神经干细胞与血管性痴呆大鼠海马胆碱能神经元变化的相关性

背景:血管性痴呆患者存在额叶皮质及海马胆碱能神经元受损,可能是导致患者认知功能受损的形态学基础。目的:探讨神经干细胞与血管性痴呆大鼠海马胆碱能神经元变化的相关性。方法:纳入90只SD大鼠,随机均分为3组,其中假手术组仅分离颈总动脉,模型组和神经干细胞移植组采用两血管结扎法建立血管性痴呆动物模型,神经干细胞移植组在建立血管性痴呆动物模型之后向大鼠海马CA1区注射5μL神经干细胞,另外两组按照同样的操作注射相同剂量的生理盐水。移植后第3,7,14,30,60天,分别处死各组6只大鼠,采用S-P免疫组化法检测各组脑实质Brd U阳性细胞和Ch AT阳性细胞分布情况,利用Morris水迷宫系统检测大鼠学习记忆能力。结果与结论:Brd U阳性细胞主要分布在大脑皮质区以及海马区,尤其是血管周围。在基底核和丘脑以及室管膜区,可观察到少量Brd U阳性细胞存在。随着时间的推移,Brd U阳性细胞数目不断下降,到移植后60 d,仅存在少量Brd U阳性细胞存活。移植后不同时间模型组和神经干细胞移植组的Ch AT阳性细胞数均显著大于假手术组(P<0.05);模型组Ch AT阳性细胞数显著低于神经干细胞移植组(P<0.05)。模型组寻找平台时间显著长于假手术组,穿越平台次数显著少于假手术组(P<0.05);神经干细胞移植组的寻找平台时间显著短于模型组,穿越平台次数显著大于模型组(P<0.05)。结果表明神经干细胞可以在大鼠脑内存活并发生迁移,显著改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力,相关机制可能与海马胆碱能神经元分化和生长有关。

去卵巢、去松果体对大鼠学习记忆及海马胆碱能神经的影响

目的 探讨雌激素 (E)、褪黑素 (MT)缺乏对大鼠学习记忆及海马胆碱能纤维密度的影响。方法 用Y型迷宫测试淘汰学习记忆障碍大鼠 ,将学习正常大鼠分为正常、假去卵巢 (假OVX)、OVX、假去松果体 (假PX)、PX、假OVX +假PX、OVX +PX 7组。 90d后再行Y型迷宫测试 ,乙酰胆碱酯酶 (AChE)组织化学检测海马CA1 4区AChE。结果 大鼠学习记忆能力及AchE阳性纤维密度在正常、假手术各组间无显著差别 ,在OVX、PX、OVX +PX组间依次显著降低 ,三组均比正常及假手术各组显著降低。结论 OVX、PX可使大鼠学习记忆及海马胆碱能纤维密度降低。PX作用大于OVX ,联合作用大于单独作用。

利拉鲁肽对糖尿病前期大鼠胰岛海马胆碱能神经刺激肽前体蛋白的影响

目的明确利拉鲁肽对糖尿病前期OLETF大鼠的阻抑作用,观察对胰腺海马胆碱能神经刺激肽前体蛋白(hippocampal cholinergicneurostimulating peptide precursor protein,HCNP-pp)的影响。方法检测空腹及餐后2小时血糖,将处于糖耐量减低阶段12～14周龄OLETF大鼠随机分为3组,安慰剂组(PBO组)、100μg/kg利拉鲁肽处理组(L-100组)、200μg/kg利拉鲁肽处理组(L-200组),LETO大鼠为阴性对照组(LETO组)。12周后检测大鼠体重、空腹血糖、餐后2 h血糖和胰岛素,以免疫组织化学染色分析胰岛细胞形态学变化,应用蛋白印迹技术检测HCNP-pp及胰高血糖素样多肽-1受体(GLP-1R)蛋白含量;应用实时定量PCR检测HCNP-pp和LGP-1R、胆碱乙酰转移酶(ChAT)、3型毒蕈碱样受体(M3R)基因表达水平。结果PBO组OLETF大鼠空腹、餐后2 h血糖符合糖尿病诊断标准,而L-100组、L-200组及LETO组大鼠均未进展为糖尿病状态。PBO组OLETF大鼠体重及空腹胰岛素均明显高于L-100组、L-200组和LETO组(P<0.01)。与PBO组相比,L-200组、LETO组大鼠胰腺胰岛素阳性细胞表达密度明显增多(P<0.01),而与L-100组差别无统计学意义(P>0.05);L-100组、L-200组及LEITO组大鼠胰腺HCNP-pp蛋白相对含量明显减少(P<0.05或P<0.01);L-100组、L-200组及LEITO组大鼠胰腺GLP-1R蛋白相对含量明显增多(P<0.01);L-100组、L-200组和LETO组大鼠胰腺HCNP-pp mRNA水平明显下降(P<0.01);L-200组和LETO组大鼠胰GLP-1R,ChAT、M3R mRNA水平均明显增多(P<0.01);L-100组大鼠GLP-1R和ChAT mRNA水平均明显增多(P<0.01),而M3R mRNA水平则无变化(P>0.05)。结论利拉鲁肽可阻抑糖尿病前期进展,可能与胰腺HCNP-pp表达下降、GLP-1R表达增高及胰岛β细胞密度增加相关。利拉鲁肽改善胰岛素分泌状态,可能与胰腺HCNP增多、ChAT和M3R表达增高相关。

海马胆碱能神经刺激肽通过活化3型毒蕈碱受体促进INS-1细胞胰岛素释放

目的明确海马胆碱能神经刺激肽(HCNP)对INS-1细胞胰岛素分泌影响,并对其可能作用的毒蕈碱样胆碱能受体途径进行分析。方法 INS-1细胞随机分为3组:对照组、HCNP组、HCNP+佛波酯(PMA)组。对照组给予RPMI 1640液培养,HCNP组给予人工合成HCNP(50 pg/ml)与RPMI 1640液共培养,HCNP+PMA组予人工合成HCNP与RPMI 1640液共培养后,行胰岛素释放前18 h加入PMA(10 nmol/L);应用放射免疫方法检测各组不同浓度葡萄糖培养液中胰岛素含量。实时定量PCR检测对照组、HCNP组HCNP前体蛋白(HCNP-pp)、胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,ChAT)、3型毒蕈碱样受体(3-typemuscarinic receptor,M3R)基因水平表达情况。结果浓度为3.3 mmol/L葡萄糖,三组间胰岛素含量无明显差异。浓度为5.6mmol/L、16.7 mmol/L葡萄糖作用下,HCNP组胰岛素含量均高于对照、HCNP+PMA组,差异具有统计学意义。HCNP组INS-1细胞HCNP-pp、ChAT、M3R三者mRNA含量均高于对照组,差异具有统计学意义。结论 HCNP通过提高ChAT活性,推测影响乙酰胆碱合成,进一步活化M3R,促进胰岛素分泌,PMA可阻断此作用。

海马胆碱能神经元刺激肽促进海马胆碱能神经元再生的研究

目的:探讨海马胆碱能神经元刺激肽(HCNP)对切割穹窿海马伞后海马胆碱能神经元的促进作用。方法:36只SD大鼠随机分成两组,切割右侧穹窿海马伞后,术后连续5d腹腔注射BrdU,经侧脑室分别注射HCNP和人工脑脊液(ACSF),每3天1次,共6次。切割术前、术后及治疗术后行Morris水迷宫行为学测试;术后第35天,灌注取脑行溴脱氧尿苷(5-BrdU)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)免疫荧光检测;提取总RNA,RT-PCR检测ChAT mRNA表达量;提取总蛋白,Western blot检测ChAT蛋白表达。结果:切割穹窿海马伞后,两组大鼠平均逃避潜伏期(AEL)均明显增加,记忆力下降,经过治疗后,实验组大鼠AEL显著缩短,对照组无改善,两组AEL有显著性差异(P<0.05);HCNP组海马齿状回颗粒下层可见较多BrdU阳性细胞及海马ChAT阳性神经元,ACSF组仅见少量BrdU阳性细胞,未见ChAT阳性神经元;RT-PCR结果显示,HCNP组ChAT mRNA约为ACSF组2倍(P<0.01);Western blot结果表明,实验组ChAT蛋白相对表达量为0.412±0.018、对照组为0.218±0.017,实验组明显高于对照组,二者存在显著性差异(P<0.01)。结论:HCNP可促进海马齿状回颗粒下层神经干细胞的增殖及其向胆碱能神经元分化。

去卵巢大鼠海马及额叶皮层海马胆碱能神经刺激肽含量的变化

目的观察雌激素缺乏对大鼠海马CA1/CA2区及额叶皮层海马胆碱能神经刺激肽(HCNP)含量的影响。方法选取清洁级4月龄雌性SD大鼠30只,随机分为3组:假手术组(Sham组)、去卵巢组(OVX组)和去卵巢加雌二醇(E2)组(OVX+E2组),每组10只。除Sham组做假性手术外,其余2组均行双侧卵巢切除术;OVX+E2组去卵巢手术10d后给予E2皮下注射,100μg/kg,隔日1次。去卵巢手术后常规喂养4个月,获取组织标本,用于组织蛋白和组织总RNA的提取。用Western印迹法测定大鼠海马和皮层C-HCNPpp、N-HCNPpp的相对含量。用RT-PCR技术检测HCNPpp mRNA水平。结果OVX组大鼠海马和皮层中C-HCNPpp的相对含量较Sham组和OVX+E2组明显升高(P<0.05),而Sham组和OVX+E2组之间无显著差别(P>0.05),三组大鼠之间的海马和皮层中N-HCNPpp的相对含量差异不显著(P<0.05);OVX组和OVX+E2组大鼠HCNPpp mRNA表达与Sham组无显著差异(P>0.05),OVX+E2组大鼠HCNPpp mRNA表达与OVX组相比增高(P<0.05);三组大鼠皮层HCNPpp mRNA表达无显著差异(P>0.05)。结论雌激素缺乏可导致大鼠海马CA1/CA2区及额叶皮层HCNP的增多。

HCNP与海马提取液对神经干细胞向胆碱能神经元分化的协同作用

目的:探讨海马胆碱能神经元刺激肽(hippocampal cholinergic neurostimulating peptide,HCNP)与海马提取液对海马神经干细胞向神经元及胆碱能神经元分化的协同作用。方法:取孕17 d SD大鼠海马组织进行神经干细胞的培养、增殖、传代,并将其接种于2块24孔板中,培养基中均含B27、微量脑源性神经营养因子(BD-NF),将培养孔分为6组:H+T组,加入HCNP和切割穹窿海马伞侧海马提取液;H+N组,加入HCNP和正常侧海马提取液;H组,加入HCNP;T组,加入切割穹窿海马伞侧海马提取液;N组,加入正常侧海马提取液;对照组,不加HCNP和海马提取液。分化14 d后行MAP-2/ChAT免疫荧光双标检测。结果:与其它各组相比,H+T组分化的MAP-2阳性神经元最多,ChAT/MAP-2双标阳性神经元占MAP-2阳性神经元的比例最高(P<0.05);与N组相比,H+N组MAP-2阳性神经元较多,ChAT/MAP-2双标阳性神经元占MAP-2阳性神经元的比例也较高(P<0.05);与对照组相比,H组T组均可见一定数量的MAP-2阳性神经元及ChAT/MAP-2双标阳性神经元(P<0.05);N组以及对照组中MAP-2阳性神经元的数量和ChAT/MAP-2双标阳性神经元占MAP-2阳性神经元的比例则最低。结论:在微量BDNF存在的情况下,HCNP可促进海马神经干细胞向神经元和胆碱能神经元分化,切割侧海马提取液与HCNP可发挥协同作用。

盐酸吡格列酮通过提高海马区HCNP含量改善2型糖尿病大鼠学习记忆能力

目的探讨盐酸吡格列酮通过提高海马区海马胆碱能神经刺激肽（HCNP）含量，对改善2型糖尿病模型大鼠空间记忆能力的作用及其机制。方法12周龄雄性SD大鼠按照随机数字表法分为对照组、2型糖尿病组（DM组）、2型糖尿病＋盐酸吡格列酮组（DP组），每组12只。对照组大鼠普通饲料喂养，DM组大鼠给予高脂饮食，DP组大鼠高脂饮食20周基础上给予盐酸吡格列酮10mg／（kg·d）干预8周，每日1次灌胃给药。对照组、DM组同期2mL生理盐水灌胃。采用水迷宫实验检测3组大鼠空间记忆能力：Westernblotting法检测3组大鼠海马组织中HNCP前体蛋白（HCNP．PP）含量（以此反映HCNP蛋白含量）；逆转录PCR方法检测HCNP—PP、胆碱乙酰基转移酶（CHAT）、1型毒蕈碱样受体（M1R）、α7型烟碱样受体（αTNR）mRNA表达水平。结果（1）DM组大鼠逃避潜伏期延长，与对照组、DP组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。（2）与对照组和DP组相比，DM组大鼠海马HNCP-PP蛋白含量及mRNA相对水平升高，HNCP蛋白含量减少，ChAT、M．R及α7NRmRNA相对含量均下降，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论盐酸吡咯列酮通过促进HCNP—PP裂解致HCNP增多．进一步作用于相关胆碱能神经受体，以此改善2型糖尿病模型老年大鼠空间记忆能力。