关蛋白2(MAP-2)免疫荧光鉴定细胞。对SD大鼠给予神经复元方灌胃处理,分离血清,获得空白血清和含药血清,再利用细胞计数试剂(CCK8)检测确定含药血清的最佳处理浓度。使用100μmol/L的H_(2)O_(2)对大鼠海马神经元细胞处理致损伤,分为空白血清组、损伤模型+空白血清组、损伤模型+含药血清组、损伤模型+氟西汀4组。利用蛋白质免疫印迹法(Western blot)和免疫荧光检测各组AR蛋白磷酸化及非磷酸化的情况。[结果]与空白血清组相比,损伤模型+空白血清组的AR、p-AR蛋白表达显著下降。与损伤模型+空白血清组相比,损伤模型+含药血清组和损伤模型+氟西汀组的AR、p-AR蛋白表达上升。[结论]神经复元方对H_(2)O_(2)诱导的SD大鼠海马神经元损伤有一定修复作用,能够促进AR活化,提示AR可能为神经复元方治疗脑卒中后抑郁的重要靶蛋白。

有氧运动对阿尔茨海默症小鼠成年海马神经发生的影响

背景:运动有助于改善阿尔茨海默症、痴呆症以及与年龄相关的认知能力,运动与这些健康益处之间的一个潜在中介可能是成年海马神经发生。因此,探索运动如何影响阿尔茨海默症小鼠的成年海马神经发生过程具有重要意义。目的:观察有氧运动对阿尔茨海默症小鼠成年海马神经发生的影响,探究有氧运动能否促进其成年海马神经发生。方法:将3月龄野生型(C57BL/6Jnju)及APP/PS1双转基因阿尔茨海默症小鼠随机分为4组:野生对照组、野生运动组、阿尔茨海默症对照组、阿尔茨海默症运动组,每组20只。对照组小鼠不进行运动,运动组小鼠进行5个月的有氧运动干预。运动干预结束后,采用Real-time PCR、免疫荧光及Western blot检测各组小鼠海马组织DCX、Ki67、βⅢ-tubulin及NeuN的表达。结果与结论:阿尔茨海默症对照组小鼠海马齿状回区DCX、βⅢ-tubulin及NeuN表达均显著低于野生对照组小鼠(P<0.05);阿尔茨海默症运动组小鼠海马齿状回区DCX、Ki67、βⅢ-tubulin及NeuN表达显著高于阿尔茨海默症对照组(P<0.05)。提示:长期有氧运动干预后,可以促进阿尔茨海默症小鼠成年海马神经发生过程中神经元增殖、迁移分化,显著增加神经元前体细胞、新生神经元数量。

百事乐加味方对氧糖剥夺联合脂多糖诱导海马神经元细胞损伤的保护作用及机制研究

目的观察百事乐加味方对体外培养的海马神经元细胞的保护作用,探讨其治疗卒中后抑郁的作用机制。方法体外分离培养乳鼠海马神经元细胞,以氧糖剥夺联合脂多糖诱导海马神经元细胞损伤。将细胞分为正常组、模型组、空白血清组(10%)和百事乐加味方含药血清组(10%),倒置显微镜观察细胞形态变化,CCK-8法检测细胞存活率,Hoechst33342染色观察细胞凋亡情况,ELISA检测细胞上清液神经递质谷氨酸(Glu)、5-羟色胺(5-HT)及促炎因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6含量,免疫荧光染色检测嘌呤能P2X7受体(P2X7R)、NOD样受体蛋白3(NLRP3)表达。结果与正常组比较,模型组海马神经元细胞形态发生明显变化,细胞存活率显著降低(P<0.01),细胞凋亡增加(P<0.01),细胞上清液Glu、TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著增加(P<0.05,P<0.01),5-HT含量显著减少(P<0.01),海马神经元P2X7R和NLRP3表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,百事乐加味方含药血清组海马神经元细胞形态明显改善,细胞存活率显著升高(P<0.01),细胞凋亡减少(P<0.01),细胞上清液Glu、TNF-α、IL-1β含量显著减少(P<0.05,P<0.01),5-HT含量显著增加(P<0.01),海马神经元P2X7R和NLRP3表达显著降低(P<0.01)。结论百事乐加味方可能通过抑制P2X7R/NLRP3信号通路、调节神经递质分泌、抑制炎症因子释放发挥对氧糖剥夺联合脂多糖诱导的海马神经元细胞炎症损伤的保护作用,从而治疗卒中后抑郁。

电针联合柴胡疏肝散对抑郁大鼠海马神经元活性、MAO水平及CaMK信号蛋白水平的影响

目的 探究电针联合柴胡疏肝散对抑郁大鼠海马神经元活性、单胺氧化酶(MAO)水平及钙调蛋白激酶(CaMK)信号蛋白水平的影响。方法 将15只雄性SD大鼠根据不同治疗方法分为抑郁组、健康组、电针组、柴胡疏肝散组、联合组各3只。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测海马神经元细胞中CaMKⅡmRNA表达量,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞中MAO表达水平,Hoechst 33258荧光染色法检测海马神经元细胞的凋亡情况,水迷宫行为检测大鼠空间学习记忆能力,Western印迹法检测细胞中CaMKⅡ蛋白含量。结果 与抑郁组相比较,电针组、柴胡疏肝散组、联合组空间学习记忆能力显著更优(均P<0.05),联合组空间学习记忆能力显著优于电针组、柴胡疏肝散组(均P<0.05)。电针组、柴胡疏肝散组、联合组海马神经元细胞的凋亡率、MAO表达显著低于抑郁组(均P<0.05),与电针组、柴胡疏肝散组相比较,联合组细胞凋亡细胞率、MAO表达显著下降(均P<0.05)。电针组、柴胡疏肝散组、联合组海马神经元细胞CaMKⅡ蛋白表达、CaMKⅡmRNA表达量显著高于抑郁组(均P<0.05)。结论 电针与柴胡疏肝散对抑郁大鼠均有改善作用,两者联合治疗效果更佳,电针与柴胡疏肝散对抑郁大鼠的作用机制可能与提高CaMK信号蛋白水平有关。

温肺降浊方对血管性痴呆大鼠海马神经元的作用机制

目的:观察温肺降浊方对血管性痴呆(VaD)大鼠的作用机制。方法:建立VaD大鼠模型,随机分为模型组、西药组、温肺降浊方低剂量组、温肺降浊方中剂量组、温肺降浊方高剂量组,每组6只。另取6只大鼠设为假手术组,模型组和假手术组给予0.9%氯化钠溶液灌胃;西药组给予尼莫地平灌胃;温肺降浊方各剂量组给予相应剂量的温肺降浊汤灌胃。给药28 d后,采用Morris水迷宫实验评价各组大鼠学习记忆能力;HE及Nissl染色法进行组织病理学检测。采用RT-qPCR和Western blot检测各组大鼠海马组织中沉默信息调节因子1(SIRT1)/肌醇需求酶1α(IRE1α)/剪接型X-盒结合蛋白1(XBP1S)/CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)信号通路相关mRNA和蛋白表达。结果:与假手术组比较,模型组大鼠逃避潜伏期明显延长,穿越平台次数则减少。与假手术组比较,模型组大鼠海马CA1区病理损伤严重,神经元细胞明显减少,尼氏小体数量明显减少,SIRT1 mRNA和蛋白表达则降低(均P<0.01)。与假手术组比较,模型组大鼠IRE1α、XBP1S、CHOP mRNA和XBP1S、CHOP蛋白及p-IRE1α/IRE1α明显升高(均P<0.01)。与模型组比较,温肺降浊方中剂量组、温肺降浊方高剂量组、西药组大鼠逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增加(均P<0.05)。与模型组比较,西药组和温肺降浊方各剂量组大鼠海马CA1区病理损伤减轻,神经元细胞数量增加,尼氏小体数量增加。与模型组比较,西药组和温肺降浊方各剂量组SIRT1 mRNA和蛋白表达升高,且温肺降浊方高剂量组和西药组表达较高。IRE1α、XBP1S、CHOP mRNA和XBP1S、CHOP蛋白以及p-IRE1α/IRE1α水平降低,且温肺降浊方高剂量组和西药组水平更低(均P<0.01)。结论:温肺降浊方通过激活SIRT1/IRE1α/XBP1S/CHOP信号通路,减轻VaD大鼠海马神经元区病变,从而发挥改善VaD大鼠认知能力的作用。

加巴喷丁减轻骨折模型大鼠焦虑情绪及海马神经炎症的作用机制研究

目的探析加巴喷丁对骨折模型大鼠焦虑情绪、海马神经炎症、人核因子κB(NF-κB)/肿瘤坏死因子α(TNF-α)信号通路的影响。方法自2022年1―6月,选择健康雄性无特定病原体(SPF)SD大鼠48只,采用随机数字表法分为假手术组、模型组、治疗组。假手术组正常饲养,未做任何处理,其余两组大鼠均进行骨折造模。其中治疗组给予加巴喷丁治疗,模型组给予等量生理盐水干预,连续给药12 d。采用高架十字迷宫实验评估大鼠焦虑情绪;采用酶联免疫吸附(ELISA)检测白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA),采用比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)。采用苏木素伊红(HE)染色评估海马组织病理形态特征;采用蛋白质印迹法检测TNF-α、NF-κB蛋白表达量。结果假手术组、治疗组、模型组总穿臂次数(TE)、进入比例(OE)、停留时间比例(OT)比较,假手术组大鼠TE[(12.31±2.59)次比(10.29±2.37)次、(7.25±2.16)次]、OE[(40.25±5.41)%比(37.02±5.13)%、(32.77±5.43)%]、OT[(23.67±4.22)%比(21.94±5.31)%、(16.47±2.35)%]均高于治疗组、模型组大鼠,治疗组大鼠TE、OE、OT均高于模型组(P<0.05)。假手术组大鼠IL-4[(41.23±5.37)ng/L比(50.23±6.78)ng/L、(59.44±6.92)ng/L]、IL-6[(101.45±12.36)ng/L比(114.32±12.74)ng/L、(135.49±16.78)ng/L]、IL-1β[(87.64±8.74)ng/L比(101.23±10.45)ng/L、(110.34±10.25)ng/L]均低于治疗组、模型组大鼠,治疗组大鼠IL-4、IL-6、IL-1β均低于模型组(P<0.05)。假手术组大鼠GSH-Px、SOD均高于治疗组、模型组大鼠,MDA低于两组;且治疗组大鼠GSH-Px、SOD均高于模型组,MDA低于该组(P<0.05)。假手术组大鼠NF-κB、TNF-α蛋白表达均低于治疗组、模型组大鼠,治疗组大鼠NF-κB、TNF-α蛋白表达均低于模型组(P<0.05)。结论骨折导致大鼠焦虑情绪增加,而加巴喷丁可以有效削弱骨折大鼠的焦虑情绪,可能与加巴喷丁减弱海马炎症反应有关,从而增强NF-κB/TNF-α信号通路对海马神经的保护作用。

一种低密度及高纯度胎鼠原代海马神经元培养方法的优化及鉴定

目的通过将海马、皮层细胞共培养的方式建立一种低密度、高纯度、高稳定性的大鼠胎鼠原代海马神经元体外培养方法,以获取纯度更高、活力更好的原代海马神经元。方法分离孕16~18 d SD大鼠胎鼠的海马和皮层并分别剪碎,经0.125%胰蛋白酶消化后用200目细胞筛过滤,将获得的细胞悬液以包围的形式分别接种于培养板的内层和外环上,于含10%马血清的DMEM/F12培养基中进行共同培养,4~6 h细胞贴壁后更换培养基为维持培养基培养(Neurobasal培养基+2%B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺)。通过CCK-8试剂盒检测细胞活力,利用免疫荧光染色检测海马神经元纯度。结果海马神经元在5 d后形成纵横交错的神经网络,生长状态较好,经鉴定海马神经元的纯度高达98%,且能够稳定存活3周。结论利用海马、皮层细胞共培养的方法可以获取高纯度、高活性、高存活率、高稳定性的胎鼠原代海马神经元,可为神经系统中海马神经元相关疾病研究提供一定的实验条件。

基于JAK2/STAT3通路探讨颐脑解郁复方对体外氧糖剥夺/再复氧损伤型大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的基于Janus激酶(Janus kinase 2,JAK)/信号转导与转录激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)信号通路探讨颐脑解郁复方对氧糖剥夺/再复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)大鼠海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖和分化的影响。方法取新生大鼠海马制成细胞悬液,原代培养海马NSCs,建立OGD/R损伤模型,实验分为正常组、OGD/R模型组、颐脑解郁复方组、抑制剂组、颐脑解郁复方+抑制剂组。增殖的细胞正常组和OGD/R模型组海马NSCs无血清培养基培养,颐脑解郁复方组用NSCs含药血清培养基培养,抑制剂组用JAK2/STAT3通路抑制剂S31-201培养,颐脑解郁复方+抑制剂组用NSCs含药血清培养基和S31-201培养。分化的细胞正常组和OGD/R模型组用NSCs诱导分化培养基培养,颐脑解郁复方组用NSCs诱导分化培养基和含药血清培养,抑制剂组用NSCs诱导分化培养基和S31-201培养,颐脑解郁复方+抑制剂组用诱导分化培养基及含药血清和S31-201培养。各组细胞培养48小时后采用CCK-8法筛选颐脑解郁复方最佳浓度及检测各组海马NSCs的增殖情况,免疫荧光法检测各组海马NSCs的分化情况,RT-PCR及Western Blot法检测JAK2、STAT3基因和p-JAK2、p-STAT3蛋白的表达。结果(1)各组细胞培养48小时后细胞增殖情况:与正常组相比,OGD/R模型组细胞增殖数量明显降低(P<0.01);与OGD/R模型组相比,颐脑解郁复方组、抑制剂组、颐脑解郁复方+抑制剂组海马NSCs增殖的数量明显增多(P<0.01)。(2)各海马NSCs经诱导分化培养48小时后,与正常组相比,OGD/R模型组分化后的细胞明显减少,海马NSCs向神经元分化减少,细胞排列稀疏。与OGD/R模型组相比,颐脑解郁复方组、抑制剂组、颐脑解郁复方+抑制剂组分化后的细胞明显增多,海马NSCs向神经元分化增多,细胞密度增大,突起增多。(3)各组细胞JAK2/STAT3通路相关基因与蛋白的表达情况:与正常组相比,OGD/R模型组海马NSCs的JAK2、STAT3基因及p-JAK2、p-STAT3蛋白表达显著增多(P<0.05,P<0.01);与OGD/R模型组相比,颐脑解郁复方组、抑制剂组、颐脑解郁复方+抑制剂组海马NSCs的JAK2、STAT3基因及p-JAK2、p-STAT3蛋白表达均显著减少(P<0.01)。结论颐脑解郁复方可以促进OGD/R损伤的海马NSCs的增殖与分化,作用机制可能与抑制细胞JAK2/STAT3信号通路,降低JAK2、STAT3的基因及蛋白表达水平密切相关。

丹参酮IIA上调Nrf2/HO-1信号通路减轻海马神经元氧糖剥夺/复糖复氧损伤

目的:探讨丹参酮IIA(Tan IIA)对海马神经元氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)损伤以及核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1(Nrf2/HO-1)信号通路的影响。方法:体外培养并取对数生长期小鼠海马神经元HT22细胞开展实验,设对照(Control)组、模型(OGD/R)组、Tan IIA(5μg/ml)组、Nrf2激动剂叔丁基对苯二酚(TBHQ,1.6μg/ml)组和Tan IIA(5μg/ml)+TBHQ(1.6μg/ml)组。各组分别给药干预2h后,除Control组外,其它组通过氧糖剥夺6h后复糖复氧24h构建HT22细胞OGD/R损伤模型。MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,二氯荧光素双乙酸盐(DCFH-DA)探针法检测细胞中活性氧(ROS)含量,硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化法、钼酸铵法检测超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western Blotting检测Nrf2/HO-1信号通路相关mRNA和蛋白表达。结果:与OGD/R组相比,Tan IIA组、TBHQ组和Tan IIA+TBHQ组HT22细胞活力明显升高、凋亡率明显降低(P<0.05);细胞中ROS、MDA含量明显降低,SOD、CAT活性明显升高(P<0.05);Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表达量明显升高,B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)蛋白表达量明显升高,Bcl-2相关X蛋白(Bax)、激活型半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)蛋白表达量及Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值明显降低(P<0.05)。Tan IIA+TBHQ组对各检测指标的调控作用明显优于Tan IIA组和BHQ组(P<0.05)。结论:Tan IIA对OGD/R损伤海马神经元氧化应激损伤和凋亡具有抑制作用,其机制可能与上调Nrf2/HO-1信号通路有关。

红景天苷对海马神经元自然衰老的影响和机制研究

目的探讨红景天苷延缓原代海马神经元自然衰老的作用及可能的机制。方法分离并培养大鼠原代海马神经元至自然衰老,随机分为短期培养(ST)组、长期培养(LT)组、红景天苷低和高浓度(10μM和20μM)组、阳性药环黄芪醇(5μM)组,使用细胞计数法检测神经元存活率,使用衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测神经元衰老,使用流式细胞术检测神经元凋亡,使用Western blot检测端粒酶逆转录酶(TERT)表达,使用PCR-ELISA法检测端粒酶活性。结果与ST组比较,LT组的神经元出现神经元退化,胞体萎缩,细胞数量和存活率显著降低(P<0.01),神经元SA-β-gal阳性率和凋亡率明显增加(P<0.01),而神经元内端粒酶和TERT表达水平显著降低(P<0.01);给予红景天苷和环黄芪醇处理后,与LT组神经元相比,细胞存活率明显提高(P<0.05),细胞SA-β-gal阳性率显著降低(P<0.05),神经元凋亡率明显减少(P<0.01),神经元内的端粒酶和TERT表达水平显著提高(P<0.01)。结论红景天苷能够减少海马神经元凋亡,提高端粒酶的表达水平,进而延缓神经元衰老。

紫草素对体外模拟糖尿病并发抑郁症环境大鼠海马神经元凋亡的影响

目的研究紫草素对模拟糖尿病并发抑郁症(DD)环境大鼠海马神经元凋亡的保护作用。方法取大鼠胎鼠海马神经元进行体外原代培养,并以葡萄糖联合皮质酮干预的方法构建体外模拟DD环境海马神经元细胞模型。噻唑蓝法检测不同浓度紫草素对模拟DD环境海马神经元细胞活力的影响。取传代的大鼠胎鼠海马神经元细胞,随机分为对照组、模型组、紫草素(2μmol/L)组、C16-PAF[有效的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)激活剂,4μmol/L]组、紫草素+C16-PAF(2μmol/L+4μmol/L)组,药物干预、建模后,检测神经元细胞活力、细胞损伤、凋亡率、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-18(IL-18)水平和凋亡相关蛋白[半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)]及MAPK信号通路蛋白表达。结果不同浓度紫草素可增强体外模拟DD环境大鼠海马神经元活力(P<0.05),并在一定浓度范围内随浓度升高而作用增强。与对照组比较,模型组神经元细胞尼氏小体数减少,细胞明显损伤,细胞活力降低(P<0.05),凋亡率、TNF-α、IL-6、IL-18水平和caspase-9、Bax、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)/p38 MAPK蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,紫草素组神经元尼氏小体数增加,损伤减轻,细胞活力升高(P<0.05),凋亡率、TNF-α、IL-6、IL-18水平和caspase-9、Bax、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白表达降低(P<0.05);C16-PAF可逆转紫草素对模拟DD环境海马神经元细胞模型的作用效果(P<0.05)。结论紫草素可抑制MAPK信号激活,减少炎性细胞因子表达合成,减轻模拟DD环境大鼠海马神经元炎症损伤,抑制其凋亡,起到保护作用。

夏天无片对血管性痴呆模型大鼠学习记忆能力及海马神经元凋亡的影响

目的观察夏天无片对血管性痴呆模型大鼠学习记忆能力的影响,并从海马神经元凋亡角度探讨其可能作用机制。方法采用改良2-VO法制备血管性痴呆大鼠模型,随机均分为假手术组、模型组、尼莫地平组(0.3 g·kg^(-1)),夏天无低、中、高剂量组(0.2、0.4、0.8 g·kg^(-1)),连续灌胃给药40天。采用Morris水迷宫,HE染色、TUNEL、免疫组化染色、Western blot等实验方法和技术分别观察各组大鼠的学习记忆能力、海马CA1区神经元病理改变及凋亡情况,并测定Bax、Bcl-2蛋白表达水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠平均逃避潜伏期延长(P<0.01),穿越平台次数减少(P<0.01);海马神经元排列紊乱,细胞结构不同程度受损;神经元凋亡数目增多(P<0.01);Bcl-2、Bax蛋白表达水平降低。相较于模型组,夏天无各剂量组能显著提升血管性痴呆大鼠学习记忆能力(P<0.01或P<0.05),改善锥体细胞病理变化,减少海马神经元凋亡数目(P<0.01或P<0.05),提高Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结论夏天无片有效治疗血管性痴呆的机制可能是通过提高Bcl-2/Bax表达的水平,发挥抗凋亡效应,进而保护海马神经元。

黄芪多糖调控Nrf2/HO-1通路对阿尔茨海默病大鼠海马神经元损伤的作用机制研究

目的:探讨黄芪多糖(APS)对阿尔茨海默病(AD)大鼠海马神经元损伤的影响及其机制。方法:按随机数字表法将180只健康Wistar大鼠平均分为正常组、模型组、APS低剂量组(APS-L组)、APS中剂量组(APS-M组)、APS高剂量组(APS-H组)和吡拉西坦片组。除正常组外,其他各组采用双侧海马定向注射β-淀粉样蛋白1~42片段(Aβ_(1~42))的方法制备AD大鼠模型,APS-L组、APS-M组、APS-H组分别给予200、400、800 mg/kg APS灌胃,吡拉西坦片组给予500 mg/kg吡拉西坦片灌胃,正常组和模型组给予0.9%氯化钠溶液灌胃,每日1次,连续给予30 d。苏木精-伊红染色观察海马CA1区神经元病理改变,透射电子显微镜观察神经元超微结构,分光光度法检测海马组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量,酶联免疫吸附(ELISA)法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6水平,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法测核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)mRNA表达,蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测Nrf2、HO-1、胞浆核因子-κB p65(NF-κB p65)、胞核NF-κB p65蛋白表达。结果:与模型组比较,APS-L组、APS-M组、APS-H组和吡拉西坦片组大鼠海马CA1区神经元病理性形态结构改变、超微结构病变呈不同程度改善。APS-M组、APS-H组和吡拉西坦片组海马CA1区神经元病理分级明显降低(P<0.05),SOD、GSH-Px活性明显升高且MDA含量明显降低(P<0.05),TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显降低(P<0.05),Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表达量均明显升高(P<0.05),胞核NF-κB p65表达量和胞核NF-κB p65/胞浆NF-κB p65明显降低(P<0.05)。APS对各检测指标的影响具有一定剂量依赖性,APS-H组对各指标的影响均优于吡拉西坦片组(P<0.05)。结论:APS对AD大鼠海马神经元损伤具有保护作用,该作用具有一定的剂量依赖性,其机制可能与激活Nrf2/HO-1通路、抑制NF-κB核转位进而抑制氧化应激和炎症反应有关。

大蒜素通过抑制内质网应激减轻血管性痴呆大鼠海马神经元损伤

目的研究大蒜素对血管性痴呆(VD)大鼠海马神经元损伤及内质网应激(ERS)的影响。方法取120只实验用大鼠随机分为6组(n=20):假手术组,模型组,尼莫地平组和低、中、高剂量大蒜素组。除假手术组外,其他5组通过结扎双侧颈总动脉构建VD大鼠模型。低、中、高剂量大蒜素组分别1次·d^(-1)灌胃5、10、20 mg·kg^(-1),尼莫地平组1次·d^(-1)灌胃2 mg·kg^(-1),假手术组和模型组1次·d^(-1)灌胃生理盐水。2周后,进行神经症状评分,HE、TUNEL染色法观察海马神经元病理性变化以及神经元凋亡情况,ELISA法检测海马组织炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)水平,Western blot法检测ERS相关蛋白和核因子-κB p65(NF-κB p65)、Caspase-12及Caspase-3蛋白表达。结果与模型组比较,中、高剂量大蒜素组和尼莫地平组大鼠神经症状评分显著降低(P<0.05);海马神经元病理性改变和神经元凋亡状况明显好转;海马组织TNF-α、IL-1β和IL-6含量显著降低(P<0.05),葡萄糖调控蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、NF-κBp65、Caspase-12、Caspase-3相对表达量和内质网激酶磷酸化率(p-PERK/PERK)显著降低(P<0.05)。与尼莫地平组比较,高剂量大蒜素组神经症状评分和TNF-α、IL-6含量显著降低(P<0.05),GRP78、CHOP、NF-κBp65、Caspase-3相对表达量和PERK磷酸化率显著降低(P<0.05)。结论大蒜素可减轻VD大鼠海马神经元凋亡和炎症损伤,其可能的作用机制是抑制ERS。

ROCK2-shRNA转染对VaD大鼠海马神经元的保护作用

目的探讨不同滴度ROCK2-shRNA腺相关病毒(AAV9-ROCK2-shRNA)转染对血管性痴呆(VaD)大鼠海马神经元的保护作用。方法选取成年SPF级健康雄性SD大鼠40只,随机分为正常组、PBS对照组、低滴度组、中滴度组、高滴度组(n=8)。采用双侧颈总动脉永久性结扎法制备VaD模型,将AAV9-ROCK2-shRNA按原液(高滴度)、2倍(中滴度)、10倍(低滴度)稀释后,采用脑立体定位术注射至大鼠海马组织周围。于1周及4周后,进行Morris水迷宫测试大鼠学习和记忆能力变化,并于第4周行为学观察后取材,采用HE与尼氏染色观察神经元形态、分布及数量变化,免疫组化检测IL-1β阳性细胞数,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)的转染情况。结果与正常组比较,PBS对照组术后1周与4周逃避潜伏期延长、跨越平台次数显著减少,神经元损伤明显,尼氏小体显著减少,差异有统计学意义(均P<0.05);与PBS对照组比较,术后1周,低、中、高滴度组大鼠逃避潜伏期、跨越平台次数差异无统计学意义(均P>0.05);术后4周,低、中、高滴度组较PBS对照组逃避潜伏期时间缩短、跨越平台次数增加,神经元排列整齐、形态更规则,尼氏小体增多,IL-1β阳性细胞数明显减少(均P<0.05);与中滴度组比较,术后1周,低、高滴度组的潜伏期、跨越平台次数差异无统计学意义(均P>0.05);术后4周,低、高滴度组大鼠逃避潜伏期延长、跨越平台次数减少,海马神经元受损更严重,尼氏小体数减少,IL-1β阳性细胞数增多,GFP转染率显著降低(均P<0.05)。结论中滴度AAV9-ROCK2-shRNA能高效、稳定、低毒地转染大鼠海马组织,对VaD大鼠海马神经元保护作用最优。

蒙药珍宝丸通过激活SIRT1/NF-κB通路抑制氧糖剥夺/复氧小鼠海马神经细胞炎症和凋亡

目的观察蒙药珍宝丸即额尔敦-乌日勒(EU)对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)的HT22小鼠海马神经细胞凋亡的影响,并探究其潜在机制。方法采用三气培养箱和无糖无氧培养基构建OGD/R损伤HT22细胞模型;(10、20、40)μg/mL EU处理OGD/R细胞,筛选最适剂量20μg/mL。沉默信号调节因子1(SIRT1)抑制剂尼克酰胺(NAM)联合EU处理OGD/R损伤细胞设为EU联合NAM组,二甲基亚砜(DMSO)联合EU处理的OGD/R损伤细胞设为EU联合DMSO组;CCK-8法检测细胞活性,ELISA检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率;实时荧光定量PCR检测HT22细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-1β的mRNA表达,流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot法检测B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(BAX)、SIRT1、核因子κB抑制物α(IκBα)、磷酸化的核因子κB(p-NF-κB)的蛋白表达。结果与对照组相比,OGD/R组HT22细胞活性显著降低,LDH漏出率显著升高,而(20、40)μg/mL EU处理后,细胞活性显著升高,LDH漏出率也明显降低,20μg/mL的EU为最适剂量。OGD/R组细胞TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达及凋亡率均显著高于对照组,SIRT1、IκBα、Bcl2蛋白显著低于对照组,p-NF-κB、BAX蛋白显著高于对照组,EU明显抑制OGD/R引起的HT22细胞TNF-α、IL-6、IL-1β分泌和凋亡。结论EU显著减轻OGD/R小鼠的炎性反应和海马神经细胞凋亡,这与激活SIRT1/NF-κB信号通路有关。

苦参碱对缺氧/复氧小鼠海马神经元HT22细胞活力、凋亡的影响及机制研究

目的探讨苦参碱对缺氧/复氧(H/R)小鼠海马神经元HT22细胞活力、凋亡及脑源性神经营养因子(BDNF)/酪氨酸激酶受体B(TrkB)信号通路的影响。方法将处于对数生长期的HT22细胞分为对照组、H/R组及苦参碱低、中、高浓度组。对照组HT22细胞用无血清DMEM培养基在正常环境下培养28 h;H/R组HT22细胞在缺氧培养箱中维持4 h后在常氧条件下培养24 h;苦参碱低、中、高浓度组的H/R处理同H/R组,同时给予浓度分别为10、20、30μmol/L的苦参碱进行干预,培养24 h。检测HT22细胞活力、凋亡情况及凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)]和BDNF/TrkB信号通路蛋白水平。结果与对照组比较,H/R组HT22细胞吸光度值、存活率、Bcl-2、BDNF、TrkB蛋白水平降低,细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与H/R组比较,苦参碱低、中、高浓度组HT22细胞吸光度值、存活率、Bcl-2、BDNF、TrkB蛋白水平依次升高,细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白水平依次降低,差异有统计学意义(P<0.05),呈浓度依赖性。结论苦参碱能减轻H/R导致的神经元HT22细胞活力的降低,抑制HT22细胞凋亡,其机制可能与激活BDNF/TrkB信号通路有关。

槲皮素调控TLR4/NF-κB通路对阿尔茨海默病大鼠认知功能障碍及海马神经元损伤的影响

目的:探讨槲皮素(Que)调控Toll样受体4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)通路对阿尔茨海默病(AD)大鼠认知功能障碍及海马神经元损伤的影响。方法:将60只大鼠随机分为假手术组(10只)及造模组(50只),造模组通过脑内注射Aβ_(1~42)构建AD大鼠模型,将造模成功大鼠随机分为AD组、Que低剂量组(Que-L,50 mg/kg)、Que中剂量组(Que-M,100 mg/kg)、Que高剂量组(Que-H,200 mg/kg)、Que-H+LPS(TLR4激活剂)组(200 mg/kg Que+0.1 mg/kg LPS),每组10只。干预结束后,Morris水迷宫实验检测大鼠空间学习记忆能力;ELISA检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平;HE染色观察大鼠海马组织病理变化;TUNEL染色检测细胞凋亡变化;Western blotting检测海马组织中TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65表达水平。结果:AD组大鼠穿越平台次数少于假手术组,逃避潜伏期、血清TNF-α、血清IL-1β、细胞凋亡率、TLR4蛋白相对表达量及p-NF-κB p65/NF-κB p65均高于假手术组,差异均有统计学意义(P<0.05);Que-L组、Que-M组、Que-H组穿越平台次数均多于AD组,逃避潜伏期、血清TNF-α、血清IL-1β、细胞凋亡率、TLR4蛋白相对表达量及p-NF-κB p65/NF-κB p65均低于AD组,差异均有统计学意义(P<0.05),且呈现剂量依赖性;Que-H+LPS组大鼠穿越平台次数少于Que-H组,逃避潜伏期、血清TNF-α、血清IL-1β、细胞凋亡率、TLR4蛋白相对表达量及p-NF-κB p65/NF-κB p65均高于Que-H组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:Que可以改善AD大鼠认知功能障碍及海马神经元损伤,可能与抑制TLR4/NF-κB通路有关。

雄激素对小鼠海马神经元细胞影响的初步观察

目的:研究双氢睾酮(DHT)对小鼠海马神经元细胞系(HT22)的影响,分析雄激素对小鼠海马神经元细胞的影响。方法:通过体外培养小鼠海马神经元细胞,用不同浓度的双氢睾酮诱导小鼠海马神经元细胞。24 h后倒置相差显微镜观察海马神经元细胞的生长密度与细胞形态特点。结果:加入含有不同浓度DHT的10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基后,培养24 h后,对照组细胞编织状排布,生长密度约为100%;处理组1(0.25 ng/mL DHT)细胞呈编织状排列,重叠较少,连接密集,生长密度约为80%;处理组2(DHT浓度分为0.5 ng/mL)细胞较为紧密,生长密度约为70%;处理组3(1 ng/mL DHT)细胞大部分编织状连接,生长密度约为70%;处理组4(2 ng/mL DHT)细胞大部分互相连接,生长密度约为70%;处理组5(4 ng/mL DHT)可见少数连接的细胞,生长密度约为50%。结论:高剂量双氢睾酮在体外实验中影响小鼠海马神经元细胞的增长。