鉴别差异表达基因的新方法──抑制消减杂交法(SSH)

抑制消减杂交法（SuppressicSubtractiveHybridization，SSH）是最近（1996）报道的能有效鉴别两个不同细胞群差异表达基因的新方法［1，2］。该方法是以抑制PCR和消减杂交法为基础，在一轮反应中实现mRNA的均等化和消减步骤。本文对SSH法的原理、优缺点作了介绍，并与其它检测差异表达基因的方法，如mRNA差别显示法（DDRT－PCR）、代表性序列差异分析（RDA）比较，认为SSH方法具有高效快速、高敏感性和假阳性低等优点。同时，625个克隆中有很大一部分是转录物丰度很低的基因，40％的克隆可能为新的基因。因此，SSH可作为鉴别差异表达基因和克隆新基因的有效方法。

用抑制消减杂交法分离巴西橡胶树胶乳特异表达基因

采用巴西橡胶树常割树胶乳的Poly(A+)RNA为Tester,叶片Poly(A+)RNA为Driver,通过抑制消减杂交法(suppressivesubtractivehybridization,SSH)构建了一个胶乳特异表达基因差减文库,通过菌落PCR及反式NorthernDot-Blot筛选鉴定阳性差异片段,获得79个胶乳特异表达阳性克隆,部分阳性克隆还通过NorthernBlot杂交及RT-PCR进一步验证。随机挑选部分阳性克隆序列比较分析,结果表明有部分克隆与巴西橡胶树中已知的基因相同,而多数克隆在巴西橡胶树中是新发现,它们与橡胶生物合成、物质代谢运输、信号传导和形态建成等相关。

抑制消减杂交法筛选原发性肝细胞癌中差异表达的基因及其生物学意义

为了筛选原发性肝细胞癌 (hepatocellularcarcinoma ,HCC)中差异表达的基因 ,以了解HCC发生发展的分子基础 ,选取了一例早期高分化肝癌标本作为材料 ,采用抑制消减杂交 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)技术 ,进行了前向及反向消减杂交 ,结合反向Northern印迹筛选 ,得到多个差异表达的基因 .对有意义的基因用半定量RT PCR检测了肝癌中的表达 .结果显示 ,PON2、hSRP1alpha、H4 1在大部分肝癌中表达升高 ,IGFBP1、ITIH1在早期癌症中 ,大部分癌的表达升高 ,在晚期癌症中则表达下降 .EGR1在大部分肝癌中表达降低 .研究表明 ,不同分化程度、不同临床分期的肝癌 ,有共同的或不同的基因表达发生改变 ,明确这些差异表达的基因谱 ,对于肝癌发生发展机理的阐明及肝癌的预防、诊断、治疗都有重要意义 .

抑制性消减杂交法筛选植入人发角蛋白与单纯脊髓损伤大鼠基因表达的差异

目的:采用抑制性消减杂交筛选植入人发角蛋白大鼠损伤脊髓基因性差异表达。方法:实验于2004-11在汕头大学中心实验室进行。分别从植入人发角蛋白损伤组与单一损伤对照组4thw组织中提取mRNA,反转录成双链cDNA,经RsaI酶切、接头连接、两次消减杂交和两次抑制性聚合酶链扩增,而后将消减cDNA产物进行T/A克隆和测序分析。结果:所获植入人发角蛋白脊髓损伤组织差异表达基因的消减cDNA产物散布在280～800bp范围。经蓝白筛选和酶切鉴定,共得到232个阳性克隆。对其中20个做测序分析获得了氨基酸转运蛋白系统A2(Ata2)、细胞色素氧化酶Ⅲ(COXⅢ)、抗过氧化物蛋白5(Prd5)、Tap1蛋白和半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cst3)等5个表达蛋白。结论:prd5、Ata2和COXⅢ分别通过参与脊髓损伤后抗氧化损伤过程,起到抑制自由基、兴奋性氨基酸的产生,减轻Ca离子紊乱的程度,降低了继发性损害对脊髓组织的二次损伤程度;而Tap1蛋白和Cst3则参与人发角蛋白的降解过程。

用cDNA消减杂交法克隆白血病细胞K562分化相关基因

目的：复制hexamethylene bisacetamide(HMBA)诱导白血病细胞K562向巨噬细胞样分化的模型并克隆在这一过程中特异表达的基因。方法：利用cDNA消减杂交的方法构建HMBA诱导K562细胞分化相关基因的cDNA消减文库，挑选部分克隆测序，并用Reverse Dot Blot和Northern Blot证实其差异表达。结果：得到2个在HMBA诱导K562细胞分化过程中表达增强的基因difl3和difl4，以及一些新的EST克隆片段和已知基因，并证实difl3和difl4在K562细胞分化前后有差异表达，其中difl4基因在骨骼肌、肝和肾组织中有强表达。结论：difl3和difl4基因与HMBA诱导K562细胞向巨噬细胞样分化的过程有关，并在细胞基本生命活动中发挥重要作用。

以抑制消减杂交法筛选肿瘤耐药相关基因

避开化疗诱导多药耐药性的常规方法,建立烷基磷脂类化合物(十六烷基磷酸胆碱,HePC)诱导人上皮性肿瘤细胞系产生交叉耐药。旨在以新的角度认识肿瘤多药耐药性,揭示新的调控机制。利用抑制消减杂交技术,对文库进行克隆分析,在获得的可分析的78个克隆中,27%没有同源基因片段或同源性很低,暂定为“新基因”;14%具有染色体明确定位,认为是化疗敏感肿瘤KB细胞所特有的cDNA片段;19%在人类EST库文库MGC和CGAP中出现,可能是肿瘤细胞特有基因;发现与耐药相关的已知功能基因高达40%。

抑制性消减杂交法构建甲状腺癌差异表达基因文库

目的 筛选并克隆在甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的基因。方法 (1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差示表达分析,构建人甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的cDNA消减文库;(2)克隆、鉴定甲状腺癌组织特异性高/低表达的基因;(3)登录Genbank,运用Blastn程序进行同源性分析。结果成功构建了高消减效率的人甲状腺癌cDNA消减文库,对其中数个克隆的插入cDNA片段进行测序,经检索Genbank表明,正向SSH产物中有3个片段与来源于结肠上皮腺癌和Lung Epidermoid carcinoma的:EST有100％同源性,提示它们来自恶性肿瘤相关基因。反向SSH产物中有5个片段为未知新序列,提示它们可能来自于在甲状腺癌中特异性低表达的新基因。结论通过抑制性消减杂交技术,构建了人甲状腺癌cDNA消减文库,为下一步筛选鉴定甲状腺癌特异性基因及其全长克隆、功能研究等工作打下了基础。

改良消减杂交法克隆大鼠脊髓损伤修复相关基因

目的 克隆大鼠脊髓损伤修复相关基因,从分子水平了解中枢神经系统损伤修复的机制。方法 建立大鼠脊髓损伤模型,运用基于聚合酶链反应(PCR)的改良消减杂交技术,克隆与脊髓损伤修复相关的基因。结果 随机选取110个克隆进行研究,排除假阳性克隆和重复序列后,筛选到47个差异表达序列,其中39个已知序列,8个未知序列。39个已知序列中,包括synuclein、clusterin等与神经系统发育及退行性病变密切相关的蛋白编码序列;8个未知序列中,69号末端含有Leu拉链结构,包含该序列的基因可能编码DNA结合蛋白。结论 运用基于PCR的改良消减杂交技术成功克隆到损伤脊髓上调表达的基因序列,为探讨中枢神经系统损伤修复的分子机制奠定了基础。

改良消减杂交法在多种肿瘤细胞凋亡相关基因克隆中的应用

目的 应用基于聚合酶链反应 (PCR)技术的改良消减杂交方法克隆肿瘤凋亡相关基因。方法 以全反式维甲酸 (ATRA ,1× 10 -5mol/L)诱导前列腺癌DU 14 5细胞、早幼粒白血病HL 6 0细胞和乳腺腺癌MCF 7细胞产生凋亡 ,在此基础上 ,采用基于PCR技术的改良消减杂交方法克隆肿瘤细胞凋亡相关基因。结果 在维甲酸 ( 1× 10 -5mol/L)诱导前列腺癌DU 14 5细胞、早幼粒白血病HL 6 0细胞和乳腺腺癌MCF 7细胞产生凋亡过程中 ,有肿瘤坏死因子、泛素、热休克蛋白和C erbB 2基因参与 ,并成功克隆出 3条可能与凋亡密切相关的未知基因 ,均被GenBank收录 ,登录号为AF174394、AF14 4 0 5 6、AF14 1882。结论 这种基于PCR技术的改良消减杂交方法对于差异表达基因的克隆是十分有效的。

用改良消减杂交筛选类风湿性关节炎滑膜细胞中高表达基因

为了研究类风湿性关节炎 (rheumatoid arthritis,RA)滑膜细胞 (fibroblast- like synovialcells,FLS)过度增殖和破坏软骨的分子机理 ,利用改良消减杂交法以骨性关节炎 (osteoarthritis,OA)病人滑膜细胞为对照 ,筛选 RA滑膜细胞中的高表达基因 .将得到的基因片段克隆入质粒载体 ,通过反向点杂交排除假阳性克隆后 ,将阳性克隆进行核酸序列分析 ,最后用 Northern杂交方法检测一些高表达基因在 RA和 OA病人滑膜细胞中的表达水平 .结果显示 ,共分离到 1 50个 RA高表达基因片段 ,其中长于 1 0 0 0 bp的片段占 8% (1 2 /1 50 ) ,长于 40 0 bp的片段占 36.7% (55/1 50 ) ,在大于 40 0 bp的片段中 ,假阳性率为 2 3.7% (1 3/55) .在测序的 1 8个片段中 ,已知基因有 1 2个 ,其中包括 IGF- 1结合蛋白 (IGFBP)特异性丝氨酸蛋白酶、层粘连蛋白受体和组织蛋白酶 B等 .新序列有 6个 ,其中两个序列分别与 Ring- box蛋白 1和 SON DNA结合蛋白同源 .对 IGFBP特异性丝氨酸蛋白酶、层粘连蛋白受体和组织蛋白酶 B基因的 Northern杂交分析显示 ,在 RA病人滑膜细胞中 ,这些基因的表达水平高于 OA病人滑膜细胞 .这些结果提示 ,这种改良消减杂交法是一种简便有效的分离差异表达基因的方法 ;IGF- 1结合蛋白特异性丝氨酸蛋白酶。

一种用少量标本快速构建老年性白内障消减cDNA文库的方法

为从少量标本中获得含较多大片段的、高质量的老年性白内障消减cDNA文库 ,利用磁珠分离、生物素标记的改良消减杂交法获得差异cDNA ,利用选择性PCR法扩增其中大片段差异cDNA ,从而成功构建老年性白内障消减cDNA文库 .在文库中随机挑取的 2 2个克隆中 ,10 0 0bp以上的片段有 7个 ,占 31 8% ,75 0bp以上有 15个 ,占 6 8 2 % .所得cDNA片段较大 ,可以满足下一步研究需要 .

改良消减杂交方法克隆前列腺癌细胞凋亡相关基因

目的 建立前列腺癌细胞系DU 145凋亡细胞模型 ,克隆与凋亡相关的基因 ,了解凋亡产生的分子机制。 方法 以全反式维甲酸 (all transretinoicacid)诱导前列腺癌细胞系DU 145细胞凋亡 ,观察细胞形态及超微结构的改变 ,采用基于PCR技术的改良消减杂交方法克隆前列腺癌细胞凋亡相关基因。 结果 在维甲酸诱导的前列腺癌细胞DU 145凋亡过程中 ,有TNF及c erbB 2基因的参与 ,并成功克隆出一条可能与凋亡密切相关的未知基因 pcar,已被Genebank收录 ,登录号为AF174394。 结论 维甲酸诱导前列腺癌细胞DU 145凋亡过程有多基因参与 。

差异表达基因克隆技术的研究进展

随着基因组计划的顺利实施 ,大量的生物信息被解析 ,分离并克隆差异表达基因已成为生命科学研究的热点。近些年来 ,国内外学者发展了多种分析差异表达基因的技术。现就目前主要使用的一些技术作一综述。

巴西橡胶树顺式异戊烯基转移酶基因cDNA克隆及其序列特征分析

以巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳的RNA为Tester;叶片RNA为Driver,利用抑制消减杂交法(suppressive subtractive hybridization,SSH)构建了一个胶乳特异表达基因差减文库。通过反式Northern点杂交(reverse Northern dot blots)筛选到一个与顺式异戊烯基转移酶基因(橡胶生物合成的关键酶基因)高度同源的阳性克隆R363。采用RACE方法获得该克隆的全长cDNA(GenBank登陆号:AY461414)。序列分析表明,该基因长1156 bp,含有873 bp的阅读框,编码290个氨基酸,分子量约为32.9 kD,等电点为7.2,含有N-端跨膜螺旋区。同源性分析表明R363编码的蛋白质具有异戊烯基转移酶家族的特征,含有cis-异戊烯基链转移酶的5个高度保守区,推测R363可能是一种新的顺式-异戊烯基转移酶基因。Northern blot分析显示,R363在胶乳中高度表达,在叶中不表达。乙烯处理前后表达强度一致,表明该基因表达不为乙烯所诱导。

老年性白内障与正常晶体上皮细胞中差异表达基因的筛选

目的 :筛选老年性白内障与正常晶体上皮细胞的差异表达基因 .方法 :利用改良消减杂交法获得差异cDNA ,利用PCR法扩增其中大片段差异cDNA ,将其克隆入质粒载体 ,通过反向点杂交排除假阳性克隆后 ,阳性克隆测序与Gen Bank中的序列进行比较 ,新序列进行计算机分析 .结果 :在文库中随机挑选约 6 0 0个克隆酶切鉴定 ,获得≥ 75 0bp片段4 0 0个 .经反向点杂交 ,排除假阳性克隆后 ,共得到阳性克隆15 0个 ;测序的 5 0个片段中 ,有 30个已知基因 (包括 2 0个功能已知基因、10个序列已知但功能未知基因 ) ,3个新序列 .新序列中有一个的氨基酸序列与假想的锌指蛋白有 4 5 %同源性 ,可能参与细胞生长调控与代谢 .结论 :改良消减杂交法可以快速有效地获得老年性白内障差异表达基因 。

机械张应变诱导的大鼠血管平滑肌细胞磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路相关基因的筛选

目的筛选机械张应变诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的相关基因。方法应用FX-4000T细胞应变加载系统,对大鼠主动脉VSMCs施加1Hz、10%张应变,Western blotting检测细胞在不同加载时间下Akt磷酸化水平的变化;用抑制消减杂交法(SSH),筛选给予PI3K的抑制剂Wortmannin和给予DMSO两组细胞在加载张应变24h后的差异表达基因片段,得到的消减杂交产物连接到T载体上,经过蓝白斑筛选,对所有阳性克隆进行菌液PCR筛选及测序,应用BLASTN进行序列比对。结果机械张应变改变了VSMCs磷酸化Akt水平;SSH所获得的54个克隆随机挑选30个送测序,得到10个不同差异表达序列标签(EST),发现6个EST代表的大鼠基因可能与机械张应变诱导的VSMCs PI3K/Akt信号通路相关,它们是:Highmobility group box1(HMGB1),Neural precursor cell expressed(Nedd4a),Cyclin-dependent kinase5(CDK5),Histonedeacetylase3(HDAC3),Ubiquitin-like1(Uble1a),Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1(hnRNP)。结论SSH有效筛选到了机械张应变诱导的VSMCs PI3K/Akt信号通路的相关基因,为进一步研究机械张应变诱导的血管病理生理改变提供了资料。