鉴别差异表达基因的新方法──抑制消减杂交法(SSH)

抑制消减杂交法（SuppressicSubtractiveHybridization，SSH）是最近（1996）报道的能有效鉴别两个不同细胞群差异表达基因的新方法［1，2］。该方法是以抑制PCR和消减杂交法为基础，在一轮反应中实现mRNA的均等化和消减步骤。本文对SSH法的原理、优缺点作了介绍，并与其它检测差异表达基因的方法，如mRNA差别显示法（DDRT－PCR）、代表性序列差异分析（RDA）比较，认为SSH方法具有高效快速、高敏感性和假阳性低等优点。同时，625个克隆中有很大一部分是转录物丰度很低的基因，40％的克隆可能为新的基因。因此，SSH可作为鉴别差异表达基因和克隆新基因的有效方法。

抑制性消减杂交在生物基因克隆中的应用

抑制性消减杂交(SSH)是抑制PCR与消减杂交技术相结合,能对未知序列差异表达基因克隆的一种方法。该方法具有速度快、效率高、假阳性率低、目的序列富集程度高、实验结果复杂程度低等特点。本文主要介绍其基本原理、操作过程、优缺点、在生物基因克隆中的应用,并对其应用前景进行了分析。

应用抑制性消减杂交在阴道毛滴虫筛选热卡限制相关差异表达基因(英文)

热卡限制能使众多实验动物的寿命延长,而且它是唯一延缓哺乳动物衰老的途径。我们用原生动物阴道毛滴虫建立了热卡限制模型。在此研究体系中,该原生动物细胞周期在热卡限制的培养条件下较糖充足的培养条件下延长80%。本研究运用抑制性消减杂交的方法,以期筛选在两种培养条件下差异表达的基因,并从2个cDNA消减杂交文库中分离到15个克隆。经序列分析表明,有9个未知基因,6个已知基因。

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因

应用抑制性消减杂技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCV核心蛋白反式激活相关基因。以HCV核心表达质粒 pcDNA3 1( ) core转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1( )为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,从中提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成 2组 ,分别与 2种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行 2次消减杂交及 2次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果显示 ,成功构建人HCV核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到 2 33个白色克隆 ,进行菌落PCR分析 ,其中 2 13个均得到 10 0～ 10 0 0bp插入片段。挑取 6 3个插入片段测序分析 ,其中 6个cDNA片段为未知序列 ,通过生物信息学分析获得其全长序列 ,已被GenBank收录。提示 6个新的cDNA全长序列 ,可能是HCV核心蛋白反式激活靶基因。

利用抑制消减杂交技术筛选猪蛔虫性别差异表达基因

为了筛选线虫的性别特异性基因,为线虫乃至寄生虫的性别控制提供新的工具,本研究选择猪蛔虫(Ascarissuum)为模型,分别提取雌性和雄性成虫的mRNA后,采用Clontech公司的PCR-selectTM试剂盒进行反转录合成cDNA并进行抑制消减杂交(SSH),构建猪蛔虫雌、雄虫性别差异表达的消减cDNA文库,并采用地高辛(DIG)标记的cDNA探针进行Southern杂交检验所构建文库的消减效率。结果表明,雌、雄虫性别差异表达的消减cDNA文库均具有很强的性别特异性。随机从各库中各抽取25个克隆进行测序及在线BLAST分析,发现在25个雄虫ESTs中有20个已知ESTs,5个新的ESTs;25个雌虫ESTs中有11个已知ESTs,还有8个可能为新基因。猪蛔虫性别差异表达的消减cDNA文库的成功构建,为进一步研究性别特异基因的功能奠定了基础。

抑制消减杂交技术在鲤鱼抗寒研究中的应用

用抑制性消减杂交技术（SSH）研究与鲤鱼（Cyprinus carpio）抗寒性状相关的基因。通过对荷包红鲤抗寒品系（Cyprinus carpio wuyanensis Tchang）和柏氏鲤（Cyprinus pellegnini Tchang）杂交F2代进行降温诱导实验，获得不同温度下的实验材料。利用抑制消减杂交技术构建了一个低温下差异表达基因的消减cDNA文库，共含有2000个克降。对其叶1480个克隆进行斑点杂交筛选，共得到60个阳性克隆，选取其中29个克隆测序。通过序列分析比对，13个克隆与已知基因序列高度同源，同源性为85％-98％；另外的13个克隆为未知新基因序列。在13个同源性较高的克隆序列巾，有brevican基因、AMP—acid连接酶、CFL2基因、催产素基因、主要组织兼容复合体（MHC）Ⅱβ链、锌指蛋白、细胞色素氧化酶、EPD-1基因、透明质酸结合蛋白多糖类、核受体／类视色素信号调节器等，其中9个基因上调表达，另有4个则抑制表达。这些基因的获得可为研究鱼类抗寒性状以及从分子水平上阐明其机制提供重要依据。

基于PCR的消减杂交法克隆脑胶质瘤肿瘤相关基因和抑癌基因

背景与目的:脑胶质瘤是神经系统常见肿瘤,其发病机制尚不清楚。本研究运用基于PCR的消减杂交法克隆脑胶质瘤肿瘤相关基因和抑癌候选基因,并探讨胶质瘤的分子生物学发病机制。方法:从人脑胶质瘤组织标本中提取mRNA,反转录成cDNA,然后采用基于PCR的消减杂交法克隆脑胶质瘤肿瘤相关基因和抑癌基因。结果:在肿瘤相关候选基因组克隆到人星形细胞内富含的磷酸蛋白PEA15(phosphoproteinenrichedinastrocytesof15)和酸性纤维蛋白生长因子(acidfibroblastgrowthfactor,aFGF)同源物等基因,在抑癌候选基因组克隆到干扰素诱导蛋白17和ndr2等。ndr2在正常脑组织中广泛表达,在胶质瘤组织内无表达。结论:ndr2基因是抑癌候选基因,可能在胶质瘤的发生中起一定作用。

茶树休眠芽与萌动芽抑制消减杂交文库的构建与初步分析

为了解茶树越冬芽休眠及其解除的分子机理,以休眠芽和萌动芽为材料,构建了茶树休眠芽与萌发芽的正、反向抑制消减杂交文库,并从两个文库各随机挑选96个阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析。建库质量分析结果表明,所构建的正、反向消减文库有效富集了差异基因,消减效率达到要求,插入片段集中于250-750bp之间,文库质量较好。对正、反向文库随机挑选的阳性克隆测序和分析结果表明,正、反向文库在基因表达谱上存在一定的差异,萌动芽文库在亚细胞器形成、转运载体等方面的基因与休眠芽文库有较大差异,而休眠芽文库在抗氧化、翻译调控以及胁迫响应等方面的基因与萌动芽文库有较大差异。这两个文库的建立为进一步了解茶树芽休眠与解除的分子机制奠定了基础。

辣椒N基因介导抗根结线虫作用早期表达基因的抑制性消减杂交SSH分析

以含N基因的辣椒(Capsicum annuumL.)为试验材料,接种南方根结线虫(Meloidogyne in-cognita)12、24、36h的根尖材料作为测验方(tester),相应的未接种根尖材料作为驱动方(driver),构建一个南方根结线虫诱导N基因表达早期的正向抑制消减杂交cDNA文库,并结合文库高密度点阵膜杂交差异筛选,获得了237条表达序列标签(EST)。在GenBank上进行BLASTn与BLASTx分析,得到148条功能已知的EST序列,获得已知的上调抗性相关EST68个。分离出了具有NBS-LRR结构的抗线虫蛋白和类LRR抗性蛋白的基因,防御作用相关的类萌芽素(GLP)、HSR203J蛋白、蜜腺蛋白、蛇毒素肽等基因,抗性相关的WRKY、ERFBP等转录因子基因,以及G蛋白、14-3-3蛋白等多种信号蛋白基因。通过Gene Ontology分析,N基因介导的早期表达抗病基因涉及病原物的识别、抗性信号传导、过敏性坏死、系统获得性抗性以及植物细胞保护机制等多个方面,并有许多功能未知的基因有待于进一步的研究。

应用抑制消减杂交技术构建肝癌差异表达基因消减cDNA文库

目的 构建肝癌及癌旁肝组织差异表达基因的消减cDNA文库。方法 采用新近建立的抑制消减杂交方法 ,以肝癌组织及癌旁肝组织作为对比材料 ,分离肝癌组织中差异表达基因的cDNA片段 ,将其与T载体进行T/A连接构建文库 ,将连接产物用电穿孔法转化大肠杆菌进行文库扩增后 ,随机挑取 1 0 0个白色克隆用菌落PCR进行鉴定。结果 扩增消减cDNA文库获得 30 0 0余个白色阳性克隆 ,随机挑取 1 0 0个白色克隆用PCR进行扩增 ,95%的克隆中均有 1 0 0～ 6 0 0bp的插入片段 ,这些片段可能是肝癌差异表达基因的cDNA片段。结论 用SSH法及T/A克隆技术成功构建了肝癌与癌旁肝组织差异表达基因消减cDNA文库 ,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆肝癌差异表达的新基因奠定了基础。

抑制性消减杂交分离苹果缺铁诱导的相关基因

以铁高效基因型植物——苹果属小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)为材料,利用抑制性消减杂交(SSH)方法,成功构建了小金海棠缺铁条件下的消减cDNA文库。该文库包含1 152个克隆,通过PCR检测插入片段大小在300 ～1 000 bp之间。对构建的消减cDNA文库进行差异筛选,得到差异表达片段(ESTs) 105个。GenBank上BLAST结果如下: 50个ESTs与其它物种同源性较高,视为已知基因,并根据其功能分为9个组; 32个ESTs在GenBank中无法查到对应的同源序列,可能代表了新基因;另外23个是与已知ESTs重复的基因片段。

抑制性消减杂交方法克隆棉属突变材料腺体发育相关的cDNAs

该文采用抑制性消减杂交方法 (SSH)构建了棉属突变材料“湘棉 18”种子萌发过程中腺体发育形成前后的两个不同时期的SSH差减文库 .通过差示筛选及反式Northern检测 ,获得了色素腺体形成时期特异表达或优势表达的cDNA片段 .结果表明 ,这些cDNA所涉及的基因 ,多数是棉属中新发现的 ,它们与发育调控、细胞凋亡、蛋白质合成等密切相关 .

应用抑制消减杂交分离雌、雄鸡胚性分化早期的差异表达基因

分离不同性别的鸡胚性分化早期差异表达基因,可为禽类性别决定和性分化机制研究提供基本信息。本研究分别以孵化3.5-6d的雌、雄鸡胚性腺为材料,利用抑制性消减杂交技术成功构建了雌-雄鸡胚间正、反向消减cDNA文库,并利用斑点印迹杂交从中筛选出了39个性别差异表达的阳性cDNA克隆。以持家基因GAPDH为参照指标检测消减文库的消减效率,结果发现两个文库的消减效率均高达25倍。插入片段PCR鉴定结果显示,消减文库中cDNA插入片段的长度主要分布于250-750bp之间。分别对雌、雄鸡胚消减文库中的252和168个cDNA克隆进行斑点杂交筛选,再随机从两个消减文库中共抽取39个阳性差异表达克隆进行序列测定及序列比对分析。结果表明:这39个cDNA克隆分别代表了定位于鸡不同染色体上的18个已知功能的基因和11个假定基因;参照哺乳动物同源基因的功能,所得的18个已知差异基因可能参与多种生物反应过程。用半定量RT-PCR方法对雌、雄鸡胚消减文库中各5个基因的表达情况进行进一步验证,发现除雌性库中的一个基因外其它9个基因均有较明显的性别差异表达。

用抑制消减杂交法分离巴西橡胶树胶乳特异表达基因

采用巴西橡胶树常割树胶乳的Poly(A+)RNA为Tester,叶片Poly(A+)RNA为Driver,通过抑制消减杂交法(suppressivesubtractivehybridization,SSH)构建了一个胶乳特异表达基因差减文库,通过菌落PCR及反式NorthernDot-Blot筛选鉴定阳性差异片段,获得79个胶乳特异表达阳性克隆,部分阳性克隆还通过NorthernBlot杂交及RT-PCR进一步验证。随机挑选部分阳性克隆序列比较分析,结果表明有部分克隆与巴西橡胶树中已知的基因相同,而多数克隆在巴西橡胶树中是新发现,它们与橡胶生物合成、物质代谢运输、信号传导和形态建成等相关。

抑制性消减杂交技术原理及应用

0引言 抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术.其原理是以抑制性多聚酶链反应(PCR)反应为基础的cDNA消减杂交技术.通过合成两个不同的接头,连接于测试cDNA片段的5'末端,达到选择性扩增差异性表达的cDNA片段,抑制非目的cDNA的扩增.该技术与其他消减杂交技术相比具有假阳性率低、敏感性高、效率高等优点而得到广泛应用.

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因

目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活的相关基因cDNA消减文库,克隆HCV NS3反式激活相关基因。方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果:文库扩增后得到70个白色克隆,经菌落PCR分析,得到56个200-1000 b插入片段。对所得片段测序,并进行同源性分析,获得6个差异表达的未知序列,可能是NS3反式激活的新的靶基因。结论:成功构建HCV NS3反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础。

秀珍菇子实体发育相关消减杂交cDNA文库的构建与分析

秀珍菇(Pleurotus pulmonarius)经冷刺激后可以诱发子实体的形成。为了更好地了解秀珍菇在冷刺激后子实体发育的机理,本文利用抑制性消减杂交技术构建了cDNA文库。基于该文库,共检测到185条高质量的EST差异序列。根据序列比对分析,136条序列与已知基因同源,49条序列属功能未知。生物信息学分析显示136条序列按功能分属于23个大类。这些研究为秀珍菇变温结实的分子机理探究提供理论基础。

镰形扇头蜱唾液腺抑制消减杂交文库的构建和分析

【目的】寻找镰形扇头蜱吸血后较吸血前唾液腺差异表达基因。【方法】以抑制消减杂交法分别构建镰形扇头蜱半饱血雌蜱和吸血雄蜱唾液腺以pGEM-T-easy为载体的cDNA文库,并测序进行生物信息学分析。【结果】分别测得247个雌蜱有效EST序列和168个雄蜱有效EST序列,并预测雌蜱可能含有5′末端和3′末端的EST序列分别为25个和44个,雄蜱可能含有5′末端和3′末端EST序列分别为53个和74个。随机选择非重复的24个雌蜱序列和21个雄蜱序列以RT-PCR方法验证消减效果;在吸血后唾液腺中,雌蜱有13个基因表达上调或新表达,消减效率为54%,雄蜱有9个基因表达上调或新表达,消减效率为43%。对所测有效序列经BLAST分析,检索247个雌蜱序列获得141个匹配,匹配率为57%,其中有32个蜱基因,占141个匹配基因的23%;检索168个雄蜱序列获得125个匹配,匹配率为74%,其中有29个蜱基因,占125个匹配基因的23%。BLAST检索结果显示这些蛋白主要包括帮助蜱口器固定免疫调节蛋白、抗凝血蛋白、加强能量代谢的线粒体蛋白和促进基因转录的各种转录因子。【结论】这些蛋白主要是为了适应蜱吸血的生理过程及应变蜱因吸血而产生的免疫防御和排斥。

抑制性消减杂交构建奶牛乳房炎抗性相关cDNA文库

以经产荷斯坦奶牛外周血白细胞为材料,分离Poly(A)+ RNA,反转录合成单链及双链cDNA,经酶切成平均大小为400～600 bp的片段,将患乳房炎奶牛cDNA分成2组,分别与2种不同的接头连接,再与健康奶牛cDNA进行2次消减杂交和2次抑制性PCR扩增,将第2次PCR产物与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞进行文库扩增,构建了具有高消减效率的奶牛乳房炎抗性相关cDNA文库.文库扩增后得到610个白色阳性克隆,随机挑选克隆进行PCR鉴定,插入片段主要分布在250～750 bp 之间.文库的成功构建为进一步筛选、克隆与奶牛乳房炎抗性相关的基因奠定了基础,对研究奶牛乳房炎抗性的分子机制以及乳房炎的综合防制具有重要意义.