Homer1b/c通过内质网功能调节由谷氨酸兴奋性毒性损伤诱发的小鼠海马神经元HT22细胞自噬

目的研究Homer1b/c蛋白在谷氨酸兴奋性毒性损伤诱发的细胞自噬中的作用及机制。方法选用小鼠海马神经元HT22细胞,通过500μmol/L L-谷氨酸处理建立细胞损伤模型。用siRNA慢病毒转染方式下调Homer1b/c表达,用10μmol/L钙离子螯合剂BAPTA-AM、10 mmol/L内质网应激抑制剂4-PBA分别抑制细胞内钙离子释放和内质网应激后,使用蛋白质印迹法检测细胞中Homer1b/c蛋白,自噬效应蛋白[beclin-1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)]及内质网应激标志蛋白[C/EBP同源蛋白(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP 78)]的表达水平。结果L-谷氨酸处理HT22细胞12 h后,细胞中beclin-1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均较对照组升高(均P<0.05);与转染对照组相比,下调Homer1b/c表达可降低细胞中beclin-1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(均P<0.05);抑制细胞内钙离子释放和内质网应激均能降低细胞中beclin-1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(均P<0.05);下调Homer1b/c表达后,抑制细胞内钙离子释放和内质网应激未能进一步降低细胞中beclin-1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。结论Homer1b/c能够调节谷氨酸兴奋性毒性损伤诱发的细胞自噬,其调节作用可能与内质网功能有关。

藏红花素通过抑制JAK2/STAT3信号通路减轻脑缺血再灌注大鼠海马神经元损伤

目的研究藏红花素(CRO)对脑缺血再灌注(CI/R)大鼠海马神经元损伤的影响并探索其潜在机制。方法将144只雄性SD大鼠按照随机数字表法分为假手术(Sham)组,模型(CI/R)组,CRO低、中、高剂量(CRO-L、CRO-M、CRO-H)组和尼莫地平(NMP)组6组,每组24只。采用线栓法制备CI/R大鼠模型,各组分别于造模前7 d开始1次/d腹腔注射(ip)给药(CRO-L、CRO-M、CRO-H组分别ip给药10、20、40 mg/kg,NMP组ip给药1 mg/kg,Sham组和CI/R组ip给予生理盐水5 mL/kg)。再灌注24 h后,通过Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力,TTC染色检测脑梗死率,HE染色法行海马CA1区和CA3区神经元病理学检查,TUNEL染色法行海马CA1区和CA3区神经元凋亡检查,ELISA法检测海马组织白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,Western blot法检测海马组织Janus激酶2/信号转导与转录激活子3(JAK2/STAT3)信号通路相关蛋白相对表达量。结果与Sham组比较,CI/R组学习记忆能力明显降低,脑梗死率明显升高(P<0.05);海马CA1区和CA3区神经元呈现数量减少、间隙增大、空泡样变、核膜核仁边界模糊、炎性细胞浸润等病理改变,凋亡率明显升高(P<0.05);海马组织IL-1β、IL-8、TNF-α含量明显升高(P<0.05);p-JAK2、p-STAT3、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、激活型半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)相对表达量和p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、Bax/Bcl-2表达比值均明显升高,Bcl-2相对表达量明显降低(P<0.05)。与CI/R组比较,CRO-M组、CRO-H组和NMP组大鼠学习记忆能力显著改善、脑梗死率明显降低(P<0.05);海马CA1区和CA3区神经元病理学改变明显改善、凋亡率明显降低(P<0.05);海马组织IL-1β、IL-8、TNF-α含量明显降低(P<0.05);p-JAK2、p-STAT3、HMGB1、Bax、Cleaved Caspase-3相对表达量和p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、Bax/Bcl-2表达比值均明显降低(P<0.05)。CRO上述作用呈现一定的剂量依赖性,且CRO-H组对CI/R大鼠学习记忆能力、海马CA1区和CA3区神经元病理学改变和凋亡率、炎症因子含量、JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响显著优于NMP组(P<0.05)。结论CRO可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路活化,减轻炎症和神经元凋亡,从而对CI/R大鼠海马神经元损伤起到保护作用。

神经复元方对H_(2)O_(2)诱导的大鼠海马神经元损伤后雄激素受体活化的影响

[目的]探究神经复元方对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的SD大鼠海马神经元损伤中雄激素受体(AR)的活化影响,探讨其治疗卒中后抑郁的作用机制。[方法]取新生24 h的SD大鼠的海马组织,分离原代大鼠海马神经元,通过微管相关蛋白2(MAP-2)免疫荧光鉴定细胞。对SD大鼠给予神经复元方灌胃处理,分离血清,获得空白血清和含药血清,再利用细胞计数试剂(CCK8)检测确定含药血清的最佳处理浓度。使用100μmol/L的H_(2)O_(2)对大鼠海马神经元细胞处理致损伤,分为空白血清组、损伤模型+空白血清组、损伤模型+含药血清组、损伤模型+氟西汀4组。利用蛋白质免疫印迹法(Western blot)和免疫荧光检测各组AR蛋白磷酸化及非磷酸化的情况。[结果]与空白血清组相比,损伤模型+空白血清组的AR、p-AR蛋白表达显著下降。与损伤模型+空白血清组相比,损伤模型+含药血清组和损伤模型+氟西汀组的AR、p-AR蛋白表达上升。[结论]神经复元方对H_(2)O_(2)诱导的SD大鼠海马神经元损伤有一定修复作用,能够促进AR活化,提示AR可能为神经复元方治疗脑卒中后抑郁的重要靶蛋白。

积雪草酸调节PI3K/AKT信号通路对七氟烷诱导的海马神经元HT-22细胞凋亡的影响

目的探讨积雪草酸(AA)通过调节磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路对七氟烷(SEVO)诱导的HT-22细胞凋亡的影响。方法使用不同浓度(0、5、10、15、20、30μmol/L)AA处理七氟烷诱导HT-22细胞24 h,CCK-8检测HT-22细胞活力;将HT-22细胞分为对照(Control)组、七氟烷(SEVO)组、AA低浓度(AA-L,10μmol/L)组、AA中浓度(AA-M,15μmol/L)组、AA高浓度(AA-H,20μmol/L)组和AA高浓度+PI13K通路抑制剂LY294002(AA-H+LY294002,20μmol/L AA+5μmol/L LY294002)组。显微镜下观察各组细胞形态变化,ELISA检测炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)及氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)水平,活性氧(ROS)试剂盒检测ROS水平,TUNEL试剂盒检测HT-22凋亡,JC-1法检测线粒体膜电位,三磷酸腺苷(ATP)含量检测试剂盒检测ATP含量,Western blot检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT蛋白表达。结果与0μmol/L相比,5~30μmol/L AA处理的HT-22细胞活力呈浓度依赖性升高(P<0.05),选择浓度为10、15、20μmol/L的AA用于后续实验。与SEVO组相比,AA-L组、AA-M组和AA-H组TNF-α、IL-6、MDA和ROS水平、细胞凋亡率、Bax和Caspase-3蛋白表达降低,SOD和GSH-Px水平、红/绿JC-1荧光比、ATP含量、Bcl-2蛋白表达、PI3K和AKT磷酸化水平增加(P<0.05),且呈浓度依赖性。LY294002可逆转AA对七氟烷诱导的HT-22细胞损伤的保护作用(P<0.05)。结论AA通过激活PI3K/AKT信号通路保护七氟烷诱导的HT-22细胞损伤,为新型减轻七氟烷诱导的神经毒性的药物开发提供了一定的理论参考。

温肺降浊方对血管性痴呆大鼠海马神经元的作用机制

目的:观察温肺降浊方对血管性痴呆(VaD)大鼠的作用机制。方法:建立VaD大鼠模型,随机分为模型组、西药组、温肺降浊方低剂量组、温肺降浊方中剂量组、温肺降浊方高剂量组,每组6只。另取6只大鼠设为假手术组,模型组和假手术组给予0.9%氯化钠溶液灌胃;西药组给予尼莫地平灌胃;温肺降浊方各剂量组给予相应剂量的温肺降浊汤灌胃。给药28 d后,采用Morris水迷宫实验评价各组大鼠学习记忆能力;HE及Nissl染色法进行组织病理学检测。采用RT-qPCR和Western blot检测各组大鼠海马组织中沉默信息调节因子1(SIRT1)/肌醇需求酶1α(IRE1α)/剪接型X-盒结合蛋白1(XBP1S)/CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)信号通路相关mRNA和蛋白表达。结果:与假手术组比较,模型组大鼠逃避潜伏期明显延长,穿越平台次数则减少。与假手术组比较,模型组大鼠海马CA1区病理损伤严重,神经元细胞明显减少,尼氏小体数量明显减少,SIRT1 mRNA和蛋白表达则降低(均P<0.01)。与假手术组比较,模型组大鼠IRE1α、XBP1S、CHOP mRNA和XBP1S、CHOP蛋白及p-IRE1α/IRE1α明显升高(均P<0.01)。与模型组比较,温肺降浊方中剂量组、温肺降浊方高剂量组、西药组大鼠逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增加(均P<0.05)。与模型组比较,西药组和温肺降浊方各剂量组大鼠海马CA1区病理损伤减轻,神经元细胞数量增加,尼氏小体数量增加。与模型组比较,西药组和温肺降浊方各剂量组SIRT1 mRNA和蛋白表达升高,且温肺降浊方高剂量组和西药组表达较高。IRE1α、XBP1S、CHOP mRNA和XBP1S、CHOP蛋白以及p-IRE1α/IRE1α水平降低,且温肺降浊方高剂量组和西药组水平更低(均P<0.01)。结论:温肺降浊方通过激活SIRT1/IRE1α/XBP1S/CHOP信号通路,减轻VaD大鼠海马神经元区病变,从而发挥改善VaD大鼠认知能力的作用。

百事乐加味方对氧糖剥夺联合脂多糖诱导海马神经元细胞损伤的保护作用及机制研究

目的观察百事乐加味方对体外培养的海马神经元细胞的保护作用,探讨其治疗卒中后抑郁的作用机制。方法体外分离培养乳鼠海马神经元细胞,以氧糖剥夺联合脂多糖诱导海马神经元细胞损伤。将细胞分为正常组、模型组、空白血清组(10%)和百事乐加味方含药血清组(10%),倒置显微镜观察细胞形态变化,CCK-8法检测细胞存活率,Hoechst33342染色观察细胞凋亡情况,ELISA检测细胞上清液神经递质谷氨酸(Glu)、5-羟色胺(5-HT)及促炎因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6含量,免疫荧光染色检测嘌呤能P2X7受体(P2X7R)、NOD样受体蛋白3(NLRP3)表达。结果与正常组比较,模型组海马神经元细胞形态发生明显变化,细胞存活率显著降低(P<0.01),细胞凋亡增加(P<0.01),细胞上清液Glu、TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著增加(P<0.05,P<0.01),5-HT含量显著减少(P<0.01),海马神经元P2X7R和NLRP3表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,百事乐加味方含药血清组海马神经元细胞形态明显改善,细胞存活率显著升高(P<0.01),细胞凋亡减少(P<0.01),细胞上清液Glu、TNF-α、IL-1β含量显著减少(P<0.05,P<0.01),5-HT含量显著增加(P<0.01),海马神经元P2X7R和NLRP3表达显著降低(P<0.01)。结论百事乐加味方可能通过抑制P2X7R/NLRP3信号通路、调节神经递质分泌、抑制炎症因子释放发挥对氧糖剥夺联合脂多糖诱导的海马神经元细胞炎症损伤的保护作用,从而治疗卒中后抑郁。

电针联合柴胡疏肝散对抑郁大鼠海马神经元活性、MAO水平及CaMK信号蛋白水平的影响

目的 探究电针联合柴胡疏肝散对抑郁大鼠海马神经元活性、单胺氧化酶(MAO)水平及钙调蛋白激酶(CaMK)信号蛋白水平的影响。方法 将15只雄性SD大鼠根据不同治疗方法分为抑郁组、健康组、电针组、柴胡疏肝散组、联合组各3只。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测海马神经元细胞中CaMKⅡmRNA表达量,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞中MAO表达水平,Hoechst 33258荧光染色法检测海马神经元细胞的凋亡情况,水迷宫行为检测大鼠空间学习记忆能力,Western印迹法检测细胞中CaMKⅡ蛋白含量。结果 与抑郁组相比较,电针组、柴胡疏肝散组、联合组空间学习记忆能力显著更优(均P<0.05),联合组空间学习记忆能力显著优于电针组、柴胡疏肝散组(均P<0.05)。电针组、柴胡疏肝散组、联合组海马神经元细胞的凋亡率、MAO表达显著低于抑郁组(均P<0.05),与电针组、柴胡疏肝散组相比较,联合组细胞凋亡细胞率、MAO表达显著下降(均P<0.05)。电针组、柴胡疏肝散组、联合组海马神经元细胞CaMKⅡ蛋白表达、CaMKⅡmRNA表达量显著高于抑郁组(均P<0.05)。结论 电针与柴胡疏肝散对抑郁大鼠均有改善作用,两者联合治疗效果更佳,电针与柴胡疏肝散对抑郁大鼠的作用机制可能与提高CaMK信号蛋白水平有关。

芹菜素对脂多糖诱导小鼠海马神经元细胞损伤的改善作用及其机制

目的观察芹菜素对脂多糖(LPS)诱导小鼠海马神经元细胞损伤的改善作用,并探讨其相关机制。方法体外培养小鼠海马神经元细胞系HT22,采用CCK-8法筛选造模药物LPS及干预药物芹菜素的最佳作用浓度,筛选得到LPS、芹菜素的最佳作用浓度分别为2µg/mL、0.25µmol/L。将HT22细胞分为对照组、模型组及芹菜素组,对照组正常培养不作任何处理,模型组加入0.25µmol/L的LPS培养,芹菜素组以2µg/mL的LPS干预24 h后,再加入0.25µmol/L芹菜素培养。采用Annexin V/PI双染法观察细胞凋亡情况,Western blotting法检测细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)蛋白。采用UPLC-Q-TOF-MS/MS分析并筛选各组细胞差异代谢产物,对差异代谢产物进行MetPA分析,获取其潜在的代谢途径。结果细胞凋亡率及TNF-α、IL-1β蛋白表达模型组>芹菜素>对照组(P均<0.01)。代谢组学分析共筛选出尿苷二磷酸葡萄糖、谷氨酸、琥珀酸、柠檬酸、左旋肉碱等16个差异代谢产物,共涉及亚油酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、三羧酸循环、谷胱甘肽代谢等28条代谢途径。结论芹菜素对LPS诱导的小鼠海马神经元细胞损伤具有改善作用,其机制可能与调控细胞内代谢紊乱有关。

LINC00657对氧糖剥夺诱导的小鼠海马神经元细胞损伤的影响及机制研究

目的探讨LINC00657对氧糖剥夺(OGD)诱导的小鼠海马神经元细胞损伤的影响及作用机制。方法对小鼠海马神经元细胞HT22进行OGD处理,建立损伤模型,将正常培养的HT22细胞作为对照;将si-NC、si-LINC00657、微小RNA(miR)-NC、miR-224-3p mimics分别转染至HT22细胞,然后进行OGD处理;向HT22细胞共转染si-LINC00657和anti-miR-NC,或共转染si-LINC00657和anti-miR-224-3p,然后进行OGD处理。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测LINC00657、miR-224-3p相对表达量;采用CCK-8法、流式细胞术分别检测细胞存活率、细胞凋亡率;采用试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)水平;采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-224-3p过表达对野生型LINC00657载体(WT-LINC00657)、突变型LINC00657载体(MUT-LINC00657)荧光素酶活性的影响。结果与对照细胞相比,OGD诱导的HT22细胞中LINC00657表达上调,miR-224-3p表达下调,差异有统计学意义(P<0.05);分别与转染si-NC或转染miR-NC相比,转染si-LINC00657或转染miR-224-3p mimics后,细胞存活率、SOD活性和GSH-Px活性升高,细胞凋亡率、LDH活性和MDA水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);miR-224-3p过表达降低了WT-LINC00657的荧光素酶活性,差异有统计学意义(P<0.05);与共转染si-LINC00657和anti-miR-NC的细胞相比,共转染si-LINC00657和anti-miR-224-3p的细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,LDH活性、MDA水平升高,SOD、GSH-Px活性降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论干扰LINC00657可通过上调miR-224-3p而促进细胞增殖,并抑制细胞凋亡和氧化应激反应,从而减轻OGD诱导的小鼠海马神经元细胞损伤。

Klotho通过激活AMPK/mTOR信号通路缓解CCH大鼠海马神经元的铁死亡和氧化应激

目的探讨抗衰老基因Klotho对慢性脑低灌注(CCH)大鼠认知障碍的改善作用及对海马区神经元铁死亡和氧化应激的影响和潜在调控机制。方法使用双侧颈总动脉永久性闭塞术(2-VO)建立CCH大鼠,并将大鼠分为5组(每组n=10),其中包括假手术组、CCH组、重组Klotho蛋白(Klotho)+CCH组(重组Klotho蛋白海马区注射10 mg·kg·w^(-1),x4w)、生理盐水+CCH组(生理盐水海马区注射2mg·kg·w^(-1),x4w)、Klotho+阿卡地新(Acadesine,AICAR)+CCH组(Klotho蛋白10 mg·kg·w^(-1),x4w和AICAR 1.5 mg·kg·w^(-1),x4w海马区联合注射)。4 w后行Morris水迷宫实验检测各组大鼠的逃避潜伏期。随后安乐死大鼠,取海马组织。Western blot法检测海马组织中单磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMPK)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化的AMPK(p-AMPK)、磷酸化的(p-mTOR)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、铁死亡抑制蛋白1(FSP1)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白Tau、神经元特异核蛋白(NeuN)的表达水平。ELISA试剂盒检测海马组织中的活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量。结果与假手术组比,CCH组的逃避潜伏期延长(P<0.05),p-AMPK、MDA、NSE、Tau、ROS的水平显著增加(^(均)P<0.05),但p-mTOR、SOD、GSH、GPX4、NeuN、FSP1的水平显著下调(^(均)P<0.05)。与CCH组比,生理盐水+CCH组的逃避潜伏期以及海马区p-AMPK、p-mTOR、MDA、ROS、SOD、GSH、GPX4、NSE、Tau、NeuN、FSP1的水平差异均无统计学意义(^(均)P>0.05)。与CCH组或生理盐水+CCH组比,Klotho+CCH组的逃避潜伏期缩短(^(均)P<0.05),p-AMPK、MDA、ROS、NSE、Tau的水平显著下调(均P<0.05),但p-mTOR、SOD、GSH、GPX4、NeuN、FSP1的水平显著上调(均P<0.05)。与Klotho+CCH组比,Klotho+AICAR+CCH组的逃避潜伏期延长(P<0.05),p-AMPK、MDA、ROS、NSE、Tau的水平显著增加(^(均)P<0.05),但p-mTOR、SOD、GSH、GPX4、NeuN、FSP1的水平显著下调(^(均)P<0.05)。结论Klotho通过激活AMPK/mTOR信号通路缓解CCH大鼠海马神经元的铁死亡和氧化应激。

miR-132-3p靶向调控PTEN/Akt信号通路对缺氧/复氧诱导海马神经元HT22细胞损伤的影响

目的研究miR-132-3p靶向调控第10号染色体缺失的磷酸酶基因(PTEN)/蛋白激酶B(Akt)信号通路对缺氧/复氧(H/R)诱导海马神经元HT22细胞损伤的影响。方法体外培养HT22细胞并随机分为对照组、H/R组、阴性对照(miR-132-3p mimics阴性对照+空载质粒)组、miR-132-3p mimics组(miR-132-3p mimics)、PTEN敲低组(PTEN siRNA质粒)、miR-132-3p mimics+PTEN过表达组(miR-132-3p mimics+PTEN过表达质粒),除对照组外,其余各组进行H/R处理,同时进行分组转染,然后采用qRT-PCR实验、免疫印迹法检测各组细胞miR-132-3p与PTEN/Akt通路相关蛋白表达;采用MTT法、TUNEL染色分别检测各组细胞增殖与凋亡情况;采用试剂盒测量各组细胞活性氧(ROS)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、白细胞介素(IL)-6、IL-18水平;采用免疫印迹法检测各组细胞凋亡相关蛋白(Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2)表达;采用双荧光素酶报告实验验证miR-132-3p对HT22细胞PTEN的靶向调控。结果与对照组相比,H/R组细胞miR-132-3p表达、p-Akt/Akt、GSH-Px与SOD水平、Bcl-2蛋白表达、细胞活力降低(P<0.05),细胞凋亡率、PTEN mRNA与蛋白表达、ROS相对水平、LDH产生水平、IL-6与IL-18水平、Bax与Cleaved Caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)。与H/R组相比,miR-132-3p mimics组、PTEN敲低组p-Akt/Akt、GSH-Px与SOD水平、Bcl-2蛋白表达、细胞活力升高(P<0.05),细胞凋亡率、PTEN mRNA与蛋白表达、ROS相对水平、LDH产生水平、IL-6与IL-18水平、Bax与Cleaved Caspase-3蛋白表达降低(P<0.05);阴性对照组细胞各指标无明显变化(P>0.05)。与miR-132-3p mimics相比,miR-132-3p mimics+PTEN过表达组p-Akt/Akt、GSH-Px与SOD水平、Bcl-2蛋白表达、细胞活力降低(P<0.05),细胞凋亡率、PTEN mRNA与蛋白表达、ROS相对水平、LDH产生水平、IL-6与IL-18水平、Bax与Cleaved Caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)。miR-132-3p可靶向下调HT22细胞PTEN表达。结论miR-132-3p可通过靶向下调PTEN表达而激活Akt信号,进而抑制H/R诱导的HT22细胞炎症与凋亡,缓解其细胞损伤。

一种低密度及高纯度胎鼠原代海马神经元培养方法的优化及鉴定

目的通过将海马、皮层细胞共培养的方式建立一种低密度、高纯度、高稳定性的大鼠胎鼠原代海马神经元体外培养方法,以获取纯度更高、活力更好的原代海马神经元。方法分离孕16~18 d SD大鼠胎鼠的海马和皮层并分别剪碎,经0.125%胰蛋白酶消化后用200目细胞筛过滤,将获得的细胞悬液以包围的形式分别接种于培养板的内层和外环上,于含10%马血清的DMEM/F12培养基中进行共同培养,4~6 h细胞贴壁后更换培养基为维持培养基培养(Neurobasal培养基+2%B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺)。通过CCK-8试剂盒检测细胞活力,利用免疫荧光染色检测海马神经元纯度。结果海马神经元在5 d后形成纵横交错的神经网络,生长状态较好,经鉴定海马神经元的纯度高达98%,且能够稳定存活3周。结论利用海马、皮层细胞共培养的方法可以获取高纯度、高活性、高存活率、高稳定性的胎鼠原代海马神经元,可为神经系统中海马神经元相关疾病研究提供一定的实验条件。

丹参酮IIA上调Nrf2/HO-1信号通路减轻海马神经元氧糖剥夺/复糖复氧损伤

目的:探讨丹参酮IIA(Tan IIA)对海马神经元氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)损伤以及核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1(Nrf2/HO-1)信号通路的影响。方法:体外培养并取对数生长期小鼠海马神经元HT22细胞开展实验,设对照(Control)组、模型(OGD/R)组、Tan IIA(5μg/ml)组、Nrf2激动剂叔丁基对苯二酚(TBHQ,1.6μg/ml)组和Tan IIA(5μg/ml)+TBHQ(1.6μg/ml)组。各组分别给药干预2h后,除Control组外,其它组通过氧糖剥夺6h后复糖复氧24h构建HT22细胞OGD/R损伤模型。MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,二氯荧光素双乙酸盐(DCFH-DA)探针法检测细胞中活性氧(ROS)含量,硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化法、钼酸铵法检测超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western Blotting检测Nrf2/HO-1信号通路相关mRNA和蛋白表达。结果:与OGD/R组相比,Tan IIA组、TBHQ组和Tan IIA+TBHQ组HT22细胞活力明显升高、凋亡率明显降低(P<0.05);细胞中ROS、MDA含量明显降低,SOD、CAT活性明显升高(P<0.05);Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表达量明显升高,B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)蛋白表达量明显升高,Bcl-2相关X蛋白(Bax)、激活型半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)蛋白表达量及Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值明显降低(P<0.05)。Tan IIA+TBHQ组对各检测指标的调控作用明显优于Tan IIA组和BHQ组(P<0.05)。结论:Tan IIA对OGD/R损伤海马神经元氧化应激损伤和凋亡具有抑制作用,其机制可能与上调Nrf2/HO-1信号通路有关。

红景天苷对海马神经元自然衰老的影响和机制研究

目的探讨红景天苷延缓原代海马神经元自然衰老的作用及可能的机制。方法分离并培养大鼠原代海马神经元至自然衰老,随机分为短期培养(ST)组、长期培养(LT)组、红景天苷低和高浓度(10μM和20μM)组、阳性药环黄芪醇(5μM)组,使用细胞计数法检测神经元存活率,使用衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测神经元衰老,使用流式细胞术检测神经元凋亡,使用Western blot检测端粒酶逆转录酶(TERT)表达,使用PCR-ELISA法检测端粒酶活性。结果与ST组比较,LT组的神经元出现神经元退化,胞体萎缩,细胞数量和存活率显著降低(P<0.01),神经元SA-β-gal阳性率和凋亡率明显增加(P<0.01),而神经元内端粒酶和TERT表达水平显著降低(P<0.01);给予红景天苷和环黄芪醇处理后,与LT组神经元相比,细胞存活率明显提高(P<0.05),细胞SA-β-gal阳性率显著降低(P<0.05),神经元凋亡率明显减少(P<0.01),神经元内的端粒酶和TERT表达水平显著提高(P<0.01)。结论红景天苷能够减少海马神经元凋亡,提高端粒酶的表达水平,进而延缓神经元衰老。

紫草素对体外模拟糖尿病并发抑郁症环境大鼠海马神经元凋亡的影响

目的研究紫草素对模拟糖尿病并发抑郁症(DD)环境大鼠海马神经元凋亡的保护作用。方法取大鼠胎鼠海马神经元进行体外原代培养,并以葡萄糖联合皮质酮干预的方法构建体外模拟DD环境海马神经元细胞模型。噻唑蓝法检测不同浓度紫草素对模拟DD环境海马神经元细胞活力的影响。取传代的大鼠胎鼠海马神经元细胞,随机分为对照组、模型组、紫草素(2μmol/L)组、C16-PAF[有效的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)激活剂,4μmol/L]组、紫草素+C16-PAF(2μmol/L+4μmol/L)组,药物干预、建模后,检测神经元细胞活力、细胞损伤、凋亡率、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-18(IL-18)水平和凋亡相关蛋白[半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)]及MAPK信号通路蛋白表达。结果不同浓度紫草素可增强体外模拟DD环境大鼠海马神经元活力(P<0.05),并在一定浓度范围内随浓度升高而作用增强。与对照组比较,模型组神经元细胞尼氏小体数减少,细胞明显损伤,细胞活力降低(P<0.05),凋亡率、TNF-α、IL-6、IL-18水平和caspase-9、Bax、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)/p38 MAPK蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,紫草素组神经元尼氏小体数增加,损伤减轻,细胞活力升高(P<0.05),凋亡率、TNF-α、IL-6、IL-18水平和caspase-9、Bax、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白表达降低(P<0.05);C16-PAF可逆转紫草素对模拟DD环境海马神经元细胞模型的作用效果(P<0.05)。结论紫草素可抑制MAPK信号激活,减少炎性细胞因子表达合成,减轻模拟DD环境大鼠海马神经元炎症损伤,抑制其凋亡,起到保护作用。

黄芪多糖调控Nrf2/HO-1通路对阿尔茨海默病大鼠海马神经元损伤的作用机制研究

目的:探讨黄芪多糖(APS)对阿尔茨海默病(AD)大鼠海马神经元损伤的影响及其机制。方法:按随机数字表法将180只健康Wistar大鼠平均分为正常组、模型组、APS低剂量组(APS-L组)、APS中剂量组(APS-M组)、APS高剂量组(APS-H组)和吡拉西坦片组。除正常组外,其他各组采用双侧海马定向注射β-淀粉样蛋白1~42片段(Aβ_(1~42))的方法制备AD大鼠模型,APS-L组、APS-M组、APS-H组分别给予200、400、800 mg/kg APS灌胃,吡拉西坦片组给予500 mg/kg吡拉西坦片灌胃,正常组和模型组给予0.9%氯化钠溶液灌胃,每日1次,连续给予30 d。苏木精-伊红染色观察海马CA1区神经元病理改变,透射电子显微镜观察神经元超微结构,分光光度法检测海马组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量,酶联免疫吸附(ELISA)法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6水平,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法测核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)mRNA表达,蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测Nrf2、HO-1、胞浆核因子-κB p65(NF-κB p65)、胞核NF-κB p65蛋白表达。结果:与模型组比较,APS-L组、APS-M组、APS-H组和吡拉西坦片组大鼠海马CA1区神经元病理性形态结构改变、超微结构病变呈不同程度改善。APS-M组、APS-H组和吡拉西坦片组海马CA1区神经元病理分级明显降低(P<0.05),SOD、GSH-Px活性明显升高且MDA含量明显降低(P<0.05),TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显降低(P<0.05),Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表达量均明显升高(P<0.05),胞核NF-κB p65表达量和胞核NF-κB p65/胞浆NF-κB p65明显降低(P<0.05)。APS对各检测指标的影响具有一定剂量依赖性,APS-H组对各指标的影响均优于吡拉西坦片组(P<0.05)。结论:APS对AD大鼠海马神经元损伤具有保护作用,该作用具有一定的剂量依赖性,其机制可能与激活Nrf2/HO-1通路、抑制NF-κB核转位进而抑制氧化应激和炎症反应有关。

夏天无片对血管性痴呆模型大鼠学习记忆能力及海马神经元凋亡的影响

目的观察夏天无片对血管性痴呆模型大鼠学习记忆能力的影响,并从海马神经元凋亡角度探讨其可能作用机制。方法采用改良2-VO法制备血管性痴呆大鼠模型,随机均分为假手术组、模型组、尼莫地平组(0.3 g·kg^(-1)),夏天无低、中、高剂量组(0.2、0.4、0.8 g·kg^(-1)),连续灌胃给药40天。采用Morris水迷宫,HE染色、TUNEL、免疫组化染色、Western blot等实验方法和技术分别观察各组大鼠的学习记忆能力、海马CA1区神经元病理改变及凋亡情况,并测定Bax、Bcl-2蛋白表达水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠平均逃避潜伏期延长(P<0.01),穿越平台次数减少(P<0.01);海马神经元排列紊乱,细胞结构不同程度受损;神经元凋亡数目增多(P<0.01);Bcl-2、Bax蛋白表达水平降低。相较于模型组,夏天无各剂量组能显著提升血管性痴呆大鼠学习记忆能力(P<0.01或P<0.05),改善锥体细胞病理变化,减少海马神经元凋亡数目(P<0.01或P<0.05),提高Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结论夏天无片有效治疗血管性痴呆的机制可能是通过提高Bcl-2/Bax表达的水平,发挥抗凋亡效应,进而保护海马神经元。

苦参碱对缺氧/复氧小鼠海马神经元HT22细胞活力、凋亡的影响及机制研究

目的探讨苦参碱对缺氧/复氧(H/R)小鼠海马神经元HT22细胞活力、凋亡及脑源性神经营养因子(BDNF)/酪氨酸激酶受体B(TrkB)信号通路的影响。方法将处于对数生长期的HT22细胞分为对照组、H/R组及苦参碱低、中、高浓度组。对照组HT22细胞用无血清DMEM培养基在正常环境下培养28 h;H/R组HT22细胞在缺氧培养箱中维持4 h后在常氧条件下培养24 h;苦参碱低、中、高浓度组的H/R处理同H/R组,同时给予浓度分别为10、20、30μmol/L的苦参碱进行干预,培养24 h。检测HT22细胞活力、凋亡情况及凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)]和BDNF/TrkB信号通路蛋白水平。结果与对照组比较,H/R组HT22细胞吸光度值、存活率、Bcl-2、BDNF、TrkB蛋白水平降低,细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与H/R组比较,苦参碱低、中、高浓度组HT22细胞吸光度值、存活率、Bcl-2、BDNF、TrkB蛋白水平依次升高,细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白水平依次降低,差异有统计学意义(P<0.05),呈浓度依赖性。结论苦参碱能减轻H/R导致的神经元HT22细胞活力的降低,抑制HT22细胞凋亡,其机制可能与激活BDNF/TrkB信号通路有关。

大蒜素通过抑制内质网应激减轻血管性痴呆大鼠海马神经元损伤

目的研究大蒜素对血管性痴呆(VD)大鼠海马神经元损伤及内质网应激(ERS)的影响。方法取120只实验用大鼠随机分为6组(n=20):假手术组,模型组,尼莫地平组和低、中、高剂量大蒜素组。除假手术组外,其他5组通过结扎双侧颈总动脉构建VD大鼠模型。低、中、高剂量大蒜素组分别1次·d^(-1)灌胃5、10、20 mg·kg^(-1),尼莫地平组1次·d^(-1)灌胃2 mg·kg^(-1),假手术组和模型组1次·d^(-1)灌胃生理盐水。2周后,进行神经症状评分,HE、TUNEL染色法观察海马神经元病理性变化以及神经元凋亡情况,ELISA法检测海马组织炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)水平,Western blot法检测ERS相关蛋白和核因子-κB p65(NF-κB p65)、Caspase-12及Caspase-3蛋白表达。结果与模型组比较,中、高剂量大蒜素组和尼莫地平组大鼠神经症状评分显著降低(P<0.05);海马神经元病理性改变和神经元凋亡状况明显好转;海马组织TNF-α、IL-1β和IL-6含量显著降低(P<0.05),葡萄糖调控蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、NF-κBp65、Caspase-12、Caspase-3相对表达量和内质网激酶磷酸化率(p-PERK/PERK)显著降低(P<0.05)。与尼莫地平组比较,高剂量大蒜素组神经症状评分和TNF-α、IL-6含量显著降低(P<0.05),GRP78、CHOP、NF-κBp65、Caspase-3相对表达量和PERK磷酸化率显著降低(P<0.05)。结论大蒜素可减轻VD大鼠海马神经元凋亡和炎症损伤,其可能的作用机制是抑制ERS。

ROCK2-shRNA转染对VaD大鼠海马神经元的保护作用

目的探讨不同滴度ROCK2-shRNA腺相关病毒(AAV9-ROCK2-shRNA)转染对血管性痴呆(VaD)大鼠海马神经元的保护作用。方法选取成年SPF级健康雄性SD大鼠40只,随机分为正常组、PBS对照组、低滴度组、中滴度组、高滴度组(n=8)。采用双侧颈总动脉永久性结扎法制备VaD模型,将AAV9-ROCK2-shRNA按原液(高滴度)、2倍(中滴度)、10倍(低滴度)稀释后,采用脑立体定位术注射至大鼠海马组织周围。于1周及4周后,进行Morris水迷宫测试大鼠学习和记忆能力变化,并于第4周行为学观察后取材,采用HE与尼氏染色观察神经元形态、分布及数量变化,免疫组化检测IL-1β阳性细胞数,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)的转染情况。结果与正常组比较,PBS对照组术后1周与4周逃避潜伏期延长、跨越平台次数显著减少,神经元损伤明显,尼氏小体显著减少,差异有统计学意义(均P<0.05);与PBS对照组比较,术后1周,低、中、高滴度组大鼠逃避潜伏期、跨越平台次数差异无统计学意义(均P>0.05);术后4周,低、中、高滴度组较PBS对照组逃避潜伏期时间缩短、跨越平台次数增加,神经元排列整齐、形态更规则,尼氏小体增多,IL-1β阳性细胞数明显减少(均P<0.05);与中滴度组比较,术后1周,低、高滴度组的潜伏期、跨越平台次数差异无统计学意义(均P>0.05);术后4周,低、高滴度组大鼠逃避潜伏期延长、跨越平台次数减少,海马神经元受损更严重,尼氏小体数减少,IL-1β阳性细胞数增多,GFP转染率显著降低(均P<0.05)。结论中滴度AAV9-ROCK2-shRNA能高效、稳定、低毒地转染大鼠海马组织,对VaD大鼠海马神经元保护作用最优。