消皮素D在肝脏疾病病理进展中的作用

消皮素D(GSDMD)在免疫炎症反应效能放大及细胞焦亡过程中扮演重要角色。其被caspase-1切割活化后,GSDMD-N端快速释放,锚定在细胞膜上并形成孔隙,随即引发细胞焦亡,同时伴随强促炎因子IL-1β和IL-18大量释放。急/慢性肝脏炎症反应、细胞死亡是病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病、肝衰竭及肝细胞癌等肝脏疾病的共有病理特征。本文在概述GSDMD基本结构特点后,详细分析了其在多种肝脏疾病病理进展所扮演的重要角色。此外,提出了针对GSDMD为潜在治疗靶点的防治策略,可为肝脏疾病临床防治下一步研究的重点方向提供新的思路。

Ras鸟苷酸释放蛋白1、垂体同源框1、消皮素D在皮肤黑色素瘤中的表达及相关性研究

目的探讨Ras鸟苷酸释放蛋白1(RASGRP1)、垂体同源框1(PITX1)、消皮素D(GSDMD)在皮肤黑色素瘤中的表达及诊断价值。方法选取2013年1月至2019年12月在该院诊治的72例皮肤黑色素瘤患者为研究组,对其癌组织、癌旁组织标本进行免疫组化染色,同时选取同期在该院进行整形手术的皮肤正常者40例为对照组。对待测标本中RASGRP1、PITX1、GSDMD表达进行检测,对比、分析RASGRP1、PITX1、GSDMD在不同临床特征皮肤黑色素瘤中的表达,探讨三者间的相关性及对皮肤黑色素瘤的诊断价值。结果与对照组比较,研究组癌组织中RASGRP1、PITX1表达降低,GSDMD表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。RASGRP1、PITX1、GSDMD的表达与皮肤黑色素瘤患者性别、年龄无关(P>0.05),与肿瘤最大径、浸润深度、分化程度、淋巴结转移、其他部位转移、预后情况、临床分期有关(P<0.05),且肿瘤最大径≥2 cm、ClarkⅢ~Ⅴ期、低分化、淋巴结转移、其他部位转移、预后不良、Ⅳ期皮肤黑色素瘤患者RASGRP1、PITX1表达较低,GSDMD表达较高(P<0.05)。Pearson相关分析显示,RASGRP1与PITX1呈正相关(r=0.523,P=0.001),RASGRP1与GSDMD呈负相关(r=-0.612,P=0.001),PITX1与GSDMD呈负相关(r=-0.569,P=0.001)。RASGRP1、PITX1、GSDMD联合检测对皮肤黑色素瘤的诊断价值优于单项检测(P<0.05)。结论RASGRP1、PITX1在皮肤黑色素瘤组织中低表达,GSDMD呈高表达,RASGRP1、PITX1、GSDMD可作为皮肤黑色素瘤的检测指标。

消皮素D通过介导细胞焦亡导致重症急性胰腺炎肠道损伤的机制研究

目的探讨消皮素D(GSDMD)在重症急性胰腺炎(SAP)小鼠肠道损伤中的作用机制。方法将C57BL/6小鼠按随机数字表法分为生理盐水(NS)组、小干扰RNA(siRNA)-NS组、SAP模型组和siRNA-SAP组,每组6只。通过腹腔注射雨蛙素50μg/kg联合脂多糖(LPS)10 mg/kg构建SAP小鼠模型;NS组给予等量NS;siRNA-SAP组和siRNA-NS组在制模或注射NS前分3次经尾静脉注射siRNA 50 mg/kg。制模12 h后取各组小鼠眼球血,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清白细胞介素(IL-1β、IL-18)水平。处死小鼠观察腹腔内大体改变;取胰腺和回肠组织,光镜下观察胰腺及肠黏膜病理学改变;采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肠道组织长链非编码RNA uc.173(lnc uc.173)表达;采用免疫组化法检测肠黏膜上皮细胞紧密连接蛋白带状闭锁蛋白-1(ZO-1)及闭合蛋白(Occludin)的表达;采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测肠道组织GSDMD蛋白表达。结果ELISA显示,SAP模型组血清IL-1β、IL-18水平较NS组和siRNA-NS组明显升高〔IL-1β(ng/L):146.66±1.40比44.48±5.76、81.49±10.75,IL-18(ng/L):950.47±177.09比115.43±16.40、84.84±21.90,均P<0.05〕;siRNA-SAP组IL-1β、IL-18水平较SAP模型组明显降低〔IL-1β(ng/L):116.26±15.54比146.66±1.40,IL-18(ng/L):689.96±126.08比950.47±177.09,均P<0.05〕。大体观察显示,NS组和siRNA-NS组小鼠腹腔内未见明显异常;SAP模型组和siRNA-SAP组可见肠道有不同程度水肿、充血,但siRNA-SAP组损伤较SAP模型组明显减轻。光镜下显示,NS组和siRNA-NS组胰腺未见明显变化,肠黏膜未见明显损伤;SAP模型组和siRNA-SAP组胰腺组织有不同程度水肿、炎性细胞浸润、小叶结构破坏,回肠可见不同程度的肠黏膜破坏和绒毛断裂,但siRNA-SAP组病理损伤较SAP模型组明显减轻。RT-PCR显示,SAP模型组肠道组织lnc uc.173表达较NS组和siRNA-NS组显著降低(2-ΔΔCt:0.26±0.12比1.01±0.37、0.67±0.32,均P<0.05);而siRNA-SAP组lnc uc.173表达较SAP组明显升高(2-ΔΔCt:0.60±0.39比0.26±0.12,P<0.05)。免疫组化显示,NS组ZO-1、Occludin均沿肠黏膜上皮细胞分布,并呈强阳性表达;SAP模型组和siRNA-SAP组ZO-1、Occludin表达均明显减弱,但siRNA-SAP组较SAP模型组有所增强。Western blotting显示,SAP模型组肠道组织GSDMD蛋白表达水平较NS组和siRNA-NS组明显升高〔GSDMD蛋白(GSDMD-N/β-actin):1.99±0.46比1、1.00±0.78,均P<0.05〕;与SAP模型组相比,siRNA-SAP组GSDMD蛋白表达明显下降〔GSDMD蛋白(GSDMD-N/β-actin):1.42±0.42比1.99±0.46,P<0.05〕。结论SAP小鼠全身炎症反应和肠黏膜屏障损伤可能与肠道组织GSDMD表达升高有关,GSDMD通过介导细胞焦亡促进炎性因子释放,导致肠道损伤,下调肠上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1及Occludin的表达,致使肠道黏膜损伤。

褪黑素通过miR-325-3p/消皮素D途径调控脂多糖诱导的血管内皮细胞焦亡

目的研究褪黑素(melatonin,MT)抑制脂多糖(lipopolysaccharid,LPS)诱导的血管内皮细胞焦亡的潜在机制。方法采用LPS培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)建立内皮细胞焦亡模型,将细胞分为对照组、LPS组、褪黑素组、miR-325-3p模拟物组及miR-325-3p抑制剂组等进行培养。采用细胞计数试剂盒-8检测褪黑素对血管内皮细胞活力的影响;实时聚合酶链反应和免疫印迹法检测miR-325-3p及其靶基因消皮素D(gasdermin D,GSDMD)、细胞焦亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶-1、白介素(interleukin,IL)-1β和IL-18在血管内皮细胞焦亡模型中的表达水平;利用荧光素酶报告试验研究miR-325-3p和GSDMD之间的相关性。结果 MT可抑制HUVEC因LPS诱导的细胞焦亡。与对照组相比,MT处理后HUVEC中GSDMD蛋白表达显著下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。双荧光素酶基因报告试验表明,GSDMD是miR-325-3p的直接靶点。与对照组相比,转染miR-325-3p模拟物的HUVEC中GSDMD表达量显著下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,MT可显著增强miR-325-3p表达,并诱导GSDMD表达量下调。结论 MT可通过上调miR-325-3p靶向下调GSDMD表达,进而抑制LPS诱导的细胞焦亡。

消皮素D介导的细胞焦亡与心血管疾病关系的研究进展

细胞焦亡是细胞程序性死亡的一种形式,其特征是消皮素家族介导的膜孔形成和随后的细胞裂解及释放促炎细胞内容物(包括白细胞介素-1β、18和高迁移率族蛋白B1)。消皮素D是消皮素家族的重要成员,在炎症小体信号转导和细胞焦亡中均发挥极其重要的作用。近年来细胞焦亡与心血管疾病的关系越来越受到关注。该文对消皮素D介导的细胞焦亡参与动脉粥样硬化、心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤、糖尿病心肌病、心肌肥厚及心力衰竭等疾病和病理生理过程的作用机制进行了综述。

FTO、GSDMD在胃癌组织中的表达及其作用机制研究

目的探讨肥胖相关蛋白(FTO)与消皮素D(GSDMD)在胃癌(GC)组织中的表达及其作用机制。方法通过TIMER 2.0数据库分析FTO及GSDMD在GC组织中的差异表达。收集2022年1月至2023年3月广西医科大学第二附属医院手术切取的GC组织及其对应癌旁组织(距离肿瘤边缘3~5 cm)各45例,并收集患者的临床病理资料。采用免疫组织化学染色法检测组织中FTO、GSDMD的表达情况,分析其与患者临床病理特征的关联性。通过转染低表达FTO慢病毒构建低表达FTO的AGS细胞(FTO低表达组),并以转染空载体慢病毒的细胞作为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测两组细胞FTO mRNA、GSDMD mRNA的表达水平;采用细胞划痕实验及细胞迁移实验分析两组细胞迁移能力。结果基于TIMER 2.0数据库的分析结果及免疫组织化学染色结果显示,FTO、GSDMD在GC组织中呈高表达(P<0.05)。FTO和GSDMD高表达均与肿瘤侵犯深度、淋巴结转移密切相关(P<0.05)。细胞实验结果显示,FTO低表达组的GSDMD mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.05),划痕愈合率更低,细胞迁移数更少,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论FTO可能通过调控GSDMD表达促进GC细胞转移。

芪地糖肾方调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路介导高糖刺激肾小球内皮细胞焦亡的研究

目的 探究芪地糖肾方通过NOD样受体家族热蛋白结构域相关蛋白3/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1/消皮素D蛋白(NLRP3/Caspase-1/GSDMD)通路介导高糖刺激的肾小球内皮细胞焦亡的作用。方法 将肾小球内皮细胞分为正常组、高糖组、芪地糖肾方组,分别予完全培养基、30 mmol/L高糖培养基、30 mmol/L高糖培养基+芪地糖肾方100μg/mL培养48 h,采用细胞免疫荧光染色法观察细胞中NLRP3表达情况及细胞骨架情况,采用Western blot法检测细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、消皮素D蛋白(GSDMD)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)表达情况。结果 与正常组比较,高糖组细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、ASC、IL-18、IL-1β蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),NLRP3荧光表达信号增强,细胞骨架损伤明显;与高糖组比较,芪地糖肾方组NLRP3、Caspase-1、GSDMD、ASC、IL-18、IL-1β蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),NLRP3荧光表达信号减弱,细胞骨架损伤状态改善。结论 芪地糖肾方可通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD焦亡相关通路激活改善高糖诱导的肾小球内皮细胞损伤。

电针足三里对功能性消化不良大鼠十二指肠半胱氨酸蛋白酶-1和消皮素D的影响

目的探讨电针足三里对功能性消化不良(FD)大鼠十二指肠细胞焦亡的影响和可能的作用机制。方法将24只7日龄Sprague-Dawley(SD)大鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组、电针组,每组8只。模型组和电针组采用多因素诱导法(碘乙酰胺灌胃法+夹尾刺激法)制备FD大鼠模型。造模成功后,电针组大鼠给予针刺"足三里"穴后连接韩式穴位神经刺激仪治疗2周,空白组和模型组不予任何干预。于基线期、造模后、电针干预7 d和14 d后记录3组大鼠的体重,于电针干预结束后检测3组大鼠的胃排空率和小肠推进率,并采用酶联免疫法(ELISA)检测其血清白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)的表达水平,采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测3组大鼠十二指肠IL-1β和IL-6转录水平,采用免疫印迹法检测3组大鼠十二指肠半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)p20和消皮素D(GSDMD)蛋白表达水平。结果造模成功后,模型组和电针组大鼠的平均体重与空白组造模成功后比较,差异均有统计学意义(P<0.01);电针干预7 d和14 d后,模型组和电针组大鼠的平均体重与空白组同时间点比较,差异均有统计学意义(P<0.05),且电针组电针干预7 d和14 d后的平均体重与模型组同时间点比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。电针干预结束后,电针组大鼠胃内残留率和小肠推进率与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),而模型组大鼠胃内残留率和小肠推进率与空白组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。电针干预结束后,模型组和电针组大鼠血清中IL-1β和IL-6表达水平、十二指肠组织IL-1β和IL-6 mRNA的表达水平和十二指肠组织GSDMD、caspase-1 p20蛋白表达水平与空白组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),且电针组大鼠血清中IL-1β和IL-6表达水平、十二指肠组织IL-1β和IL-6 mRNA的表达水平和十二指肠组织GSDMD、caspase-1 p20蛋白表达水平与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论电针足三里可显著降低FD大鼠十二指肠的细胞焦亡水平,改善十二指肠低度炎症,进而减轻FD临床症状,其作用机制可能与电针足三里可下调caspase-1 p20、GSDMD-N蛋白的表达水平,降低IL-1β和IL-6等炎性因子的表达水平,以及缓解FD大鼠十二指肠的低度炎症有关。

基于Nrf2-NLRP3-GSDMD信号通路探讨肾消解毒通络方含药血清抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞焦亡的分子机制

目的基于核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid2 related factor2,Nrf2)-Nod样受体蛋白3(nod-like receptor protein 3,NLRP3)-消皮素D(gasdermin D,GSDMD)信号通路,探究肾消解毒通络方(Shenxiao Jiedu Tongluo Recipe,SJTR)含药血清对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1焦亡的影响及分子机制。方法金黄地鼠灌胃给药制备SJTR含药血清。体外常规培养HBZY-1细胞,随机分为对照组、模型组、抑制剂组及中药低中高剂量6组。对照组细胞加入正常血清在低糖培养液中培养,模型组加入正常血清在高糖培养液中培养,抑制剂组加入正常血清及MCC950在高糖培养液中培养,中药低中高剂量组分别加入SJTR含药血清在高糖培养液中培养,干预24 h后收集细胞及上清液,ELISA检测各组细胞上清液中白介素-1β(Interleukin,IL-1β)、IL-18(Interleukin,IL-18)、IL-6(Interleukin,IL-6)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD);RT-PCR检测HBZY-1细胞Nrf2、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β分子mRNA表达;Western blot法检测各分子蛋白的表达;免疫荧光法检测NLRP3分子蛋白的表达及分布;LDH释放实验检测细胞膜损伤情况;TUNEL染色检测DNA损伤情况。结果与对照组比较,模型组细胞上清液各炎症因子水平升高,MDA表达升高,SOD表达降低(P<0.05);细胞Nrf2分子呈低表达,IL-1β分子mRNA表达升高,NLRP3、Casepase-1、GSDMD分子mRNA及蛋白表达增强(P<0.05);上清液LDH含量增高(P<0.05);TUNEL阳性细胞增多。与模型组比较,中药中高剂量组及抑制组细胞上清液炎症因子含量下降,MDA水平降低而SOD升高(P<0.05);细胞Nrf2分子表达上调,而NLRP3、Caspase-1、GSDMD等分子表达明显降低(P<0.05);上清液LDH含量下降(P<0.05);TUNEL阳性细胞减少。结论SJTR含药血清可通过调控Nrf2-NLRP3-GSDMD信号通路各分子表达,抑制高糖诱导的HBZY-1细胞氧化应激及炎症反应,拮抗细胞焦亡,发挥细胞保护作用。

高氧暴露BPD小鼠模型中巨噬细胞焦亡的检测及意义

目的 探讨巨噬细胞焦亡是否参与支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)的肺病理损伤。方法 40只足月新生小鼠随机分为空气(room air,RA)组和高氧(hyperoxia,HO)组,每组20只。建立慢性高氧诱导的BPD小鼠模型。HE染色评估小鼠的肺泡化情况;CD31免疫组化检测肺血管发育状况;Masson染色分析肺组织的纤维化程度;qRT-PCR检测肺组织中的炎症因子和趋化因子(Il6、Il1b、Mmp12、Ccl2、Ccl5、Il8)基因表达水平;ELISA检测血清和肺组织匀浆中的IL-1β水平;Western blot检测细胞焦亡通路的关键蛋白NLRP3、Caspase-1 p20、N-消皮素D(gasdermin D,GSDMD)、IL-1β表达;流式分析支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞比例;免疫荧光检测F4/80与NLRP3/Caspase-1/IL-1β的共定位;免疫组化分析AQP5的表达水平。结果 与RA组相比,HO组小鼠的肺泡化阻滞和肺血管生成障碍,肺纤维化显著增加;肺组织中促炎细胞因子的表达显著上调,细胞焦亡相关蛋白表达水平显著增加,血清和肺组织匀浆中IL-1β水平显著升高;支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞比例显著升高,肺组织中F4/80与NLRP3、Caspase-1、IL-1β均存在显著的免疫荧光共定位现象,AQP5阳性的肺泡Ⅰ型上皮细胞严重受损。结论 高氧诱导的BPD小鼠模型中,NLRP3/Caspase-1/GSDMD细胞焦亡通路过度活化,可能导致BPD的肺部病理损伤。

子宫内膜异位症组织中HMGB1、GSDMD、IL-1β表达变化及其意义

目的观察子宫内膜异位症(EMS)组织中高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、消皮素D(GSDMD)、白细胞介素1β(IL-1β)的表达变化,并探讨其意义。方法EMS异位内膜组织80例份(观察组)及子宫平滑肌瘤正常内膜组织70例份(对照组),采用免疫组化法检测两组HMGB1、GSDMD、IL-1β阳性率,分析三者间及其与EMS临床病理特征的关系。结果观察组HMGB1、GSDMD、IL-1β阳性率分别为77.50%(62/80)、66.25%(53/80)、68.75%(55/80),对照组分别为32.96%(23/70)、22.86%(16/70)、17.14%(12/70),两组比较,P均<0.05。HMGB1、GSDMD、IL-1β表达与EMS临床分期有关(P<0.05),而与患者年龄、痛经程度和囊肿直径无关(P均>0.05)。观察组HMGB1与GSDMD、IL-1β表达呈正相关(r分别为0.577、0.717,P均<0.05),GSDMD与IL-1β表达呈正相关(r为0.797,P<0.05)。结论EMS异位内膜组织HMGB1、GSDMD、IL-1β表达上调,检测三指标有助于此病诊断及其临床分期的鉴别诊断,其可能会成为EMS的潜在治疗靶点。

lncRNA MEG3调控NLRP3/caspase-1/GSDMD通路影响三阴性乳腺癌对紫杉醇的敏感性

目的:探究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)母系表达基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)调控含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLR family,Pyrin domain containing protein 3,NLRP3)/含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase 1,caspase-1)/消皮素D(gasdermin D,GSDMD)通路对三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)对紫杉醇(paclitaxel,PTX)敏感性的影响。方法:通过逐渐增加PTX剂量间歇作用的方法诱导TNBC耐药细胞MDA-MB-231/R,qRT-PCR检测lncRNA MEG3表达;将MDA-MB-231细胞分为对照组(未转染+PTX)、Vector组(空载体+PTX)、pcDNA3.1-MEG3组(pcDNA3.1-MEG3表达载体+PTX)、pcDNA3.1-MEG3+BAY11-7082组(pcDNA3.1-MEG3表达载体+PTX+5μmol/L NLRP3抑制剂BAY11-7082),qRT-PCR检测转染后lncRNA MEG3表达;CCK-8法检测MDA-MB-231细胞增殖情况;通过免疫荧光染色和扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察MDA-MB-231细胞焦亡情况;Western blot检测MDA-MB-231细胞中NLRP3/caspase-1/GSDMD通路蛋白表达;体内成瘤实验检测肿瘤质量。结果:与MDA-MB-231细胞相比,MDA-MB-231/R细胞中lncRNA MEG3表达水平显著降低(P<0.05);与对照组相比,pcDNA3.1-MEG3组细胞增殖抑制率、GSDMD-N+细胞数量、细胞焦亡、细胞凋亡率及NLRP3、cleaved-caspase 1/caspase-1、GSDMD-N/GSDMD表达水平显著增加,IC50、肿瘤质量显著降低(P<0.05);与pcDNA3.1-MEG3组相比,pcDNA3.1-MEG3+BAY11-7082组细胞增殖抑制率、GSDMD-N+细胞数量、细胞焦亡、细胞凋亡率及NLRP3、cleaved-caspase 1/caspase-1、GSDMD-N/GSDMD表达水平显著降低,IC50、肿瘤质量显著增加(P<0.05)。结论:上调lncRNA MEG3表达可通过激活NLRP3/caspase-1/GSDMD通路,促进MDA-MB-231细胞焦亡,以此增加TNBC对PTX的敏感性。

车叶草苷调节NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路对脓毒症大鼠肺组织细胞焦亡的影响

目的探讨车叶草苷调节核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/胱天蛋白酶1(Caspase-1)/消皮素D(GSDMD)信号通路对脓毒症大鼠肺组织细胞焦亡的影响。方法取50只SD大鼠腹腔内注射5 mg/kg脂多糖建立脓毒症肺损伤模型,随机数字表法分为模型(M)组、车叶草苷低剂量(AL)组(17.5 mg/kg)、车叶草苷中剂量(AM)组(35 mg/kg)、车叶草苷高剂量(AH)组(70 mg/kg)、车叶草苷高剂量(70 mg/kg)+尼日利亚霉素(NLRP3激活剂,1 mg/kg)组(AH+N组),每组10只;另取10只SD大鼠灌胃等剂量生理盐水作对照(C)组。分组干预后,检测各组大鼠肺功能指标[每分钟通气量(MV)、吸气阻力(Ri)]与动脉血氧分压[p(O_(2))];HE染色检测各组大鼠肺组织病理形态;瑞氏-姬姆萨染色分类计数各组大鼠肺泡灌洗液(BALF)中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞数;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组大鼠血清炎性细胞因子白细胞介素(IL)-6、IL-8及IL-1β水平;免疫荧光染色检测各组大鼠肺组织细胞焦亡情况,比较NLRP3与GSDMD在肺组织中表达情况;Western blot检测各组大鼠肺组织NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路相关蛋白表达。结果与C组比较,M组MV、p(O_(2))降低,Ri及BALF中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞数升高,血清IL-6、IL-8及IL-1β水平升高,肺组织NLRP3、GSDMD相对荧光强度和NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达升高(P<0.05);与M组比较,AL组、AM组、AH组MV、p(O_(2))均升高,Ri及BALF中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞数下降,血清IL-6、IL-8及IL-1β水平下降,肺组织NLRP3、GSDMD相对荧光强度和NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达均降低(P<0.05);与AH组比较,AH+N组MV、p(O_(2))降低,Ri及BALF中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞数升高,血清IL-6、IL-8及IL-1β水平升高,肺组织NLRP3、GSDMD相对荧光强度和NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达升高(P<0.05)。结论高剂量车叶草苷可通过下调NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路活性,抑制脓毒症大鼠肺组织炎症,减弱肺组织炎性损伤及肺组织细胞焦亡,修复肺功能。

小胶质细胞抑制剂Pexidartinib对小鼠遥远场景性恐惧记忆再巩固的影响

目的探讨小胶质细胞抑制剂Pexidartinib对小鼠遥远场景性恐惧记忆再巩固的影响。方法将12只健康C57BL/6雄性小鼠随机分为实验组和对照组,每组6只。2组小鼠均置于场景恐惧反应箱中进行场景性恐惧条件化训练,构建场景性恐惧模型,并记录每次电击后小鼠的僵直时间;7 d后,实验组小鼠给予含Pexidartinib制剂PLX3397的鼠粮喂养,对照组小鼠给予普通鼠粮喂养,直至行为实验结果。场景性恐惧条件化训练后第16天,将小鼠重新放入场景恐惧反应箱中进行恐惧记忆唤起,不给予任何刺激呈现,小鼠自由探索5 min后取出,记录小鼠在此期间的僵直时间。在恐惧记忆唤起后24 h,将小鼠再次置于场景恐惧反应箱中,使其自由探索3 min,并记录其在该时间段所呈现的僵直时间。采用僵直时间百分比来表示小鼠的恐惧反应。行为实验结束后,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠。2组各取3只小鼠迅速开胸暴露心脏,将灌注针自心尖插入左心室,使用4℃预冷的40 g·L^(-1)多聚甲醛(pH=7.4)进行灌注,至小鼠全身不自主抽动消失、全身肢体僵硬为止,取脑组织,多聚甲醛溶液固定,置于蔗糖溶液进行沉糖,然后用组织包埋剂包埋,采用免疫组织化学染色法检测2组小鼠海马中小胶质细胞数量。2组其余小鼠迅速断头取脑组织,冰上分离两侧海马组织,采用Western blot法检测小鼠海马组织中磷酸化溴结构域蛋白4(pBRD4)、消皮素D(GSDMD)、混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)蛋白表达。结果在场景性恐惧条件化训练阶段,2组小鼠的僵直时间百分比均随足底电击次数的增加而升高(P<0.05),但2组小鼠第1、2、3、4、5次电击后的僵直时间百分比比较差异无统计学意义(P>0.05)。在唤起阶段,2组小鼠的僵直时间百分比比较差异无统计学意义(P>0.05)。在记忆检测阶段,实验组小鼠的僵直时间百分比显著低于对照组(P<0.05)。实验组小鼠海马CA1、CA3和DG区小胶质细胞数量均显著低于对照组(P<0.05)。实验组小鼠海马组织中pBRD4、GSDMD和MLKL蛋白相对表达量显著低于对照组(P<0.05)。结论小胶质细胞抑制剂Pexidartinib能够损伤遥远场景性恐惧记忆的再巩固,其作用机制可能与其抑制小胶质细胞的激活及下调pBRD4、GSDMD和MLKL的表达有关。

四磨汤调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路对功能性消化不良大鼠十二指肠微炎症的影响

目的探讨四磨汤对功能性消化不良(FD)大鼠十二指肠微炎症及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/胱天蛋白酶1(Caspase-1)/消皮素D(GSDMD)信号通路的影响。方法用多因素方法建立FD模型。将SD大鼠随机分成正常组、模型组(FD模型)、阳性对照组(灌胃给药0.305 mg·kg^(-1)莫沙必利)和高、中、低剂量实验组(分别灌胃给药5.62、2.81、1.40 g·kg^(-1)四磨汤)。测定小肠推进率、胃排空率;用酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定血清中白细胞介素(IL)-1β、IL^(-1)8水平;用蛋白质印迹法检测十二指肠组织NLRP3、GSDMD的蛋白表达情况。结果正常组、模型组、阳性对照组和高、中、低剂量实验组胃排空率分别为(58.34±5.72)%、(29.16±8.37)%、(48.77±6.10)%、(48.35±6.04)%、(48.20±3.49)%和(39.24±4.20)%;小肠推进率分别为(82.01±7.55)%、(41.95±9.53)%、(64.61±10.18)%、(75.04±9.76)%、(60.58±7.13)%和(45.89±7.40)%;血清IL^(-1)β水平分别为(12.86±0.88)、(43.73±4.60)、(18.84±0.86)、(24.61±1.57)、(19.14±0.77)和(29.04±0.72)pg·mL^(-1);IL^(-1)8水平分别为(95.00±3.74)、(170.60±8.78)、(108.50±3.05)、(118.90±3.45)、(99.90±8.70)和(141.00±3.71)pg·mL^(-1);NLRP3蛋白表达水平分别为0.32±0.02、0.84±0.05、0.42±0.03、0.48±0.02、0.61±0.04和0.62±0.05;GSDMD蛋白表达水平分别为0.34±0.05、0.93±0.06、0.35±0.03、0.52±0.02、0.53±0.06和0.55±0.05。模型组上述指标与正常组比较,高剂量实验组、阳性对照组上述指标与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结论四磨汤能够有效改善FD大鼠一般状况及十二指肠微炎症,其机制可能与抑制十二指肠NLRP3/Caspase-l/GSDMD信号通路有关。

艾司洛尔通过阻断NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路抑制早期脓毒症大鼠心脏炎症反应及焦亡

目的研究艾司洛尔(Esmolol,ES)是否可通过抑制焦亡的经典通路进而发挥心脏保护作用。方法 72只大鼠随机分为假手术(sham operation,Sham)组、盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)组和ES组,每组24只。每组随机抽取8只大鼠观察生存情况,剩余16只大鼠根据处理时间分为6 h和24 h两个亚组,每组8只。Sham组仅给予开腹,翻动盲肠处理;CLP组和ES组采用CLP法建立脓毒症大鼠模型。Sham组、CLP组持续经大鼠左颈内静脉泵入生理盐水6 h;ES组持续泵入艾司洛尔稀释液6 h。分别于相应时间点处死大鼠,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清IL-1β、IL-18水平,采用免疫印迹法(Western blot)检测心肌组织NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表达水平;光学显微镜下观察心肌病理改变;荧光显微镜下观察心肌细胞焦亡情况。结果 (1)ELISA结果显示,与各时间点的Sham组比较,ES组大鼠血清IL-1β及IL-18水平均明显升高,24 h组最高;而与CLP组比较,上述因子水平在6 h与24 h均明显下降(P <0.05)。(2)Western blot结果显示,术后各时间点,大鼠心肌组织中焦亡经典通路相关蛋白[NOD样受体蛋白3(nucleotide-binding domain(NOD)-like receptor protein 3,NLRP3)、天冬氨酸蛋白水解酶-1 (cysteinyl aspartate-specific proteases-1,Caspase-1)、消皮素D(Gasdermin D,GSDMD)]在CLP组均显示出高表达状态,较Sham组明显升高(P <0.05),24 h组表达量最高,而ES组各时间点上述蛋白表达水平均较CLP组有所减少,且差异统计学意义(P <0.05)。(3)病理结果显示,Sham组大鼠心肌组织可见轻微的病理损伤,CLP组心肌细胞损伤最重,ES组大鼠的心肌细胞破坏较CLP组减轻程度多,各组24 h损伤程度均较6 h重。(4)24 h Tunel与DAPI染色显示,与Sham组可见的少量阳性细胞比较,CLP组可见大量被染色的阳性细胞,且差异有统计学意义(P <0.05);而与CLP组比较,ES组心肌细胞阳性染色数量明显减少(P <0.05)。(5) 7 d生存分析显示,CLP组大鼠死亡率最高,ES组大鼠生存天数较CLP组明显延长,差异有统计学意义(P <0.01)。结论 ES能减轻心肌损伤,提高脓毒症大鼠生存率,其机制可能与抑制焦亡经典通路中NLRP3/Caspase-1/GSDMD蛋白表达及减少炎症因子释放有关。

血红素激活含pyrin结构域NOD样受体家族蛋白3(NLRP3)炎性体诱导肾小管上皮细胞焦亡

目的研究血红素是否通过活化肾小管上皮细胞含pyrin结构域NOD样受体家族蛋白3(NLRP3)炎性体引起焦亡而损伤肾脏功能。方法使用血红素处理人肾小管上皮HK-2细胞,通过扫描电镜观察细胞膜上是否有穿孔,免疫荧光染色检测焦亡执行蛋白消皮素D氨基端蛋白(GSDMD-N)的形成情况,明确血红素是否引起人肾小管上皮HK-2细胞焦亡。通过Western blot法检测NLRP3炎性体相关蛋白分子NLRP3、含胱天蛋白酶募集结构域凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶l前体(pro-caspase-1)和剪切体(caspase-1 p20)、白细胞介素1β前体(pro-IL-1β)和IL-1β等确定血红素是否引起人肾小管上皮HK-2细胞中NLRP3炎性体的活化;通过异体输血构建小鼠溶血模型在动物水平进一步验证溶血释放的血红素是否活化NLRP3炎性体而导致肾损伤。采集静脉血进行血涂片进行Wright-Giemsa染色光镜观察,分光光度计比色法检测游离血红蛋白;全自动生化分析仪检测血清尿素氮以及HE染色观察肾组织病变情况确定溶血模型建立是否成功;分离提取溶血小鼠肾小管上皮细胞,Western blot法检测NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 p20、pro-IL-1β、IL-1β、GSDMD-N蛋白表达情况明确溶血模型中NLRP3炎性体的活化情况以及焦亡执行蛋白的表达。结果血红素造成肾小管上皮HK-2细胞损伤,细胞膜上出现小孔,焦亡执行蛋白GSDMD-N表达增高,HK-2细胞中NLRP3炎性体相关蛋白caspase-1 p20、IL-1β表达上调;溶血模型小鼠的肾脏功能受损,小鼠肾小管上皮细胞中NLRP3炎性体相关蛋白caspase-1 p20、IL-1β、GSDMD-N表达上调。结论血红素活化肾小管上皮细胞的NLRP3炎性体,诱导焦亡,进而导致肾功能损伤。

基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路探讨补中益气汤干预NOD.H-2^(h4)小鼠AIT细胞焦亡的机制

目的:基于NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)/胱天蛋白酶-1(Caspase-1)/消皮素D(GSDMD)通路探讨补中益气汤对自身免疫性甲状腺炎(AIT)小鼠细胞焦亡的作用机制。方法:60只NOD.H-2h4小鼠分为正常组、模型组、补中益气汤低、中、高剂量(4.10、8.19、16.38 g·kg^(-1))组和硒酵母片(0.26 mg·kg^(-1))组,每组10只。除正常组外,其余各组均给予0.05%碘化钠(NaI)灌胃8周造模,继续给药干预8周。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)、甲状腺球蛋白抗体(Tg Ab)水平;苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠甲状腺组织病理学改变;免疫组化法检测甲状腺组织中NLRP3、Caspase-1、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测甲状腺组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测甲状腺组织中细胞焦亡相关蛋白水平。结果:与正常组比较,模型组小鼠血清TPO-Ab、Tg Ab水平显著升高(P<0.01),甲状腺滤泡或增大呈立方状,或破坏萎缩,滤泡周围可见大量淋巴细胞浸润;与模型组比较,给药组TPO-Ab、Tg Ab水平显著降低(P<0.01),滤泡形态结构有所改善,淋巴细胞浸润程度有所减轻,其中补中益气汤中剂量组降低和改善效果最为明显。与正常组比较,模型组小鼠甲状腺组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白阳性产物和mRNA表达显著增加(P<0.01),NLRP3、剪切的(cleaved) Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD-N蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,给药组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白阳性产物和mRNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01),其中补中益气汤中剂量组降低效果最为明显,给药组NLRP3、cleaved Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD-N蛋白表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论:补中益气汤可改善AIT,其机制可能是通过调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路抑制细胞焦亡实现的。

细胞焦亡与糖尿病肾病关系的研究进展

糖尿病肾病(DN)目前被认为是免疫参与的慢性炎症性疾病,炎症反应贯穿于DN的始终。而细胞焦亡作为一种炎症细胞死亡方式同样参与DN的发生发展过程,其通过破坏肾脏固有细胞加重肾脏纤维化、肾小球硬化和肾小管损伤等,促进疾病进展,是重要的发病机制之一。DN细胞焦亡受到炎症、氧化应激、免疫反应、细胞生存、细胞能量代谢等信号通路的调控,涉及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体的激活以及消皮素D、胱天蛋白酶1、白细胞介素(IL)-1β、IL-18等焦亡相关因子的过度表达,对具体信号通路的进一步研究有望为DN的防治提供新的治疗靶点。

细胞焦亡与心房颤动心房结构重构关系的研究进展

心房颤动(AF)是临床工作中最常见的心律失常,发病率随着年龄的增长而增加。目前,全球约有3350万例AF患者,其中中国约占800万例,AF已成为世界性的公共健康问题,为社会和家庭都带来了沉重的经济负担[1]。相关研究表明,AF的发生机制与炎症过程密切相关,炎性因子可引起心肌细胞溶解、变形、纤维化等,进一步导致心肌细胞电生理特性的改变,促进折返的形成[2]。细胞焦亡是具有炎性特质的新型细胞程序性死亡(PCD),活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-1可介导执行蛋白消皮素D使质膜形成孔隙,释放大量细胞内容物及炎性因子。近年来,关于细胞焦亡介导心房结构重构作用的机制研究逐渐增多,本综述就细胞焦亡与AF心房结构重构关系的研究进展给予阐述。