葛根素对大鼠海马CA1区锥体细胞L-型钙通道的影响

目的:观察不同浓度葛根素对大鼠海马CA1区锥体细胞L型钙离子通道的作用。方法:采用酶加机械分离的方法,急性分离出成年大鼠海马CA1区锥体细胞后,将含有锥体细胞的细胞悬液滴加于盖玻片上,待贴壁后选取符合实验条件的细胞,运用膜片钳单通道技术记录同一钳制电压下离子通道活动情况。结果:低浓度葛根素(1.2,2.4mmol·L-1)对L型钙离子通道的活动无明显影响;浓度达到4.8,9.6mmol·L-1时,L型钙离子通道平均开放时间由对照组的11.773±4.838ms分别减少到7.948±2.513ms和4.533±0.828ms(P<0.05),浓度进一步增加到19.2mmol·L-1时,通道平均开放时间降至3.042±0.792ms(P<0.05)。当葛根素达到一定浓度(4.8,9.6mmol·L-1)时,通道开放概率由对照组的0.0011±0.0001分别减小到0.00053±0.00018和0.00032±0.00013(P<0.05),随着浓度的进一步增加(19.2mmol·L-1),开放概率降至0.00021±0.00009(P<0.05)。总体而言,葛根素可以抑制单个大鼠海马CA1区锥体细胞L型钙离子通道活动,减少通道开放时间,降低通道开放概率。结论:葛根素可以抑制大鼠海马CA1区锥体细胞L型钙离子通道,减少通道开放时间,降低通道开放概率,并成浓度依赖性。提示临床上葛根素治疗缺血性中风可能与其抑制神经细胞L型钙离子通道的开放,防止钙超载有关。

成年大鼠海马CA1区锥体细胞K_(ATP)通道的特性

为了解成年大鼠海马CA1区锥体细胞KATP 通道的特性 ,实验采用膜片钳技术的内面向外式记录法 ,在急性分离的CA1区锥体神经元上 ,研究了可被胞浆侧ATP所抑制的钾离子单通道的特性。当细胞膜内外两侧的K+浓度均为 14 0mmol/L时 ,通道的电导为 63pS ,翻转电位为 1 71mV ,通道呈弱内向整流性。在负钳制电位时 ,通道开放时常被短时程的关闭所打断 ,而在正钳制电位时 ,这种短时程的关闭状态明显少于负钳制电位时。但通道开放概率未见明显的电压依赖性。ATP对通道活动的抑制作用呈浓度依赖性 ,抑制通道活动 5 0 %的ATP浓度为 0 1mmol/L。KATP 通道的特异性阻断剂tolbutamide (甲糖宁 ,1mmol/L)可完全阻断通道的活动 ,而KATP 通道开放剂diazoxide (二氮嗪 ,1mmol/L)则不增强通道的活动。

微管细胞骨架在小鼠脑缺血/再灌注超急性期海马CA1区组织中的表达及意义

为探讨微管细胞骨架在小鼠脑缺血/再灌注(I/R)超急性期(6、12、24 h)海马CA1区神经元中的变化情况,初步阐明微管细胞骨架对早期脑缺血/再灌注损伤的影响,将96只8周龄健康雄性ICR小鼠随机分为假手术组(24只)和I/R组(72只), I/R组通过Longa改良线栓法制备小鼠左侧大脑中动脉栓塞模型,采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色评估各组小鼠脑缺血梗死体积,采用尼氏(Nissl)、Fluoro-Jade C (F-JC)和Neun染色检测各组小鼠海马CA1区神经元死亡情况,应用IF染色和Western blot试验检测小鼠海马CA1区微管细胞骨架相关蛋白α-tubulin、β-tubulin、acetyl-tubulin、β-tubulinⅢ和MAP2蛋白的表达水平。结果表明:与假手术组相比,I/R组在6、12、24 h时小鼠脑缺血梗死面积百分比明显增大(P<0.05),随再灌注时间和延长,脑缺血梗死面积百分比逐渐增大。Nissl、F-JC和Neun染色结果显示,I/R组在6、12、24 h时小鼠神经元随再灌注时间的延长,神经元损伤加重且存活数逐渐减少(P<0.05)。而免疫荧光染色结果表明,与假手术组相比,I/R组在6、12、24 h时小鼠海马CA1区微管细胞骨架相关蛋白β-tubulin、acetyl-tubulin、β-tubulinⅢ和MAP2表达水平明显下降(P<0.05)。综上,在小鼠I/R超急性期,微管细胞骨架相关蛋白随时间的延长,呈先缓慢后快速降解的趋势,且微管解聚进程与神经元死亡进程呈正相关,其微管细胞骨架参与早期I/R损伤进程。

硫辛酸对海马CA_1区锥体细胞凋亡的抑制作用

采用股动脉放血并双侧颈总动脉夹闭制作全脑缺血再灌注模型 ,于术后 1 d处死动物 ,取脑 ,制作石蜡切片 ,通过 HE染色、Tunel检测 ,以观察海马 CA1区锥体细胞的损伤形式 ,并探讨α-硫辛酸 (α-lipoic acid,L A)对实验性脑缺血再灌注的神经保护作用。结果表明 :在短暂性全脑缺血中 ,海马锥体细胞存在着凋亡和坏死两种死亡形式 ;与对照组相比 ,缺血再灌注后1 d,海马 CA1区损伤较重 ,出现了较多的凋亡细胞 ,而 L A可明显抑制锥体细胞的凋亡。实验证明 :在脑缺血再灌注损伤中 ,细胞凋亡是神经元死亡的一种重要形式 ;L

短暂脑缺血大鼠海马CA1区锥体细胞大电导Ca^(2+)依赖K^+通道活动降低(英文)

短暂脑缺血可对随后的损伤性脑缺血表现出明显的耐受 .有研究表明大电导Ca2 + 依赖K+ (BKCa)通道活动增强参与了缺血性脑损伤 .采用膜片钳的内面向外式 ,观察了 3min短暂脑缺血后 6h、 2 4h以及 4 8h大鼠海马CA1区锥体细胞上BKCa通道活动的动态变化 .短暂脑缺血后BKCa通道的单通道电导和翻转电位均未见明显变化 ,但通道的开放概率则在缺血预处理后的前 2 4h内显著降低 .通道动力学分析显示通道关闭时间变长是短暂脑缺血后通道活动降低的主要原因 ,因为通道的开放时间未发生明显变化 .

衰老与海马CA1区锥体细胞退行性变及自由基和空间记忆的关系

目的:研究衰老大鼠记忆行为、自由基含量和CA1区细胞超微结构的特征以及衰老所致记忆减退的神经生物学机制。方法:雄性SD大鼠40只,青年和老年组各20只。应用Morris水迷宫测量大鼠空间记忆水平,分光光度计测量海马组织蛋白质的含量;巴比妥酸还原法测定海马脂质过氧化物含量;透射电镜观察海马CA1区锥体细胞的形态;体视学分析细胞内粗面内质网和线粒体的面数密度。结果:较之青年大鼠,衰老大鼠寻找平台的潜伏期延长(38与12s,t=8.04,P<0.01);跨平台次数的百分比减少(50%与82%,t=10.17,P<0.05)。海马脂质过氧化物(146.2与178.4nmol/g,t=5.61,P<0.01)、组织总蛋白(127.9与168.8μg比较,t=8.25,P<0.01)和非水溶性蛋白(21.1与34.3μg比较,t=9.53,P<0.01)的含量增高;海马CA1区250μm锥体细胞的数量(51.9与40.7个比较,t=6.55,P<0.01)、核仁体积(5.34与4.02μm3,t=7.71,P<0.01)、粗面内质网面密度(1.47与0.94μm2/μm3,t=6.55,P<0.01)减少。结论:海马CA1区锥体细胞的退行性变化是衰老致记忆减退的原因之一,而过量的脂质过氧化物可能是导致锥体细胞变性的原因。

大鼠全脑缺血再灌流后海马CA1区锥体细胞超微结构的改变

目的观察大鼠全脑缺血再灌流后，CA1区锥体细胞超微结构的变化。方法通过四血管闭塞法全脑缺血模型，采用光、电镜观察了全脑缺血15min再灌流后锥体细胞病理形态学改变及超微结构的变化。结果全脑缺血再灌流48h后CA1区发生了迟发性神经元死亡（DND），锥体细胞超微结构出现了凋亡样改变，同时也观察到部分锥体细胞胞浆出现类似坏死的空泡化现象。结论提示调亡与坏死机制可能共同参与全脑缺血再池流后DND。

谷氨酸对大鼠海马CA_1区锥体细胞电压依赖性Na^+电流的影响

本实验采用全细胞膜片钳技术，观察了谷氨酸对急性分离的海马ＣＡ_１区神经元的电压依赖性ＮＡ~＋通道的影响， 结果发现谷氨酸对电压依赖性Ｎａ~＋电流有明显抑制作用，其抑制方式呈电压依赖性、浓度依赖性和时间依赖性，表明 谷氨酸对电压依赖性钠通道有抑制作用。

金属硫蛋白对海马CA_1区锥体细胞凋亡的抑制作用

采用股动脉放血并双侧颈总动脉夹闭制作全脑缺血再灌注模型 ,于术后 1d处死动物 ,取脑 ,制作石腊切片 ,通过 HE染色、Tunel检测 ,对海马 CA1 区锥体细胞形态进行了观察。结果表明 :在短暂性全脑缺血中 ,海马锥体细胞存在着凋亡和坏死 2种死亡形式 ;与对照组相比 ,缺血再灌注后 1d,海马 CA1 区损伤较重 ,出现了较多的凋亡细胞 ,而MT- 1可明显抑制锥体细胞的凋亡。本试验证明 :在脑缺血再灌注损伤中 ,细胞凋亡是神经元死亡的一种重要形式 ;MT-

海马CA_1区锥体细胞内钙离子释放与突触传递的可塑性

为分析海马CA1区锥体细胞内钙离子释放与突触传递长时程增强以及长时程抑制的关系,采用全细胞膜片钳和细胞内钙成像技术,观察了不同参数的突触前刺激引起大鼠海马锥体细胞内钙离子释放的状况。结果为:100Hz、50Hz、20Hz频率,分别用50、25、15、10、5脉冲的突触前刺激均可引起锥体细胞内钙的释放,10脉冲以上的刺激引起细胞内钙释放的成功率为100％,而5脉冲的刺激引起细胞内钙的释放率为57％。100 Hz 3脉冲的刺激可引起少数锥体细胞内钙释放,而5 Hz各脉冲的刺激均不能引起锥体细胞内钙的释放。结果提示,长时程抑制时细胞内钙的升高并非来自于细胞内钙库的钙释放;引起长时程增强的刺激参数与引起锥体细胞内钙释放的参数相似。本文又分析了两者的异同处。

葛根素对大鼠海马CA1区锥体细胞L-型钙通道的影响

目的观察不同浓度葛根素对大鼠海马CA1区锥体细胞L-型钙离子通道的作用。方法采用酶加机械分离法,急性分离出成年大鼠海马CA1区锥体细胞后,将含有锥体细胞的细胞悬液滴加于盖玻片上,待贴壁后选取符合实验条件的细胞,运用膜片钳单通道技术记录同一钳制电压下离子通道活动情况。结果低浓度葛根素(1.2mmol/L、2.4mmol/L)对L-型钙离子通道的活动无明显影响;浓度达到4.8mmol/L、9.6mmol/L时,L-型钙离子通道平均开放时间对照组由(11.77±4.84)ms缩短到(7.95±2.51)ms和(4.53±0.83)ms(P<0.05),浓度进一步增加到19.2mmol/L时,通道开放时间降至(3.042±0.792)ms。当葛根素达到一定浓度(4.8mmol/L,9.6mmol/L)时,通道开放概率对照组由(1.1×10-3±1.0×10-4)%降低到(5.3×10-4±1.8×10-4)%和(3.2×10-4±1.3×10-4)%,随着浓度的进一步增加(19.2mmol/L),开放概率降至(2.1×10-3±9.0×10-5)%。结论葛根素可以抑制单个大鼠海马CA1区锥体细胞L-型钙离子通道活动,减少通道开放时间,降低通道开放概率。

N-methyl-D-aspartate受体阻断剂MK801对离体海马脑片CA1区锥体细胞缺氧期间电生理的影响

目的 应用细胞内记录技术 ,研究 N- methyl- D- aspartate(NMDA)受体阻断剂 MK80 1对离体海马脑片 CA1区锥体细胞缺氧期间电生理的影响。方法 成年雄性 SD大鼠海马脑片随机分为单纯缺氧组 (Con组 ,n=1 0 )和 MK80 1组 (M组 ,n=1 0 )。Con组海马脑片给予 1 0分钟缺氧 ;而 M组的海马脑片在缺氧前 1 0分钟及 1 0分钟的缺氧期间分别应用 1 0 0 μmol/ L 的 MK80 1。所有脑片均给予 6 0分钟的复氧。应用细胞内记录技术记录海马 CA1区神经元缓慢去极化及快速去极化的时间、快速去极化的幅度。在复氧末 ,应用细胞内注入电流及经 Schaffer通路刺激 ,观察神经元对刺激的反应。结果 Con组海马 CA1区锥体神经元缓慢去极化速率为 (0 .2 2± 0 .0 5 ) m V/ s,显著高于 M组的 (0 .0 8± 0 .0 3) m V/ s (P<0 .0 5 ) ;NMDA受体阻断剂 MK80 1可以显著延迟神经元的快速去极化的时间 ,M组神经元的快速去极化时间为 (5 37± 1 39) s,显著高于 Con组的 (2 6 1± 2 6 ) s (P<0 .0 5 ) ;M组 CA1区神经元的快速去极化幅度为 (4± 1 3) m V,显著小于 Con组的 (5 3± 7) m V(P<0 .0 5 )。在复氧末 ,M组的 1 0例神经元中 ,9例神经元恢复对刺激的反应。结论 NMDA受体阻断剂可显著减轻神经元的缺氧性损伤 ,促进复氧后神经元功?

急、慢性铅中毒对海马CA1区长时程增强和活化的细胞外信号调节激酶2影响

目的 探讨急、慢性铅中毒对大鼠海马活化的细胞外信号调节激酶 2 (ERK2 )含量的影响及其与海马CA1区长时程增强 (LTP)的关系。方法 大鼠怀孕后分别饮用蒸馏水或 0 .2 %醋酸铅溶液 ,断乳后鼠仔则直接饮用 ,于 30d后测定LTP ,并取海马作为慢性铅中毒标本测定ERK2含量。正常 30d大鼠海马片稳定培养 2h后 ,分别用含或不含 2 0 μmol·L-1 醋酸铅的人工脑脊液孵育 ,不同时间点收集 ,作为急性铅中毒标本测定ERK2含量。用Western印迹法测定标本活化的ERK2含量。结果 高频刺激后对照组和慢性铅中毒组峰电位分别为刺激前的1 85 %和 88% ;慢性铅中毒组活化的ERK2则比对照组降低了 46 %。海马片培养中 ,对照组活化的ERK2含量基本保持不变 ,铅中毒组在 30和 60min时分别下降了 68%和 33% ,1 2 0min后恢复到正常水平。

促红细胞生成素对大鼠脑缺血海马CA_1区神经元凋亡和细胞色素C释放的影响

目的 探讨促红细胞生成素 (Erythropoietin ,EPO)的神经保护机制。方法 采用 4 VO法制作大鼠全脑缺血模型。将SD大鼠随机分为假手术组、生理盐水组、EPO组。全脑缺血前 3h ,EPO组大鼠脑室立体定向注射重组人促红细胞生成素 (recombinantHumanErythropoietin ,rHuEPO) ,生理盐水组则给予生理盐水 ,假手术组只进行假手术处理。观察缺血后 2 4h海马CA1区细胞色素C(CytochromeC ,CytC)的变化 ,及缺血后 72h海马CA1区细胞凋亡情况。结果 EPO组海马CA1区呈现点状分布的CytC表达较生理盐水组增强 (P <0 .0 1) ,并且较生理盐水组呈现较少的凋亡细胞 (P <0 .0 1)。结论 EPO预处理可以抑制海马CA1区CytC从线粒体向胞浆释放及减少神经元凋亡。

大鼠脑缺血再灌注后海马CA1区Caspase-3的表达及细胞凋亡的动态变化

目的观察大鼠脑缺血再灌注后海马CA1区神经元Caspase-3的表达及细胞凋亡指数的动态变化。方法将大鼠随机分为假手术组、模型组。模型组又分为脑缺血再灌注后0,0.5,2,6,24,72,120 h 7个亚组。采用4-VO阻断法制备大鼠脑缺血再灌注模型,用免疫组织化学染色法及原位细胞凋亡检测法(TUNEL染色)分别观察大脑海马CA1区神经元Caspase-3的表达及细胞凋亡指数。结果假手术组海马CA1区神经元Caspase-3蛋白有少量表达。和假手术组相比,模型组大鼠在脑缺血再灌注后0 h、0.5 h海马CA1区神经元Caspase-3表达无明显变化(P>0.05),再灌注后2 h开始升高(P<0.05)、24 h达高峰(P<0.05),之后逐渐下降,再灌注后120 h仍高于假手术组(P<0.05)。细胞凋亡指数的变化趋势与Caspase-3的表达变化相一致。结论脑缺血再灌注可诱导凋亡相关蛋白Caspase-3的表达,进而导致细胞凋亡。细胞凋亡在脑缺血再灌流损伤中呈动态过程,是神经细胞死亡的重要形式。

葛根素对大鼠脑复苏后海马CA1区神经细胞凋亡相关基因的影响(英文)

背景:Fas及 P53是重要的促进凋亡的调控基因,属于肿瘤坏死因子 /神经生长因子受体家族,其表达产物具有传递凋亡信号的作用,可调控脑缺血再灌注损伤时细胞的凋亡,而葛根素则能够减轻细胞的凋亡程度。目的:观察葛根素对大鼠脑复苏后海马 CA1区神经细胞凋亡相关基因Fas及 P53的影响。设计:随机对照实验。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊科。材料:实验于 2001-09/2002-02在华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊科实验室完成。选取清洁级 3个月龄 W istar大鼠 45只,随机分为假手术组、模型对照组、葛根素治疗组,15只 /组。方法:葛根素治疗组及模型对照组建立大鼠急性全脑缺血再灌注模型。假手术组只分离第一颈椎两侧翼小孔,但不电凝两侧椎动脉,只分离两侧颈总动脉,但不夹闭之。葛根素治疗组于缺血前 1h 给予葛根素注射液 100m g/kg,模型对照组给予等量生理盐水,假手术组不给药。各组大鼠分别于脑缺血再灌注后 3,6,12,24,48h 即速处死,每次每组 3只。分离海马组织,制备组织切片,利用免疫组化法、原位末端标记法检测各组大鼠脑缺血再灌注后不同时间点 Fas及 P53蛋白表达的水平及凋亡细胞数的变化。主要观察指标:①各组脑缺血再灌注后不同时间点海马 CA1区 Fas及P53蛋白表达的阳性细胞数。②各组脑缺血再灌注后不同时间点海马CA1区凋亡细胞数的比较。结果:实验纳入大鼠 45只,全部进入结果分析。①各组脑缺血再灌注后不同时间点海马 CA1区 Fas蛋白表达的阳性细胞数:假手术组未见明显Fas 基因表达。与模型对照组比较,葛根素治疗组于脑缺血再灌注后各时间点均明显降低,6,12,24,48h 时差异显著 [(15.0±4.3),(13.5±4.9);(40.7±3.4),(27.2±3.1);(37.0±4.8),(22.0±2.1);(24.7±4.1),(18.9±5.3)个 /m m ;P <0.05,P <0.01]。②各组脑缺血再灌注后不同时间点海马 CA1区P53蛋白表达的阳性细胞数:假手术组未见明显 P53基因表达。与模型对照组比较,葛根素治疗组于脑缺血再灌注后 24,48h 均明显降低[(25.3±4.4),(12.8±2.7);(24.3±3.6),(10.9±3.0)个 /m m ;P <0.01]。③各组脑缺血再灌注后不同时间点海马 CA1区凋亡细胞数的比较:与模型对照组比较,葛根素治疗组于脑缺血再灌注后 12,24,48h 均明显降低[(34.0±3.7),(21.0±3.7);(41.0±4.2),(33.0±4.8);(71.0±5.5),(41.0±3.4)个 /m m ;P <0.01]。结论:给予葛根素治疗的大鼠缺血再灌注 6～48h 时 Fas的表达显著降低,缺血再灌注 24～48h 时 P53的表达亦明显减少,且凋亡细胞数也呈下降趋势,进一步证实葛根素的脑保护作用,提示葛根素抑制脑复苏后的细胞凋亡可能与其减少促凋亡基因 Fas及 P53蛋白表达有关。

小鼠颞叶缺血再灌注后海马CA1区细胞凋亡及行为学实验研究

目的探讨颞叶海马CA1区神经细胞凋亡在全脑缺血再灌流不同时间的变化规律及行为学改变。方法在小鼠双侧颈总动脉阻断再灌流后1、3、7d及2、4、6周取海马CA1区脑组织,采用原位末端标记,流式细胞仪对凋亡细胞进行定性、定量分析,并进行行为学(包括卒中指数及神经病学症状)评分。结果实验组术后第1天卒中指数及神经病学评分明显高于对照组(P<0.05),细胞凋亡存在于正常颞叶CA1区神经细胞中,在缺血再灌流1d后,神经细胞凋亡开始增加,3d达最高峰,与对照组存在明显差异(P<0.01)。结论细胞凋亡存在于正常颞叶CA1区神经细胞内,细胞凋亡是缺血再灌流后颞叶CA1区神经细胞主要死亡形式。

促红细胞生成素对血管性痴呆大鼠海马CA1区胆碱乙酰转移酶的影响

目的探讨促红细胞生成素(EPO)对血管性痴呆(VaD)大鼠海马CA1区胆碱乙酰转移酶(ChAT)的影响。方法将经行为学筛选合格的Wistar大鼠随机分为假手术组(Sham组)、VaD组、EPO侧脑室注射+VaD组(E1组)和EPO腹部皮下注射+VaD组(E2组),采用永久性结扎双侧颈总动脉的方法建立VaD模型。通过免疫组织化学和RT-PCR方法检测VaD大鼠海马CA1区ChAT蛋白含量以及ChAT mRNA表达水平的变化。结果 EPO能明显改善VaD大鼠认知功能障碍,上调海马CA1区ChAT表达。结论 EPO可能通过增加VaD大鼠海马区ChAT表达改善其认知功能障碍。